phân lập vi khuẩn clostridium spp. từ mẫu đất tại huyện phú tân và châu phú tỉnh an giang, kiểm tra tính nhạy cảm của vi khuẩn phân lập được với một số loại kháng sinh và thử độc tố botulin trên chuột bạch

TỪ MẪU ĐẤT TẠI HUYỆN PHÚ TÂN VÀ CHÂU PHÚ TỈNH AN GIANG, KIỂM TRA TÍNH NHẠY CẢM CỦA VI KHUẨN PHÂN LẬP ĐƯỢC VỚI MỘT SỐ LOẠI KHÁNG SINH VÀ THỬ ĐỘC TỐ BOTULIN TRÊN CHUỘT BẠCH Luận văn

HỒ HỒNG NGÂN

PHÂN LẬP VI KHUẨN CLOSTRIDIUM SPP TỪ MẪU

ĐẤT TẠI HUYỆN PHÚ TÂN VÀ CHÂU PHÚ TỈNH

AN GIANG, KIỂM TRA TÍNH NHẠY CẢM CỦA

VI KHUẨN PHÂN LẬP ĐƯỢC VỚI MỘT SỐ

LOẠI KHÁNG SINH VÀ THỬ ĐỘC TỐ

BOTULIN TRÊN CHUỘT BẠCH

Luận văn tốt nghiệp Ngành: DƯỢC THÚ Y

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ

KHOA NÔNG NGHIỆP & SINH HỌC ỨNG DỤNG

Cần Thơ, 2014

Luận văn tốt nghiệp Ngành: DƯỢC THÚ Y

Tên đề tài:

PHÂN LẬP VI KHUẨN CLOSTRIDIUM SPP TỪ MẪU

ĐẤT TẠI HUYỆN PHÚ TÂN VÀ CHÂU PHÚ TỈNH

AN GIANG, KIỂM TRA TÍNH NHẠY CẢM CỦA

VI KHUẨN PHÂN LẬP ĐƯỢC VỚI MỘT SỐ LOẠI KHÁNG SINH VÀ THỬ ĐỘC TỐ

BOTULIN TRÊN CHUỘT BẠCH

Giáo viên hướng dẫn Sinh viên thực hiện

Th.S NGUYỄN THU TÂM HỒ HỒNG NGÂN

MSSV: 3102965

Lớp: Dược Thú Y K36

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ

KHOA NÔNG NGHIỆP & SINH HỌC ỨNG DỤNG

Cần Thơ, 2014

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA NÔNG NGHIỆP VÀ SINH HỌC ỨNG DỤNG

BỘ MÔN THÚ Y

Đề tài: “Phân lập vi khuẩn Clostridium spp từ mẫu đất tại huyện Phú Tân và

Châu Phú tỉnh An Giang, kiểm tra tính nhạy cảm của vi khuẩn phân lập được với một số loại kháng sinh và thử độc tố botulin trên chuột bạch” Do sinh viên:

Hồ Hồng Ngân thực hiện tại phòng Vi trùng và Miễn dịch của Bộ môn Thú Y, Khoa Nông Nghiệp & Sinh Học Ứng Dụng, trường Đại học Cần Thơ từ 07/2014 đến 11/2014.

Cần Thơ, Ngày…Tháng…Năm 2015 Cần Thơ, Ngày…Tháng…Năm 2015

Duyệt Bộ Môn Duyệt Giáo Viên Hướng Dẫn

NGUYỄN THU TÂM

Cần Thơ, Ngày…Tháng…Năm 2015

Duyệt Khoa Nông nghiệp & SHƯD

LỜI CẢM ƠN

Trãi qua những tháng năm học tập tại trường Đại học Cần Thơ và thời gian thực tập luận văn tốt nghiệp tại phòng Vi trùng và Miễn dịch của Bộ môn Thú Y, Khoa Nông Nghiệp & Sinh Học Ứng Dụng, trường Đại học Cần Thơ Hôm nay nhìn vào bài luận văn tốt nghiệp- bài viết cuối cùng của em trong quãng đời sinh viên, ngẫm lại chặng đường đã đi qua em không biết nói gì hơn, chỉ xin gởi lời cảm ơn chân thành nhất đến những người đã quan tâm, thương yêu và giúp đỡ em trong thời gian qua Em xin cảm ơn:

