Nghiên cứu thu nhận chế phẩm vi sinh vật tổng hợp enzym pectinase, cellulase và ứng dụng trong sản xuất cà phê nhân theo phương pháp lên men

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP HCM TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN LÊ HỒNG PHÚ NGHIÊN CỨU THU NHẬN CHẾ PHẨM VI SINH VẬT TỔNG HỢP ENZYME PECTINASE, CELLULASE VÀ ỨNG DỤNG TRONG SẢN XUẤT CÀ PHÊ NHÂN THEO PHƢƠNG PHÁP LÊN MEN LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC TP.HCM - 2012 ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP HCM TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN LÊ HỒNG PHÚ NGHIÊN CỨU THU NHẬN CHẾ PHẨM VI SINH VẬT TỔNG HỢP ENZYME PECTINASE, CELLULASE VÀ ỨNG DỤNG TRONG SẢN XUẤT CÀ PHÊ NHÂN THEO PHƢƠNG PHÁP LÊN MEN Chuyên ngành: Hóa Sinh Mã số: 1.05.10 LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC PGS.TS NGUYỄN ĐỨC LƢỢNG TP HCM – 2012 LỜI CẢM ƠN Chân thành cảm ơn đến thầy: PGS TS NGUYỄN ĐỨC LƢỢNG Ngƣời khơi gợi cho ý tƣởng đề tài ngƣời hƣớng dẫn cho thực đề tài Trân trọng cảm ơn cô PGS TS ĐỒNG THỊ THANH THU PGS TS PHẠM THỊ ÁNH HỒNG giảng viên để suốt đời học hỏi hỗ trợ nhiều mặt tinh thần học thuật Trân trọng cảm ơn TS LÊ PHI NGA giúp đỡ tạo điều kiện cho hoàn thành đề tài Tri ân ba suốt đời tận tụy tiến con, vô cảm ơn mẹ với trái tim nhân hậu nguồn động viên lớn lao Cảm ơn NGUYỄN THỊ KIM CHÂU, ngƣời hết lòng ủng hộ giúp đỡ lớn lao để hoàn thành tốt luận án Cảm ơn tất thành viên nhóm dự án nghiên cứu sản xuất cà phê chất lƣợng cao nhằm mục đích xuất Nguyễn Thảo Nguyên Đỗ Đại Nghĩa Nguyễn Thị Minh Trinh Nguyễn Hữu Thái Ngô Tiến Hiễn Vinh Lê Thị Lệ Phạm Mỹ Vẹn Nguyễn Thị Kim Châu Nguyễn Thị Ngà 10 Cao Hoàng Tấn 11 Nguyễn Văn Hân 12 Nguyễn Thị Bảo Anh 13 Nguyễn Thị Cẩm Vân 14 Võ Ngọc Thanh Đã nỗ lực vƣợt qua nhiều khó khăn hỗ trợ hoàn tất nội dung nghiên cứu luận án Và cuối cho đƣợc cảm ơn Ban chủ nhiệm khoa đồng nghiệp Khoa CNSH ĐH Quốc Tế nơi công tác giúp đỡ tạo điều kiện để hoàn thành luận án Tác giả luận án Lê Hồng Phú I LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan công trình nghiên cứu riêng Các số liệu kết Luận án trung thực chưa công bố công trình khác Tác giả Luận án II MỤC LỤC Lời cam đoan I Mục lục II Danh mục ký hiệu, chữ viết tắt VI Danh mục bảng VII Danh mục hình IX MỞ ĐẦU CHƢƠNG 1- TỔNG QUAN 1.1 GIỚI THIỆU CHUNG VỀ CÀ PHÊ 1.1.1 Sơ lƣợc lịch sử phát triển cà phê Việt Nam 1.1.2 Giá trị kinh tế cà phê 1.1.3 Tình hình sản xuất cà phê 1.1.4 Tầm quan trọng ngành chế biến cà phê Việt Nam 1.1.5 Những vấn đề kỹ thuật cần nghiên cứu chế biến cà phê 1.2 TRÁI CÀ PHÊ 10 1.2.1 Cấu tạo trái cà phê 10 1.2 Thành phần hóa học 11 1.2.2.1 Thành phần hóa học vỏ 11 1.2.2.2 Thành phần hóa học lớp nhớt 12 1.3 NHÂN CÀ PHÊ 12 1.3.1 Thành phần hóa học nhân cà phê 12 1.3.1.1 Carbohydrates 13 1.3.1.2 Hợp chất chứa nitơ 14 1.3.1.3 