Phân lập các chủng vi sinh vật chuyển hóa nitơ, tạo biofilm và ứng dụng trong xử lí nước thải chăn nuôi

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - - Vũ Thị Huế PHÂN LẬP CÁC CHỦNG VI SINH VẬT CHUYỂN HOÁ NITƠ, TẠO BIOFILM VÀ ỨNG DỤNG TRONG XỬ LÝ NƢỚC THẢI CHĂN NUÔI LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội, 2017 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - - Vũ Thị Huế PHÂN LẬP CÁC CHỦNG VI SINH VẬT CHUYỂN HOÁ NITƠ, TẠO BIOFILM VÀ ỨNG DỤNG TRONG XỬ LÝ NƢỚC THẢI CHĂN NUÔI Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 60 42 01 14 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS NGUYỄN QUANG HUY Hà Nội, 2017 LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên, tơi xin bày tỏ lòng kính trọng biết ơn sâu sắc đến PGS.TS Nguyễn Quang Huy, ngƣời thầy tận tình hƣớng dẫn, dành nhiều thời gian trao đổi, định hƣớng nghiên cứu tạo điều kiện tốt cho tơi suốt q trình học tập, nghiên cứu khoa học thực luận văn Tôi xin chân thành cảm ơn đến tồn thể q thầy, Bộ mơn Sinh lý thực vật Hóa sinh nhƣ Thầy cô giáo khoa Sinh học, Trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên truyền đạt cho kiến thức quý báu suốt thời gian học tập nghiên cứu Tôi xin chân thành cảm ơn Ban Giám hiệu, Ban Lãnh đạo Khoa Sinh học, Phòng Sau Đại học, Trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên gi p đ tạo điều kiện cho tơi hồn thành chƣơng trình học tập thực luận văn Cuối cùng, xin chân thành bày tỏ lòng biết ơn tới gia đình, ngƣời thân bạn b , ngƣời động viên tạo điều kiện thuận l i cho tơi có thời gian học tập, nghiên cứu hoàn thành luận văn Hà Nội, Ngày 28 tháng 11 năm 2017 Học viên Vũ Thị Huế i MỤC LỤC MỞ ĐẦU CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tình trạng ô nhiễm môi trƣờng nƣớc Việt Nam Thế giới .3 1.1.1 Tình hình nhiễm mơi trƣờng nƣớc 1.1.2 Tình hình nhiễm nƣớc thải chăn ni 1.2 Các phƣơng pháp xử lý ô nhiễm nƣớc thải có chứa h p chất nitơ nay.5 1.3 Các vi sinh vật có khả chuyển hóa h p nitrate .8 1.4 Màng sinh học ứng dụng màng sinh học việc xử lý ô nhiễm nƣớc thải giàu nitơ……………………………….…………………………… 11 1.4.1 Màng sinh học 11 1.4.2 Vai trò ứng dụng hình thành màng sinh học 15 CHƢƠNG 2: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21 2.1 Nguyên liệu 21 2.2 Hóa chất, thiết bị 21 2.2.1 Môi trƣờng nuôicấy 21 2.2.2 Thiết bị ngiên cứu 22 2.3 Phƣơng pháp nghiên cứu .22 2.3.1 Phƣơng pháp phân lập vi khuẩn .22 2.3.2 Phƣơng pháp đánh giá khả hình thành biofilm .22 2.3.3 Ảnh hƣởng điều kiện môi trƣờng nuôi cấy lên hình thành màng sinh học 23 2.3.4 Phƣơng pháp nhuộm Gram 24 2.3.5 Phƣơng pháp đánh giá khả chuyển hóa h p chất nitơ 24 2.3.6 Phƣơng pháp phân tích nitơ tổng số 25 2.3.7 Phƣơng pháp phân tích hàm lƣ ng amoni (NH4+) 25 2.3.8 Phƣơng pháp thử khả chuyển hóa nitrite 26 ii 2.3.9 Phƣơng pháp phân loại vi sinh vật dựa gen 16S rRNA 27 2.3.10 Phƣơng pháp thống kê sinh học 27 CHƢƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 28 3.1 Vi khuẩn oxi hóa amoni 28 3.1.1 Phân lập, tuyển chọn vi khuẩn oxi hóa amoni 28 3.1.2 Khả tạo màng vi sinh vật 29 3.2 Vi khuẩn oxi hóa nitrite 30 3.2.1 Phân lập, tuyển chọn vi khuẩn oxi hóa nitrite 30 3.2.2 Khả tạo màng vi sinh vật 31 3.3 Vi khuẩn phản nitrat hóa 33 3.3.1 Phân lập vi khuẩn phản nitrat hóa………………………………… 33 3.3.2 Xác định khả phản nitrat hóa chủng phân lập đƣ c… 33 3.3.3 Xác định hoạt tính khử nitrat chủng tuyển chọn 33 3.4 Nghiên cứu khả sinh trƣởng, tạo biofilm hoạt tính chuyển hố ni tơ chủng tuyển chọn kết h p với vật liệu mang .35 3.4.1 Hoạt tính oxi hóa amoni vi khuẩn có vật liệu mang … 36 3.4.2 Hoạt tính oxi hóa nitrite vi khuẩn có vật liệu mang ….