Người đầu tiên là cha mẹ em- đấng sinh thành đã tạo ra em, nuôi dạy em khôn lớn, chỉ cho em những điều hay, lẽ phải để em có thể được như ngày hôm nay

Ngoài ra còn có Ban giám hiệu trường Đại học Cần Thơ, Bô môn Thú Y Khoa Nông Nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng, cùng các quý thầy, cô đã tận tình giảng dạy em trong suốt thời gian học tập ở trường

Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến cô Nguyễn Thu Tâm đã hết lòng hướng dẫn, truyền đạt nhiều kiến thức và kinh nghiệm quý báu cho em trong suốt quá trình thực hiện và hoàn thành luận văn này

Em xin chân thành biết ơn tất cả các anh, chị đang công tác tại phòng Vi sinh của công ty Vemedim đã tận tình tạo mọi điều kiện thuận lợi, giúp đỡ em trong suốt thời gian thực hiện luận văn tốt nghiệp

Cảm ơn các bạn Dược Thú Y K36 đã chia sẻ cùng em những buồn vui trong quá trình học tập cũng như hết lòng hỗ trợ, giúp đỡ em trong suốt thời gian thưc hiện đề tài Cuối cùng xin chúc quý thầy cô và các anh chị sức khỏe và thành công để dìu dắt từng lớp sinh viên

Xin chân thành cảm ơn!