Acid chlorogenic 17 1.3.1.4 Hương thơm cà phê 18 1.3.1.5 Acid carboxylic 19 1.3.1.6 Các chất khoáng 20 1.3.2 Tính chất vật lý 20 1.4 PECTIN 21 1.4.1 Cấu tạo pectin 21 1.4.2 Tính chất pectin 22 1.4.2.1 Tính chất làm đông đặc 22 1.4.2.2 Tính tạo gel pectin 22 1.4.2.3 Tính nhớt dung dịch pectin 22 1.4.2.4 Pectin trái cà phê 23 1.4.3 Ứng dụng 23 1.5 CELLULOSE 23 1.5.1 Cấu tạo 23 1.5.2 Tính chất 24 1.5.3 Ứng dụng 25 1.5.4 Cellulose trái cà phê 25 1.6 GIỚI THIỆU CHUNG ENZYME PECTINASE VÀ CELLULASE 25 III 1.6.1 Pectinase 26 1.6.1.1 Phân loại chế tác động 26 1.6.1.2 Ứng dụng 27 1.6.1.3 Hệ vi sinh vật có khả tổng hợp enzyme pectinase 27 1.6.2 Cellulase 27 1.6.2.1 Phân loại chế tác dụng 27 1.6.2.2 Ứng dụng 29 1.6.2.3 Hệ vi sinh vật có khả tổng hợp enzyme cellulase 30 1.7 GIỚI THIỆU VI SINH VẬT SINH PECTINASE VÀ CELLULASE ĐƢỢC NGHIÊN CỨU TRONG LUẬN ÁN VÀ PHƢƠNG PHÁP ĐỊNH DANH VSV 30 1.7.1 Tổng quan chung vi sinh vật 30 1.7.2 Phƣơng pháp định danh vi sinh vật 31 1.8 CƠ SỞ KHOA HỌC CỦA VIỆC TÁCH VỎ VÀ LÊN MEN CÀ PHÊ 32 1.8.1 Giới thiệu tách vỏ cà phê 32 1.8.1.1 Sơ lược nghiên cứu tách vỏ cà phê giới 32 1.8.1.2 Sơ lược nghiên cứu tách vỏ cà phê nước 32 1.8.2 Giới thiệu lên men cà phê 33 1.8.2.1 Sơ lược lên men cà phê giới 34 1.8.2.2 Sơ lược lên men cà phê nước 38 1.8.3 Tăng suất tách vỏ lớp nhớt cà phê tƣơi 39 1.8.4 Nâng cao hiệu suất trích ly cà phê bột 39 1.8.5 Cải thiện chất lƣợng cảm quan cà phê 39 CHƢƠNG - VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 41 2.1 VẬT LIỆU 41 2.1.1 Nhân cà phê 41 2.1.1.1 Giống 41 2.1.1.2 Nguồn gốc 41 2.1.2 Nguồn vi sinh vật nghiên cứu 41 2.1.2.1 Nấm sợi 41 2.1.2.2 Nấm men 41 2.1.2.3 Vi khuẩn 41 2.1.3 Môi trƣờng sử dụng 41 2.1.3.1 Môi trường phân lập nuôi cấy nấm sợi, nấm men vi khuẩn 41 2.1.3.1 Môi trường phân lập nuôi cấy nấm sợi, nấm men vi khuẩn 41 2.1.3.2 Môi trường nhân giống 42 2.1.3.3 Môi trường giữ giống 42 2.1.4 Hóa chất 42 2.1.4.1 Hóa chất sử dụng cho môi trường 42 2.1.4.2 Hóa chất sử dụng cho phương pháp xác định hoạt tính enzyme 42 2.1.4.3 Hóa chất sử dụng cho phương pháp xác định thành phần 43 2.1.5 Thiết bị - dụng cụ 43 2.2 PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 44 2.2.1 Phƣơng pháp vi sinh vật 44 IV 2.2.1.1 Phương pháp phân lập giống vi sinh vật từ nhân cà phê 44 2.2.1.2 Phương pháp cấy chuyền giữ giống (trong điều kiện vô trùng) 44 2.2.1.3 Phương pháp nhân giống 44 2.2.1.4 Phương pháp lên men 44 2.2.1.5 Phương pháp đếm tế bào vi sinh vật chế phẩm 45 2.2.2 Phƣơng pháp hóa lý 45 2.2.2.1 Phương pháp xác định độ ẩm 45 2.2.2.2 Phương pháp trích chất hòa tan 46 2.2.2.3 Phương pháp nghiền 46 2.2.2.4 Phương pháp rây 46 2.2.2.5 Phương pháp ngâm 46 2.2.3 Phƣơng pháp hóa sinh 47 2.2.3.1 Các phương pháp xác định hoạt tính enzyme cellulase, pectinase 47 2.2.3.2 Các phương pháp xác định thành phần chủ yếu cà phê 