… 37 3.4.3 Ảnh hƣởng nhiệt độ 38 3.4.4 Ảnh hƣởng pH môi trƣờng 40 3.4.5 Ảnh hƣởng nồng độ amoni nitrit đến sinh trƣởng chủng vi khuẩn nitrate hóa tuyển chọn 43 3.5 Kết giải trình tự gen 16S rRNA chủng phân lập 45 KẾT LUẬN 48 TÀI LIỆU THAM KHẢO 49 iii DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Chu trình nitơ tự nhiên Hình 1.2 Các giai đoạn q trình hình thành biofilm 13 Hình 3.1 Khả tạo màng sinh vật chủng vi khuẩn oxi hóa amoni 30 Hình 3.2 Khả tạo màng sinh vật chủng vi khuẩn oxi hóa nitrite 32 Hình 3.3 Khả tạo màng sinh vật chủng vi khuẩn khử nitrate 35 Hình 3.4 Hình ảnh tập đồn vi sinh BNII-10 vật liệu mang polyurethane 37 Hình 3.5 Ảnh hƣởng nhiệt độ tới hoạt tính nitrate hóa vi khuẩn ………39 Hình 3.6 Khả tạo màng vi sinh vật chủng BNI-8 40 Hình 3.7 Khả tạo màng vi sinh vật chủng BNII-9 40 Hình 3.8 Ảnh hƣởng pH tới chủng BNI-8 BNII-9 41 Hình 3.9 Ảnh hƣởng pH đến khả tạo màng sinh trƣởng 41 Hình 3.10 Ảnh hƣởng pH đến khả tạo màng biofilm chủng BNI-8 41 Hình 3.11 Ảnh hƣởng pH đến khả tạo màng biofilm chủng BNII-9.42 Hình 3.12 Ảnh hƣởng amoni, nitrit đến sinh trƣởng chủng vi khuẩn 44 H nh 3.13 Cây phát sinh chủng loại chủng phân lập BNI-8, BNI-9, BNII-9 BNII-10 dựa trình tự gen mã hóa 16S RNAr 46 iv DANH MỤC BẢNG Bảng 3.1 Khả oxi hóa amoni nhóm vi khuẩn oxi hóa amoni 28 Bảng 3.2 Khả tạo màng biofilm chủng vi khuẩn oxi hóa amoni 29 Bảng 3.3 Khả oxi hóa nitrite nhóm vi khuẩn oxi hóa nitrite 31 Bảng 3.4.Khả tạo màng sinh vật chủng vi khuẩn lựa chọn 32 Bảng 3.5 Khả sinh khí chủng phân lập ………………………… 33 Bảng 3.6 Biến động hàm lƣ ng N-NO3 N-NO2 môi trƣờng nuôi vi khuẩn .34 Bảng 3.7 Khả tạo màng sinh học chủng nghiên cứu .35 Bảng 3.8 Ảnh hƣởng chất mang đến khả oxi hóa amoni vi khuẩn 36 Bảng 3.9 Ảnh hƣởng chất mang tới khả oxi hóa nitrite chủng 38 v MỞ ĐẦU Ô nhiễm nƣớc thải mức báo động Ô nhiễm nƣớc thay đổi theo chiều xấu tính chất vật lý – hố học– sinh học nƣớc, với xuất chất lạ thể lỏng, rắn làm cho nguồn nƣớc trở nên độc hại với ngƣời sinh vật Xét tốc độ lan truyền quy mơ ảnh hƣởng nhiễm nƣớc vấn đề đáng lo ngại ô nhiễm đất Xử lý nƣớc thải trƣớc hết nhằm mục đích cải thiện điều kiện vệ sinh môi trƣờng sống ngƣời xa nhằm trì cân sinh thái, tạo điều kiện phát triển bền vững lâu dài cho lồi ngƣời Thành phần gây nhiễm nƣớc thải, xét khía cạnh tác động gây hại giải pháp cơng nghệ xử lý, chia thành ba nhóm chính: nhóm chất hữu có khả sinh hủy, nhóm có thành phần dinh dƣ ng nhóm loại h p chất hóa học nguy hiểm việc xử lý nhiễm từ nhóm thành phần dinh dƣ ng đƣ c quan tâm Thành phần dinh dƣ ng gây ô nhiễm hầu hết h p chất nitơ Sự thâm nhập h p chất vào nƣớc gây tƣ ng ph dƣ ng, th c đẩy tảo loại thủy thực vật phát triển mạnh khó kiểm sốt mật độ Hiện tƣ ng bùng nổ tảo dẫn đến tảo chết hàng loạt thời gian ngắn, chìm xuống đáy, tiếp tục bị phân hủy tình trạng yếm khí thay đổi điều kiện sống (pH, oxi hồ tan) tác nhân gây khó khăn, chí mơi trƣờng khơng thể sống nhiều loài thuỷ, động vật Nhiều giải pháp kỹ thuật đƣ c sử dụng để xử lý nƣớc thải đƣ c sử dụng điều kiện khác Mỗi giải pháp kỹ thuật có ƣu, nhƣ c điểm riêng Hiện việc xử lý nƣớc thải nói chung nƣớc thải ni tơ nói riêng theo hƣớng áp dụng kỹ thuật sinh học đƣ c ch trọng phát triển ch ng có tính bền vững, thích nghi với nhiều điều kiện tự nhiên, đáp