MỤC LỤC

Mục Trang

Trang duyệt i

Lời cảm tạ ii

Mục lục iii

Danh sách bảng vi

Danh sách hình vii

Danh sách sơ đồ vii

Tóm lược viii

Chương 1 ĐẶT VẤN ĐỀ 1

Chương 2 CƠ SỞ LÝ LUẬN 2

2.1 Tình hình nghiên cứu và các ghi nhận về sự ảnh hưởng của vi khuẩn Clostridium spp 2

2.1.1 Tình hình nghiên cứu Clostridium spp trên thế giới 2

2.1.5 Tình hình nghiên cứu Clostridium spp trong nước 5

2.2 Giới thiệu về vi khuẩn Clostridium spp 6

2.2.1 Phân loại 6

2.2.2 Hình thái của vi khuẩn 7

2.2.3 Đặc tính nuôi cấy 8

2.2.4 Đặc tính sinh hóa 8

2.2.5 Sức đề kháng của vi khuẩn 9

2.2.6 Sự phân bố và những ảnh hưởng của vi khuẩn Clostridium spp trong tự nhiên 9

2.3 Độc tố Clostridium spp 10

2.3.1 Độc tố Clostridium botulinum 10

2.3.2 Độc tố Clostridium perfringens 11

2.3.3 Độc tố Clostridium tetani 12

2.3.4 Độc tố Clostridium difficile 13

2.3.5 Độc tố Clostridium colinum 13

2.4 Bệnh do nhiễm độc tố của vi khuẩn Clostridium botulinum 14

2.4.1 Phân loại độc tố botulin 14

2.4.2 Ảnh hưởng của botulin lên con người 16

2.4.3 Ảnh hưởng của botulin trên động vật 20

2.5 Ứng dụng của độc tố botulin vào y học 24

2.6 Đặc điểm sinh học của chuột bạch 26

Chương 3 PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 28

3.1 Phương tiện nghiên cứu 28

3.1.1 Nội dung, thời gian, địa điểm, đối tượng nghiên cứu 28

3.1.2 Dụng cụ, thiết bị và máy móc 28

3.1.3 Hóa chất và môi trường 28

3.2 Phương pháp nghiên cứu 29

3.2.1 Phương pháp lấy mẫu 29

3.2.2 Phương pháp nuôi cấy, phân lập mẫu 29

3.2.3 Kiểm tra đặc tính sinh hóa của vi khuẩn Clostridium spp 30

3.2.4 Phương pháp kiểm tra độ nhạy của vi khuẩn đối với kháng sinh 33

3.2.5 Nuôi chuột thử độc tố 34

3.2.5.1 Bố trí thí nghiệm 34

3.2.5.2 Phương pháp lấy mẫu 35

3.2.5.3 Phương pháp tiến hành thí nghiệm 35

3.2.6 Phương pháp xử lý số liệu 36

Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 37

4.1 Tổng quan về địa điểm lấy mẫu 37

4.2 Kết quả phân lập vi khuẩn Clostridium spp trên đất ruộng tại huyện Phú Tân và Châu Phú, tỉnh An Giang 38

4.3 Kết quả phân lập các chủng vi khuẩn Clostridium spp thông qua các đặc tính sinh hóa 39

4.4 Kết quả kiểm tra độ nhạy của vi khuẩn Clostridium spp phân lập được đối với một số loại kháng sinh 40

4.4.1 Kết quả kháng sinh đồ của vi khuẩn Clostridium spp phân lập được

đối với một số loại kháng sinh 40

4.4.2 Kết quả kháng sinh đồ của các chủng vi khuẩn Clostridium phân lập được đối với một số loại kháng sinh 41

4.4.3 Tính đa kháng của vi khuẩn Clostridium spp đối với kháng sinh 41

4.5 Kết quả thử độc tố botulin trên chuột thí nghiệm 42

4.5.1 Kết quả thử độc tố botulin trên chuột thí nghiệm 43

4.5.2 Kết quả các triệu chứng lâm sàng trên chuột thí nghiệm 44

4.5.3 Kết quả các bệnh tích đại thể trên chuột thí nghiệm 45

Chương 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 46

TÀI LIỆU THAM KHẢO 47

PHỤ CHƯƠNG 54

DANH SÁCH BẢNG

1 Sự khác biệt về cấu trúc phân tử giữa các chủng vi khuẩn

2 Đặc tính sinh hóa của một số chủng vi khuẩn Clostridium 8

3 Bệnh do các type độc tố của Clostridium perfringens 12

4 Các nhóm kiểu hình của Clostridium botulinum 15

5 Độc tố botulin và các loài ảnh hưởng chủ yếu 16

7 Các chỉ tiêu định danh vi khuẩn Clostridium botulinum của

8 Đánh giá mức độ mẫn cảm của vi khuẩn với một số loại

9 Tỷ lệ nhiễm vi khuẩn Clostridium spp trong đất tại huyện

10 Tỷ lệ nhiễm các chủng vi khuẩn Clostridium từ các mẫu đã

11 Kết quả kháng sinh đồ đối với vi khuẩn Clostridium spp

12 Tính nhạy cảm của kháng sinh đối với các chủng vi khuẩn

13 Tính đa kháng của vi khuẩn Clostridium spp phân lập được

14 Kết quả thử độc tố của vi khuẩn Clostridium trên chuột thí

15 Kết quả biểu hiện triệu chứng lâm sàng trên chuột thí nghiệm 44

16 Kết quả bệnh tích đại thể trên chuột thí nghiệm 45

DANH SÁCH HÌNH

DANH SÁCH SƠ ĐỒ

1 Quy trình phân lập vi khuẩn Clostridium spp 30

2 Quy trình thử độc tố botulin trên chuột thí nghiệm 37

3 Ảnh hưởng của Clostridium tetani trên vật nuôi 13

4 Các báo cáo về ngộ độc thực phẩm do botulin ở Mỹ trong

7 Xác suất mùa vụ tương đối của botulin type C ở các loài

13 Kết quả lên men đường của vi khuẩn Clostridium botulinum 31

TÓM LƯỢC

Đề tài nghiên cứu được tiến hành từ 07/2014 đến 11/2014, 46 mẫu đất ruộng được thu thập từ các vùng có vịt bị bệnh “cúm cần” với các triệu chứng liệt cổ, liệt cánh, liệt chân ở 2 huyện Phú Tân và Châu Phú tỉnh An Giang, tiến hành phân lập vi khuẩn

Clostridium spp trên các mẫu đã thu thập theo phương pháp truyền thống trên môi

trường thạch máu, định type bằng phản ứng sinh hóa, API 20A Kết quả phân lập

được 86,96% (40/46) vi khuẩn Clostridium spp., trong đó có 17,39% (8/46) là vi khuẩn Clostridium botulinum, 69,57% (32/46) là vi khuẩn Clostridium colinum và