52 2.2.4 Phƣơng pháp định danh vi sinh vật 60 2.2.4.1 Phương pháp định danh nấm sợi 60 2.2.4.2 Phương pháp định danh vi khuẩn nấm men 61 2.2.5 Cách bố trí thí nghiệm 62 Thí nghiệm 1: Khảo sát thành phần pectin cellulose lớp nhớt thành phần hóa học chủ yếu nhân cà phê 65 Thí nghiệm 2: Phân lập định danh chủng vi sinh vật từ vỏ, nhân cà phê 65 Thí nghiệm 3: Nghiên cứu tạo chế phẩm vi sinh vật có hoạt tính pectinase cellulase 66 Thí nghiệm 4: Nghiên cứu trình tách vỏ cà phê 71 Thí nghiệm 5: Nghiên cứu ứng dụng chế phẩm lên men nhằm nâng cao hiệu suất trích chất hòa tan chất lượng cà phê 73 Thí nghiệm 6: Lên men cà phê theo cách kết hợp chế phẩm 75 Thí nghiệm 7: Kiểm tra độc tố aflatoxin, hàm lượng caffeine phẩm 75 Thí nghiệm 8: Đánh giá cảm quan 76 Thí nghiệm 9: Thử nghiệm lên men kết hợp chế phẩm tốt từ nấm sợi, nấm men vi khuẩn 76 2.2.6 Phƣơng pháp đánh giá cảm quan 76 2.2.7 Phƣơng pháp xử lý số liệu 79 CHƢƠNG - KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN .80 3.1 THÀNH PHẦN HÓA HỌC CHỦ YẾU CÓ TRONG CÀ PHÊ 80 3.1.1 Thành phần pectin cellulose lớp nhớt 80 3.1.2 Thành phần hóa học chủ yếu có nhân cà phê 80 3.2 PHÂN LẬP VÀ ĐỊNH DANH CÁC CHỦNG VI SINH VẬT 82 3.2.1 Phân lập định danh chủng nấm sợi vỏ, nhân cà phê 82 3.2.2 Phân lập định danh chủng nấm men vi khuẩn vỏ, nhân cà phê 86 3.3 NGHIÊN CỨU TẠO CÁC CHẾ PHẨM VSV 89 V 3.3.1 Nghiên cứu điều kiện tạo chế phẩm có hoạt tính pectinase cao 89 3.3.1.1 Xác định môi trường tối ưu cho sinh tổng hợp enzyme pectinase 89 3.3.1.2 Xác định độ ẩm tối ưu cho sinh tổng hợp enzyme pectinase 94 3.3.1.3 Xác định thời gian tối ưu cho sinh tổng hợp enzyme pectinase chủng nấm sợi 96 3.3.1.4 Xác định nồng độ đường ( oBrix ) dung dịch malt đến sinh tổng hợp enzyme pectinase 101 3.3.1.5 Xác định pH ban đầu dung dịch malt đến khả sinh tổng hợp enzyme pectinase 103 43.3.1.6 Ảnh hưởng lượng muối (NH4)2SO4 bổ sung đến khả sinh tổng hợp enzyme pectinase 105 3.3.1.7 Xác định nhiệt độ nuôi đến khả sinh tổng hợp enzyme pectinase 107 3.3.1.8 Tổng kết quy trình tạo chế phẩm có hoạt tính pectinase cao 109 3.3.2 Nghiên cứu điều kiện tạo chế phẩm có hoạt tính cellulase cao 110 3.3.2.1 Xác định môi trường tối ưu cho sinh tổng hợp enzyme cellulase 110 3.3.2.2 Xác định độ ẩm tối ưu cho sinh tổng hợp enzyme cellulase 114 3.3.2.3 Xác định ảnh hưởng thời gian nuôi đến trình sinh tổng hợp cellulase chủng vi sinh vật 116 3.3.2.4 Tổng kết quy trình tạo chế phẩm có hoạt tính cellulase cao 120 3.4 KHẢO SÁT CHẤT LƢỢNG CHẾ PHẨM THEO THỜI GIAN BẢO QUẢN 121 3.4.1 Số lƣợng tế bào vsv thay đổi theo thời gian bảo quản 122 3.4.2 Khảo sát hoạt tính enzyme pectinase thay đổi theo thời gian bảo quản 123 3.4.3 Khảo sát hoạt tính enzyme cellulase thay đổi theo thời gian bảo quản 124 3.4.4 Tổng kết khảo sát chất lƣợng chế phẩm theo thời gian bảo quản sơ hạch toán