ứng đƣ c mục tiêu bảo vệ nguồn nƣớc, tiết kiệm lƣ ng, hóa chất vừa thu nhận tiết kiệm đƣ c nguồn tài nguyên, phù h p với phƣơng pháp luận “công nghệ xanh” Nƣớc thải chăn ni loại nƣớc thải có hàm lƣ ng h p chất ni tơ cao Việc áp dụng phƣơng pháp xử lý nƣớc thải chăn nuôi đƣờng vi sinh vật góp phần tái sử dụng thu hồi chất dinh dƣ ng từ phế thải Vì vậy, ch ng tơi tiến hành thực đề tài: Nghiên cứu phân lập chủng vi sinh vật chuyển hoá ni tơ, tạo biofilm kết hợp với vật liệu mang xử lý nước thải chăn nuôi Với nội dung nghiên cứu nhƣ sau:  Phân lập lựa chọn chủng vi sinh vật có khả chuyển hóa amoni, nitrite đánh giá hình thành biofilm chủng vi khuẩn kết h p không kết h p với vật liệu mang  Phân lập chủng có khả phản nitrate hóa  Nghiên cứu điều kiện sinh trƣởng chủng vi khuẩn đƣ c lựa chọn  Định danh chủng vi khuẩn đƣ c lựa chọn Mục tiêu nghiên cứu  Phân lập tuyển chọn đƣ c chủng vi sinh vật có khả phân giải nitơ (oxy hóa amoni, nitrite, phản nitrate hóa)  Tối ƣu đƣ c điều kiện ni cấy thích h p đánh giá khả tạo biofilm  Định danh đƣ c chủng vi khuẩn có khả phân giải nitơ đồng thời có khả tạo biofilm Tính nghiên cứu Đã đóng góp phát đƣ c hệ gen vi sinh vật chuyển hóa nitơ, tạo biofilm từ nƣớc thải chăn nuôi Bắc Ninh Đã nghiên cứu đƣ c điều kiện tối ƣu môi trƣờng việc chuyển hóa tạo màng CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 T nh trạng ô nhiễm môi trƣờng nƣớc Việt Nam Thế giới 1.1.1 Ơ nhiễm mơi trƣờng nƣớc Hiện nay, nhiễm môi trƣờng vấn đề đƣ c quan tâm khơng Việt Nam mà nhiều quốc gia giới Nƣớc thải nguyên nhân gây ô nhiễm môi trƣờng Ô nhiễm nguồn nƣớc không ảnh hƣởng đến môi trƣờng sống ngƣời, mà ảnh hƣởng đến đa dạng sinh học, đến môi trƣờng sống loài động, thực vật trái đất Theo báo cáo môi trƣờng Quốc gia năm 2010 Bộ Tài Nguyên Môi Trƣờng, từ năm 2007 đến năm 2009, ô nhiễm môi trƣờng nƣớc mặt tất số vƣ t tiêu chuẩn cho phép theo QCVN 08:2008/BTNMT Các số COD, BOD vƣ t tiêu chuẩn từ đến 10 lần Hàm lƣ ng NH4+ môi trƣờng nƣớc bềmặt sông Nhuệ, sông Đáy sông Cầu vƣ t quy chuẩn cho phép QCVN 08:2008/BTNMT cho nƣớc mặt phù h p với việc bảo tồn động thực vật thủy sinh là 0,2 mg/l Năm 2009, hàm lƣ ng NH4+ nƣớc sông Nhuệ đo Cự Đà 10 mg/l vƣ t tiêu chuẩn 50 lần, sông Đáy đo Cầu Hoàng mg/l vƣ t quátiêu chuẩn 15 lần, sông Cầu đo Thái Nguyên 22 mg/l vƣ t tiêu chuẩn 110 lần [2] Theo Mulder, lƣ ng h p chất nitơ chuỗi thức ăn 15 kg/ngƣời/năm, phần đƣ c ngƣời tiêu thụ, phần lớn đƣ c thải mơi trƣờng Tính theo đầu ngƣời, ngƣời thải 4,75 kg nitơ năm Lƣ ng nitơ nƣớc thải chiếm 30% lƣ ng nitơ tiêu thụ [41] Nƣớc thải đô thị chủ yếu dạng nitơ hữu amoni, 60% dạng hữu 40% trạng thái amoni Ở Mỹ, hàm lƣ ng nitơ có nƣớc thải phụ thuộc vào số dân lƣu lƣ ng nƣớc thải ngày Lƣ ng nitơ thải vào nguồn nƣớc trung bình 16g/ngƣời/ngày Hàm lƣ ng loại h p chất chứa nitơ thay đổi loại nƣớc thải khác Hàm lƣ ng nitơ nƣớc thải thƣờng dao động khoảng 20 đến 85 mg/l nitơ dạng h p chất hữu trung bình từ đến 35 mg/l, hàm lƣ ng N-NH3 từ 12 đến 50 mg/l [26] A 4.5 CN(mg/l) 3.5 2.5 1.5 0.5 0 10 N-NH4 lại mg/l 15 20 25 30 35 40 Nhiệt độ (oC) N-NO2 tạo thành (mg/l) B 4.5 CN (mg/l) 3.5 2.5 1.5 0.5 0 10 N-NO2 lại (mg/l) 15 20 25 30 35 40 N-NO3 tạo thành (mg/l) Nhiệt độ (oC) Hình 3.5 Ảnh hƣởng nhiệt độ tới hoạt tính nitrate hóa vi khuẩn A Chủng BNI-8; B Chủng BNII-9 Kết hình 3.5 cho thấy hai chủng đại diện BNI-8 BNII-9 có hoạt tính khoảng nhiệt độ từ 20 đến 30oC Tại nhiệt độ lƣ ng amoni giảm 62,2% (hình 