13,04% (6/46) chưa định type được Kết quả kháng sinh đồ của vi khuẩn với 5 loại kháng sinh (norfloxacin, erythromycin, tetracyline, trimethoprime và penicillin) cho

thấy vi khuẩn Clostridium spp phân lập được mẫn cảm cao với norfloxacin 100% và

100% kháng với penicillin và trimethoprime Trong đó có 1 mẫu kháng với 4 loại kháng sinh (erythromycin, tetracyline, trimethoprime và penicillin), 4 mẫu kháng với

3 loại kháng sinh (erythromycin, trimethoprime và penicillin) và 22 mẫu kháng với 2 loại kháng sinh (trimethoprime và penicillin) Kết quả thử độc tố của vi khuẩn

Clostridium botulinum trên chuột bạch cho thấy 13/16 con chuột có biểu hiện khác

thường (81,25%) và 3/16 con chuột chết (18,75%) sau khi tiêm 0,5ml canh trùng đã

ly tâm 12000 vòng/phút và không qua xử lý nhiệt của vi khuẩn Clostridium botulinum

phân lập được, trong đó 92,31% (12/13) có triệu chứng ủ rủ, chậm vận động, 38,46% (5/13) biểu hiện sợ hãi, 23,08% (3/13) xuất hiện ăn ít, thở bụng và 7,69% (1/13) có triệu chứng chân sau yếu Với 3 con chuột chết có các bệnh tích phổ biến là phổi xuất huyết chiếm 100% (3/3), phổi xung huyết chiếm 66,67% (2/3) và tim xung huyết (2/3)

Chương 1 ĐẶT VẤN ĐỀ

An Giang là vùng đất phù sa màu mỡ, trù phú, có các điều kiện tự nhiên thuận lợi như nhiều ao, hồ, kênh rạch, đồng ruộng, với khối lượng lúa rơi vãi lớn thì con người nơi đây

đã biết tận dụng để chăn nuôi vịt chạy đồng, đây là phương thức chăn nuôi có giá thành

rẻ nhất vì vịt tận dụng lúa rơi vãi sau mỗi vụ thu hoạch và nguồn thức ăn tự nhiên như

cá, cua, ốc… nên đã góp phần đáng kể vào việc cải thiện thu nhập, nâng cao mức sống của người dân không những thế còn giúp tiêu diệt ốc, côn trùng gây hại Tuy nhiên, theo phương thức chăn nuôi này, vịt phải di chuyển từ đồng ruộng này sang đồng ruộng khác, chính vì thế nên khả năng lây lan mầm bệnh rất cao

Trong vài năm gần đây, những đàn vịt chạy đồng thường xảy ra một căn bệnh tuy không phát triển thành dịch nhưng cũng đã gây tổn thất nặng nề cho người chăn nuôi bởi bệnh phát triển nhanh, tỷ lệ mắc bệnh và chết khá cao Vịt mắc bệnh sẽ có các triệu chứng liệt mềm cổ, liệt mí mắt trong, liệt cánh và chân được người chăn nuôi địa phương gọi với tên là bệnh “cúm cần”, hay còn được gọi là chứng cổ mềm (limberneck) đây là bệnh do

vịt đã nhiễm độc tố của vi khuẩn Clostridium botulinum Clostridium botulinum là vi

khuẩn có khả năng sản sinh độc tố (botulin), làm ức chế sự dẫn truyền thần kinh gây ra liệt cơ, độc chất này là nguyên nhân gây ra các bệnh ngộ độc thực phẩm trên người và nhiều loài động vật khác Theo nghiên cứu của Peck (2009) cho thấy tỷ lệ nhiễm vi khuẩn

Clostridium spp trong môi trường đất thường rất cao, cao hơn cả sự hiện diện trong ruột

của gia súc, điều đó phản ánh đất như là một mối nguy cơ to lớn ảnh hưởng đến sức khỏe

cho con vật Trên thế giới có nhiều nghiên cứu về vi khuẩn Clostridium spp gây ảnh

hưởng to lớn cho gia súc, gia cầm, tuy nhiên, sự nghiên cứu trong nước còn rất ít và hạn chế