kinh tế 125 3.5 NGHIÊN CỨU QUÁ TRÌNH TÁCH VỎ CÀ PHÊ 125 3.5.1 Khảo sát ảnh hƣởng lƣợng chế phẩm vsv đến khả tách vỏ cà phê tƣơi 126 3.5.2 Khảo sát ảnh hƣởng thời gian xử lý đến khả tách vỏ cà phê tƣơi 128 3.5.3 Tổng kết nghiên cứu trình tách vỏ cà phê công nghệ tách vỏ cà phê 129 3.6 KẾT QUẢ QUÁ TRÌNH LÊN MEN 129 3.6.1 Ảnh hƣởng thời gian ngâm độ ẩm cà phê 130 3.6.2 Ảnh hƣởng độ ẩm cà phê đến khả chiết chất hòa tan nhân cà phê 130 3.6.2.1 Ảnh hưởng độ ẩm cà phê đến khả chiết chất hòa tan Coffea arabica 131 3.6.2.2 Ảnh hưởng độ ẩm cà phê đến khả chiết chất hòa tan Coffea robusta 131 3.6.2.3 Ảnh hưởng độ ẩm cà phê đến khả chiết chất hòa tan Coffea chari 132 3.6.3 Ảnh hƣởng lƣợng chế phẩm vsv đến khả chiết chất hòa tan nhân cà phê 133 VI 3.6.3.1 Ảnh hưởng lượng chế phẩm vsv đến khả chiết chất hòa tan Coffea arabica 133 3.6.3.2 Ảnh hưởng lượng chế phẩm vsv đến khả chiết chất hòa tan Coffea robusta 135 3.6.3.3 Ảnh hưởng lượng chế phẩm vsv đến khả chiết chất hòa tan Coffea chari 137 3.6.4 Ảnh hƣởng thời gian lên men đến khả chiết chất hòa tan nhân cà phê 139 3.6.4.1 Ảnh hưởng thời gian lên men đến khả chiết chất hòa tan Coffea C arabica CPVSV từ nấm sợi 139 3.6.4.2 Ảnh hưởng thời gian lên men đến khả chiết chất hòa tan Coffea C C robusta CPVSV từ nấm sợi 141 3.6.4.3 Ảnh hưởng thời gian lên men đến khả chiết chất hòa tan Coffea chari CPVSV từ nấm sợi 143 3.6.5 Tổng kết nghiên cứu lên men nhân cà phê quy trình lên men 145 3.6.6 Nghiên cứu đánh giá cảm quan cà phê 145 3.6.6.1 Đánh giá cảm quan cà phê C arabica 146 3.6.6.2 Đánh giá cảm quan cà phê C robusta 147 3.6.6.3 Đánh giá cảm quan cà phê C chari 147 3.6.7 Thử nghiệm lên men kết hợp chế phẩm tốt từ nấm sợi, nấm men vi khuẩn 148 3.6.7.1 Khảo sát nồng độ chất tan lên men kết hợp 149 3.6.7.2 Khảo sát hàm lượng caffeine giải phóng lên men kết hợp 151 3.6.8 Quy trình tách vỏ lên men cà phê chế phẩm 153 3.6.8.1 Quy trình tách vỏ chế phẩm vsv 153 3.6.8.2 Quy trình lên men cà phê chế phẩm vsv 154 CHƢƠNG - KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 157 DANH MỤC CÔNG TRÌNH .159 TÀI LIỆU THAM KHẢO 161 PHỤ LỤC 170 VII DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT Chữ tắt Chữ nguyên Ý nghĩa C arabica C chari C robusta CMC Coffea arabica Coffea chari Coffea robusta Carboxymethylcellulose Chế phẩm vi sinh vật Caffeoxyl quinic acid Cà phê chè Cà phê mít Cà phê vối Một dẫn xuất cellulose CPVSV CQA CT DNS ĐC MT NL PGA PTN TCVN TN vsv Chế phẩm vi sinh vật Hợp chất thơm cà phê Canh trƣờng Canh trƣờng 3,5 - dinitrosalicylic acid Một chất thử cho xác định đƣờng khử Đối chứng Đối chứng Môi trƣờng Môi trƣờng Nguyên liệu Nguyên liệu Potato glucose agar Môi trƣờng giữ giống gồm khoai tây, glucose thạch Phòng thí nghiệm Phòng thí nghiệm Tiêu chuẩn Việt Nam Tiêu chuẩn Việt Nam Thí nghiệm Thí nghiệm Vi sinh vật Vi sinh vật