3.5A), nitrite giảm đƣ c 59% (hình 3.5B) Ở nhiệt độ 10oC hay 37oC, hoạt tính nitrate hóa hai chủng vi khuẩn giảm 38 Ngồi việc tìm hiểu hoạt tính nitrate hóa chủng nghiên cứu nhiệt độ khác nhau, khả tạo màng sinh trƣởng chủng phân lập đƣ c nghiên cứu (hình 3.6) ĐC 10oC 20oC 30oC 37oC Hình 3.6 Khả tạo màng vi sinh vật chủng BNI-8 ĐC 10oC 20oC 30oC 37oC Hình 3.7 Khả tạo màng vi sinh vật chủng BNII-9 Kết hình 3.6 3.7 cho thấy, màng biofilm hình thành thành ống eppendorf hai chủng vi khuẩn nghiên cứu có màu đậm trongkhoảng nhiệt độ 20-37oC Kết nghiên cứu ảnh hƣởng nhiệt độ đề tài trùng h p với nghiên cứu trƣớc [20, 24] nghiên cứu nhóm vi khuẩn nitrate hóa có mặt nƣớc ngọt.Nghiên cứu tác giả Việt Nam [32] cho thấy chủng tạo biofilm đất có hoạt tính chuyển hóa amoni thƣờng có khoảng nhiệt độ hoạt động thích h p từ 30 đến 37oC 3.4.4 Ảnh hưởng pH môi trường Một điều kiện khác ảnh hƣởng trực tiếp đến sinh trƣởng, hoạt tính chuyển hóa nitơ khả tạo màng sinh vật vi khuẩn pH môi trƣờng Hai chủng BNI-8 BNII-9 tiếp tục tiến hành nghiên cứu ảnh hƣởng pH đến sinh trƣởng khả tạo biofilm Kết có hình từ hình 3.8 đến hình 3.11 39 A 4.5 CN (mg/l) 3.5 2.5 1.5 0.5 N-NH4 lại (mg/l) N-NO2 tạo thành (mg/l) 10 11 pH Hình 3.8 Ảnh hƣởng pH tới chủng BNI-8 (màu tím) BNII-9 (màu hồng) Tại giá trị pH 7,5 môi trƣờng hai chủng vi khuẩn có khả oxi hóa amoni (chủng BNI-8) hay oxi hóa nitrite (chủng BNII-9) cao (hình 3.6) Tại giá trị pH amoni bị loại khoảng 65% (chủng BNI-8), nitrite bị loại khoảng 72% (chủng BNII-9) Trong môi trƣờng axit (pH pH6) môi trƣờng kiềm (pH pH 10) hoạt tính nitrate hóa vi khuẩn thấp Tại giá trị pH môi trƣờng 7,5 khả tạo màng sinh vật nhƣ sinh trƣởng vi khuẩn nghiên cứu đạt mức cao Ở pH sinh trƣởng tạo biofilm vi khuẩn bắt đầu giảm (hình 3.9) 40 OD A 0.8 0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 pH pH OD 570 pH pH 7.5 pH8 pH pH 10 pH OD 600 OD B 0.8 0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 pH pH pH pH 7.5 pH8 pH pH 10 pH OD 570 OD 600 Hình 3.9 Ảnh hƣởng pH đến khả tạo màng sinh trƣởng A Chủng BNI-8 ĐC pH pH B Chủng BNII-9 pH pH 7,5 pH pH pH 10 Hình 3.10 Ảnh hƣởng pH đến khả tạo màng biofilm chủng BNI-8 41 ĐC pH pH pH pH 7,5 pH pH pH 10 Hình 3.11 Ảnh hƣởng pH đến khả tạo màng biofilm chủng BNII-9 Tại pH kiềm 7,5 vi khuẩn nitrate hóa thích nghi nên có hoạt tính chuyển hóa nitơ tốt đồng thời ch ng sinh trƣởng có khả tạo biofilm tốt điểm pH khác Các số OD570và OD600 hình ảnh mảng bám thành ống eppendorf có màu đậm khẳng định kết thu đƣ c (hình 3.9) Các cơng bố trƣớc [44, 49] cho pH thấp 6,5 8,9 q trình nitrate hóa bị ức chế Theo nghiên cứu Nadell cộng enzym ammonia monooxigenase bị bất hoạt ngừng chuyển hóa amoni pH6 [43] Nghiên cứu [7,10] cho thấy vi khuẩn nitrate hóa sinh trƣởng bình thƣờng pH 7-8, tốc độ sinh trƣởng tối đa nhóm vi khuẩn oxi hóa amoni oxi hóa nitrite pH 3.4.5 Ảnh hưởng nồng độ amoni nitrit đến sinh trưởng chủng vi hu n nitrate h a tu n chọn Kết sau ngày nuôi cấy, chủng vi khuẩn nghiên cứu sinh trƣởng tạo màng sinh học tốt nồng độ nitơ từ 10-100 mgN/l Ở nồng độ amoni 200 mgN/l, vi khuẩn oxi hóa amoni sinh trƣởng nhƣng chậm Ở nồng độ thấp (2 mgN/l), cao (500; 1000 mgN/l), sinh trƣởng nhƣ khả tạo biofilm vi khuẩn bị ức chế.Kết với chủng vi khuẩn oxi hóa nitrit tƣơng tự (hình 3.12) 42 1.4 A 1.2 OD 570 OD 600 0.8 0.6 0.4 0.2 mg/l 1.2 mg/l 10 mg/l OD 570 20 mg/l 100 mg/l 200 mg/l 500 mg/l 1000 mg/l OD 600 B 0.8 0.6 0.4 0.2 mg/l mg/l 10 mg/l 20 mg/l 100 