Xuất phát từ tình hình thực tế trên, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài “Phân lập vi

khuẩn Clostridium spp từ mẫu đất tại huyện Phú Tân và Châu Phú tỉnh An Giang,

kiểm tra tính nhạy cảm của vi khuẩn phân lập được với một số loại kháng sinh và thử độc tố botulin trên chuột bạch”

Đề tài được thực hiện với mục tiêu:

Phân lập vi khuẩn Clostridium spp từ mẫu đất ruộng ở huyện Phú Tân và Châu Phú tỉnh

An Giang

Kiểm tra tính nhạy cảm của vi khuẩn phân lập được với một số loại kháng sinh

Thử độc tố botulin trên chuột bạch thí nghiệm

Chương 2

CƠ SỞ LÝ LUẬN

2.1 Tình hình nghiên cứu và ghi nhận về sự ảnh hưởng của vi khuẩn Clostridium

spp

Vi khuẩn Clostridium spp xuất hiện phổ biến ở nhiều nơi trên thế giới và có nhiều trong

môi trường tự nhiên Chúng tồn tại trong đất, phân, nước thải và trầm tích biển Mặc dù

có hơn 100 loài đã được mô tả trong chi Clostridium, nhưng chủ yếu có 4 loài chính gây bệnh ảnh hưởng đến gia súc và gia cầm là: Clostridium botulinum- gây ngộ độc thực phẩm, Clostridium perfringens- gây các bệnh đường ruột phổ biến ở gia cầm và nặng nhất là viêm ruột hoại tử, Clostridium tetani- gây bệnh uốn ván và Clostridium difficile-

gây viêm ruột nặng và nhiễm độc đường ruột

2.1.1 Một số nghiên cứu và ghi nhận về sự ảnh hưởng của vi khuẩn Clostridium ssp trên thế giới

 Tình hình nghiên cứu trên thế giới về vi khuẩn Clostridium botulinum

Bắc Mỹ

Qua nghiên cứu của M W Eklund et al năm 1982 và 1984 trong một đợt bùng phát

dịch bệnh tại các ao nuôi cá trên các vùng trầm tích ở các hồ lớn tại Hoa Kỳ cho thấy có

sự tồn tại số lượng lớn của Clostridium botulinum type E

Năm 1989, A H W Hauschild đã khảo sát ở New York và tìm thấy từ các mẫu đất lấy

ở khu vực phía Tây có sự hiện diện của C botulinum type A nhiều hơn, trong khi đó ở khu vực phía Đông chủ yếu tìm thấy lại là C botulinum type B Ông ghi nhận rằng tại các vùng đất có tính hơi kiềm (pH trung bình 7,5) sẽ phân lập được các chủng C botulinum type A và từ các vùng đất có tính hơi chua (pH trung bình 6,25) sẽ phân lập được các chủng C botulinum type B

Châu Âu

Năm 1936 qua báo cáo của Website Michigan DEQ về ngộ độc cho thấy Clostridium botulinum type C lần đầu tiên được tìm thấy trong hồ Michigan ở Great Lakes

Theo sự nghiên cứu của Johannsen vào năm 1963 về tình hình nhiễm vi khuẩn

Clostridium botulinum ở Thụy Điển và các vùng biển lân cận cho thấy sự hiện diện khá phổ biến của vi khuẩn Clostridium botulinum type E trong các trầm tích thủy sản ở Na

Uy và Thụy Điển

Sau đó trong một đợt ngộ độc ở hồ Michigan, năm 1964, Kaufmann đã xác định nguyên nhân là do type E gây ra

Bên cạnh đó Huss & H H cũng đã chứng minh được sự xuất hiện của vi khuẩn C botulinum type E ở Đan Mạch vào năm 1980

Đến năm 1989, A H W Hauschild đã tìm thấy sự hiện diện của vi khuẩn C botulinum type E ở Hà Lan, bờ biển Baltic của Ba Lan và Nga Từ đó, ông cho rằng các vi khuẩn Clostridium botulinum type E chính là một sinh vật thủy sản và mức độ nhiễm vi khuẩn

C botulinum type E tương quan với tình trạng ngập lục của đất vùng biển, do đó khi ở

trên đất liền mức độ nhiễm type E thấp và type B trở nên chiếm ưu thế hơn Điều đó được chứng minh khi trong các mẫu đất và trầm tích ở Vương quốc Anh mức độ vi khuẩn