mg/l 200 mg/l 500 mg/l 1000 mg/l Hình 3.12 Ảnh hƣởng amoni hay nitrit đến sinh trƣởng chủng vi khuẩn A.Vi khuẩn oxi hóa amoni (BNI-9); B Vi khuẩn oxi hóa nitrit (BNII-10) Khi nghiên cứu ảnh hƣởng nồng độ chất đến sinh trƣởng chủng vi khuẩn oxi hóa amoni đất nhà nghiên cứu nhận thấy nồng độ amoni từ 20 - 100mg/l ( 1,5 - 7,5 mM) tế bào vi khuẩn oxi hóa amoni sau ngày ni cấy tăng từ 1,3105 đến 66106 tế bào/g đất khô Nồng độ nitơ 43 môi trƣờng ảnh hƣởng mạnh đến khả chuyển hóa nitơ chủng vi khuẩn nghiên cứu [12, 13] Ở nồng độ nitơ cao từ 500 - 1000 mgN/l, hoạt tính nitrat hóa vi khuẩn oxi hóa amoni gần nhƣ khơng Nghiên cứu cho thấy, hoạt tính oxi hóa amoni Nitrosomnas europaea bị bất hoạt lƣ ng nitrit tạo thành môi trƣờng nuôi cấy đạt từ 20 mM (267 mgN/l) trở lên Hoạt tính oxi hóa nitrit chủng vi khuẩn thuộc chi Nitrobacter bị ức chế hàm lƣ ng nitrat hình thành mơi trƣờng đạt 30 - 60mM (khoảng 400-800 mgN/l) Kết nghiên cứu cho thấy, nồng độ amoni hay nitrit thấp ảnh hƣởng đến sinh trƣởng vi khuẩn, môi trƣờng chứa amoni với nồng độ cao (>200 mg/l) sinh trƣởng vi khuẩn thấp, lƣ ng nitrit tạo thành ức chế amonia monooxigenase x c tác phản ứng oxi hóa amoni.Sự kết h p hai nhóm vi khuẩn oxi hóa amoni oxi hóa nitrit tự nhiên l i thế, tránh tích lũy nitrit mơi trƣờng tạo nên yếu tố gây độc [25, 36, 42] 3.5 Kết giải trình tự gen 16S rRNA chủng phân l p Trình tự gen 16S rRNA chủng BNI-8, BNI-9, BNII-9 BNII-10 đƣ c xử lý phần mềm DNA Star BLAST, sau so sánh với trình tự gen mã hóa 16S rRNA chủng vi khuẩn nitrate hóa tuyển chọn Ngân hàng Gen quốc tế Mối quan hệ phát sinh chủng loại chủng vi khuẩn nghiên cứu BNI-8, BNI-9, BNII-9 BNII-10 hình 3.13 Kết hình 3.13 cho thấy hai chủng BNI-8 BNI-9 nằm nhánh thuộc chi Nitrosomonas thuộc β-Proteobacteria So với trình tự gen mã hóa 16S rRNA chủng Nitrosomonas eutropha trình tự gen mã hóa 16S rRNA chủng BNI-8có độ tƣơng đồng 96%; trình tự gen mã hóa 16S rRNA chủng BNI-9 so với loài Nitrosomonas europaea có độ tƣơng đồng 96% Hai chủng BNII-9 BNII-10 nằm hồn tồn nhánh vi khuẩn oxi hóa nitrit thuộc chi Nitrobacter thuộc Gamma Proteobacteria Trình tự gen 16S rRNA chủng BNII-9 BNII-10 so với trình tự gen 16S rRNA lồi Nitrobacter winogradski có độ tƣơng đồng 97% 96%, tƣơng ứng, so với trình tự gen 16S rRNA lồi N vulgaris có độ tƣơng đồng 96% 97%, tƣơng ứng 44 Theo khóa phân loại Bergey 2005, chi Nitrobacter bao gồm lồi điển hình: N winogradski, N alkalicus, N hamburgensis N vulgaris Hai chủng BNII-9 BNII-10 đƣ c phân lập vùng nƣớc ngầm bị nhiễm amoni, nên chủng BNII-9 gần với loài N winogradski BNII-10 gần với loài N vulgaris Nitrosovibrio tenuis M96405 Nitrosospira briensis CNS 18 CDH 19 Nitrosospira multiformis Nitrosomonas nitrosa AF272425 AF272417 Nitrosomonas communis AF287297 Nitrosococcus mobilis AL954747 Nitrosomonas europaea Beta Protobacteria BNI-9PD60 CNSH BNI-8 CN PD58 Nitrosomonas eutropha CP000450 Nitrosomonas oligotropha CNS 21 AF272418 Nitrosomonas marina CNSH HT22 Nitrococcus mobilis Yen27 Nitrosococcus halophilus Minh16 Gamma Protobacteria Nitrosococcus oceani Thu17 5NM-Cuc BNII-10 2NM-Cuc BNII-9 Nitrobacter hamburgensis Uye24 Nitrobacter vulgaris Lie25 Alpha Protobacteria Nitrobacter winogradskyi Ha23 Nitrobacter alkalicus Nhi26 Yen28 Nitrospina gracilis Delta Protobacteria Cuong29 marina Nitrospira Nhi30 Nitrospira moscoviensis NitrospiraPhylum 0.05 Hình 3.13 Cây phát sinh chủng loại chủng phân lập BNI-8, BNI-9, BNII-9 BNII-10 dựa trình tự gen mã hóa 16S RNAr Dựa vào đặc điểm sinh lý, sinh hóa di truyền số chủng tuyển chọn, sơ định tên khoa học chủng tuyển chọn: chủng vi khuẩn oxi 45 hóa amoni thuộc chi Nitrosomonas, BNI-8 N eutropha BNI-9 N europaea Các chủng vi khuẩn oxi hóa nitrit thuộc chi Nitrobacter, BNII-9 N winogradski BNII-10 N vulgaris Các chủng vi khuẩn không nằm danh mục nhóm vi khuẩn gây bệnh cho ngƣời động vật đƣ c coi chủng điển hình để nghiên cứu ứng dụng cơng nghệ loại h p chất chứa nitơ nƣớc ngầm 46 KẾT LUẬN Đã phân lập đƣ c nhóm vi sinh vật có khả chuyển hóa nitơ (vi khuẩn ơxi hố amoni, ơxi hố nitrite, khử nitrate), tạo biofilm từ nƣớc thải chăn nuôi Bắc Ninh Đã tìm hiểu điều kiện tối ƣu môi trƣờng (nhiệt độ, pH, nồng độ chất dinh dƣ ng) nhƣ kết h p với vật liệu mang polyurethane để tăng khả chuyển hoá nitơ, tạo màng biofilm chủng phân lập, tuyển chọn Dựa vào trình tự rRNA 16S, sơ định tên khoa học chủng tuyển chọn: chủng vi khuẩn oxi hóa amoni thuộc chi Nitrosomonas, BNI-8 N eutropha BNI-9 N europaea Các chủng vi khuẩn oxi hóa nitrit thuộc chi Nitrobacter, BNII-9 N winogradski BNII-10 N vulgaris KIẾN NGHỊ Tiếp tục nghiên cứu tối ƣu điều kiện lên men để tạo nhiều sinh khối chủng vi khuẩn đƣ c phân lập tuyển chọn Đánh giá mức độ phân tử khả năng, chế chuyển hoá ni tơ chủng tiêu biểu nhằm ứng dụng sản xuất chế phẩm vi sinh 47 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Kiều Hữu Ảnh (2006), Giáo trình vi sinh vật học, phần 1, NXB Đại họcQuốc Gia Hà Nội Bộ Tài Nguyên Môi trƣờng (2010), Báo cáo môi trƣờng Quốc gia 2010, Hà Nội Lê Văn Cát (2007), Xử lý nước thải giàu hợp chất nitơ photpho, NXB, Khoa học tự nhiên Cơng nghệ Nguyễn Hồi Hƣơng (2009), Giáo trình thực hành vi sinh ứng dụng, NXB Đại học Quốc Gia TpHCM Lƣơng Đức Phẩm (2003), Công nghệ xử lý nước thải biện phápsinh học, NXB Giáodục Nguyễn Văn Phƣớc (2007), Xử lý nước thải sinh hoạt công nghiệp phương pháp sinh học, NXB Xây dựng Tiếng Anh Anderson I.C., Poth M., Homstead J., and Burdige D (1993), “A comparison of NO and N2O production by the autotrophic nitrifierNitrosomonas europaea and the heterotrophic nitrifier Alcaligenes faecalis”, Applied and Environmental Microbiology, 59 (11), pp 3525-3533 Annachhatre A.P.and Bhamidimarri S.M.R (1992), “Microbial attachment and growth in fixed-film reactors: Process startup considerations”, Biotechnology Advances, 10 (1), pp 69-91 APHA (2001), Standard Methods for the Examination of Water and Wastewate., 20th edition, American Public Health Association, Washington, DC 10 Asgari M.J., Safavi K., (2011), “Landfill biogas production process”, International Conference on Food Engineering and Biotechnology, 9, pp.208212 48 11 Bao L.-L., Li D., Li X.K., Huang R.X., Zhang J., Yang L., and Xia G.Q (2007), “Phosphorus accumulation by bacteria isolated from a continuous- flow two-sludge system”, Journal of Environmental Sciences, 19 (4), pp 391-395 12 Bernet N., Dangcong P., Delgen s J., and Moletta R (2001), “Nitrification at low oxygen concentration in biofilm reactor”, Journal of Environmental Engineering, 127 (3), pp.266-271 13 Boelee N.C., Temmink H., Janssen M., Buisman C.J.N., and Wijffels R.H (2011), “Nitrogen and phosphorus removal from municipal wastewater effluent using microalgal biofilms”, Water Research, 45 (18), pp 5925-5933 14 Boyd C.E and Tucker C.S (1998), Pond Aquaculture Water Quality Management, Kluwer Acad.Publ 15 Broda E (1977), “Two kinds of litho trophs missing in nature”, Zeitschrift für allgemeine Mikrobiologie, 17 (6), pp 491-493 16 Cheung K.C., Chu L.M., and Wong M.H (1997), “Ammonia stripping as a pretreatment for landfill leachate”, Water, Air and Soil Pollution, 94 (1-2), pp.209-221 17 Cong L.T.N., Huyen H.T., and Minh N.N (2012), “Phenol degradation of biofilm formed by mixingmarine bacteria”, VNU Journal of Science, 28 (2S), pp.75-81 18 Costerton J.W., Lewandowski Z., Caldwell D.E., Korber D.R., and Lappin- Scott H.M (1995), “Microbial biofilms”, Annual Review of Microbiology, 49, pp.711-745 19 Czaczyk K and Myszka K (2007), “Biosynthesis of extracellular polymeric substances (EPS) and its role in microbial biofilm formation”, Polish Journal of Environmental Studies, 16 (6), pp.799-806 20 Di Bonaventura G., Stepanovic S., Picciani C., Pompilio A., and Piccolomini R (2007), “Effect of environmental factors on biofilm formation by clinicalStenotrophomonas maltophilia isolates”, Folia Microbiologica., 52 (1), pp 86-90 49 21 Donlan R.M (2002), “Biofilms: microbial life on surfaces”, Emerging Infectious Diseases Journal, (9), pp 881-890 22 Federation W.E (1998), Biological and chemical systems for nutrient removal, Water Environment Federation, Alexandria, VA 23 Flemming H.-C (1993), “Biofilms and Environmental Protection”, Water Science & Technology, 27 (7-8), pp.1-10 24 Giaouris E., Chorianopoulos N., and Nychas G.J.E (2005), “Effect of temperature, pH, and water activity on biofilm formation by Salmonella enterica enteritidis PT4 on stainless steel surfaces as indicated by the bead vortexing method and conductance measurements”, Journal of Food Protection, 68 (10), pp.2149-2154 25 Gilbert P., Das J., and Foley I (1997), “Biofilm susceptibility to antimicrobials”, Advances in Dental Research, 11 (1), pp 160-167 26 Hang T.T and Huy N.Q (2011), “Isolate biofilm forming Bacillus strains from contamination site in trade villages in Viet Nam”, VNU Journal of Science, 27 (2S), pp.157-162 27 Henze M., Harremoes P., Jansen J.C., and Arvin E (2001), Wastewater Treatment: Biological and Chemical Processes, Springer 28 Heydorn A., Nielsen A.T., Hentzer M., Sternberg C., Givskov M., Ersboll B.K., and Molin S (2000), “Quantification of biofilm structures by the novel computer program COMSTAT”, Microbiology , 146(10), pp.2395-2407 29 Ho K.L., Pometto A.L., and Hinz P.N (1997), “Optimization of L-lactic acid production by ring and disc plastic composite supports through repeated-batch biofilm fermentation”, Applied and Environmental Microbiology, 63 (7), pp.2533-2542 30 Hoilijoki T.H., Kettunen R.H., and Rintala J.A (2000), “Nitrification of anaerobically pretreated municipal landfill leachate at low temperature”,Water Research, 34 (5), pp.1435-1446 31 Hunik J.H., Van Den Hoogen M.P., De Boer W., Smit M., and Tramper J 50 (1993), “Quantitative determination of the spatial distribution ofNitrosomonas europaea and Nitrobacter agilis cells immobilized in kappacarrageenan gel beads by a specific Ffuorescent-antibody labelling technique”, Applied and Environmental Microbiology, 59 (6), pp 1951-1954 32 Huy N.Q., Lien N.T.P., and Hang T.T (2011), “Characterization of biofilm forming bacteria isolated from soil in VietNam”, VNU Journal of Science, 27 (2S), pp.187-193 33 Jørgensen K.S and Pauli A.S.L (1995), “Polyphosphate accumulation among denitrifying bacteria in activated sludge”, Anaerobe, (3), pp 161- 168 34 Kim J.K., Park K.J., Cho K.S., Nam S.W., Park T.J., Bajpai R (2005), “Aerobic nitrification–denitrification byheterotrophicBacillus strains”, Bioresource Technology, 96 (17), pp 1897-1906 35 Kokare C.R.C., Khopade A.N., and Mahadik K (2009), “Biofilm: importance and applications”, Indian Journal of Biotechnology, 18, pp 159- 168 36 Lacko N., Drysdale G.D., and Bux F (2003), “Anoxic phosphorus removal by denitrifying heterotrophic bacteria”, Water Science and Technology, 47 (11), pp.17-22 37 Lazarova V and Manem J (1995), “Biofilm characterization and activity analysis in water and wastewater treatment”, Water Research, 29 (10), pp 22272245 38 Li X.Z., Zhao Q.L., and Hao X.D (1999), “Ammonium removal from landfill leachate by chemical precipitation”, Waste Management, 19 (6),pp 409415 39 Lopez D., Vlamakis H., and Kolter R (2010), “Biofilms”, Cold SpringHarbor Perspectives in Biology, (7), pp 398-408 40 Mulder A (2003), “The quest for sustainable nitrogenremoval technologies”, Water Science and Technology, 48 (1), pp 67-75 41 Mulder A., Van De Graaf A.A., Robertson L.A., and Kuenen J.G (1995), “Anaerobic ammonium oxidation discovered in a denitrifying fluidized bed 51 reactor”, FEMS Microbiology Ecology, 16 (3), pp 177-183 42 Nadell C.D., Xavier J.B., Levin S.A., and Foster K.R (2008), “The evolution of quorum sensing in bacterial biofilms”, PLoS biology, (1), pp e14 43 O'toole G., Kaplan H.B., and Kolter R (2000), “Biofilm formation as microbial development”, Annual Review of Microbiology, 54, pp 49-79 44 O'toole G.A., Gibbs K.A., Hager P.W., Phibbs P.V., Jr., and KolterR (2000), “The global carbon metabolism regulator Crc is a component of a signal transduction pathway required for biofilm development by Pseudomonas aeruginosa”, Journal of Bacteriology, 182 (2), pp 425-431 45 O'toole G.A and Kolter R (1998), “Flagellar and twitching motility are necessary for Pseudomonas aeruginosa biofilm development”, Molecular Microbiology, 30 (2), pp.295-304 46 O'toole G.A and Kolter R (1998), “Initiation of biofilm formation in Pseudomonas fluorescens WCS365 proceeds via multiple, convergent signalling pathways: a genetic analysis”, Molecular Microbiology, 28(3), pp.449-461 47 Yangin C., Yilmaz S., Altinbas M., and Ozturk I (2002), “A new process for the combined treatment of municipal wastewaters and landfill leachates in coastal areas”, Water Science and Technology , 46 (8), pp.111-118 48 Zhang J., Wu P., Hao B., and Yu Z (2011), “Heterotrophic nitrification and aerobic denitrification by the bacterium Pseudomonas stutzeri YZN-001”, Bioresource Technology, 102 (21), pp 9866-9869 49 Zhang Q.-L., Liu Y., Ai G.-M., Miao L.L., Zheng H.-Y., and Liu Z.-P (2012), “The characteristics of a novel heterotrophic nitrification–aerobic denitrification bacterium, Bacillus methylotrophicus strain L7”, Bioresource Technology, 108, pp.35-44 52 ... HỌC TỰ NHIÊN - - Vũ Thị Huế PHÂN LẬP CÁC CHỦNG VI SINH VẬT CHUYỂN HOÁ NITƠ, TẠO BIOFILM VÀ ỨNG DỤNG TRONG XỬ LÝ NƢỚC THẢI CHĂN NUÔI Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 60 42 01... chủng vi sinh vật chuyển hoá ni tơ, tạo biofilm kết hợp với vật liệu mang xử lý nước thải chăn nuôi Với nội dung nghiên cứu nhƣ sau:  Phân lập lựa chọn chủng vi sinh vật có khả chuyển hóa amoni,... thấy, trình xử lý nƣớc thải sử dụng màng sinh học tăng hiệu xử lý có mặt vật liệu bám cho vi sinh vật Bernet cộng nghiên cứu ứng dụng khả chuyển hóa nitơ tạo màng sinh học vi sinh vật Mẫu ban