Clostridium botulinum type B được tìm thấy tương đối nhiều hơn so với các type khác Nhưng nhìn chung, tỷ lệ nhiễm vi khuẩn Clostridium botulinum trong đất thường thấp

hơn trong trầm tích

Ở Italia, qua cuộc khảo sát của Creti et al (1990) về mức độ nhiễm Clostridium tại các khu vực xung quanh Rome đã cho thấy có sự nhiễm Clostridium botulinum và tất cả các chủng phân lập được là C botulinum type A và B

 Tình hình nghiên cứu trên thế giới về vi khuẩn Clostridium perfringens

Qua nghiên cứu của Parish & W E (1961) lần đầu tiên ghi nhận vi khuẩn Clostridium perfringens là nguyên nhân gây bệnh viêm ruột hoại tử hay còn gọi bệnh NE với các

triệu chứng lâm sàng trong các vụ dịch bao gồm ủ rủ, vận động chậm, giảm sự thèm ăn, lười vận động, tiêu chảy và xù lông Bệnh lâm sàng thường là rất ngắn, chim được tìm

thấy đa số đã chết Ngoài ra, các bệnh tích mổ khám khi chết đã được Droua et al (1995) miêu tả với bệnh tích chủ yếu là viêm ruột xuất huyết

Theo Balauca & N (1978) đã nghiên cứu về bệnh viêm ruột hoại tử ở gà và chim cút tại

Nhật Bản, các kết quả đều dương tính với vi khuẩn C perfringens

Qua nghiên cứu của Droual et al (1994) về khả năng gây bệnh của vi khuẩn Clostridium perfringens cho thấy vi khuẩn có thể gây bệnh ở gia cầm, nhất là gà tây

Năm 1995 Droual et al đã tiến hành nghiên cứu trên đàn gà tây đã được chẩn đoán nhiễm

bệnh NE, ông phát hiện gà trống có biểu hiện khỏe mạnh hơn gà mái khi nhiễm bệnh,

điều này chứng minh giới tính ảnh hưởng đến khả năng nhiễm vi khuẩn Clostridium perfringens

 Tình hình nghiên cứu trên thế giới về vi khuẩn Clostridium tetani

Carle và Rattone là người đầu tiên thử nghiệm độc tố uốn ván trên động vật, năm 1884, ông đã tiến hành tiêm mủ của người nhiễm bệnh vào con vật

Năm 1889, Kitasato đã tiến hành nghiên cứu về bệnh uốn ván và nhận thấy rằng các độc

tố uốn ván có thể được trung hòa bởi kháng thể đặc hiệu

Thời gian ủ bệnh uốn ván là từ 2 ngày đến vài tháng, nhưng hầu hết các trường hợp tiến triển trong vòng chưa đầy 14 ngày Thời gian ủ bệnh ngắn hơn tương đương với khả năng tử vong lớn Bào tử uốn ván sẽ nảy mầm trong điều kiện yếm khí, sản xuất chất độc lây lan qua máu và hệ bạch huyết

Theo thống kê của World Health Oganization (WHO) cho biết trên thế giới đã có một

sự suy giảm đáng kể bệnh uốn ván nhờ vào cải tiến trong việc tiêm phòng uốn ván, các báo cáo đã giảm từ hơn 30.000 trường hợp cách đây 10 năm (năm 2002) để còn dưới 10.000 trường hợp được báo cáo trong năm 2011 Sự sụt giảm này có liên quan với việc tiêm phòng Mặc dù có những cải tiến trong phạm vi tiêm phòng uốn ván tuy nhiên vẫn còn số người chết do bệnh uốn ván, đặc biệt là ở trẻ em Báo cáo của WHO ước tính có 72.000 ca tử vong ở trẻ em dưới năm tuổi trên toàn thế giới vào năm 2011

 Tình hình nghiên cứu và ghi nhận về vi khuẩn Clostridium difficile

Qua nghiên cứu của Frazier et al (1993) cho thấy vi khuẩn Clostridium difficile có khả

năng gây ra bệnh viêm ruột nặng và nhiễm độc đường ruột

Năm 2009, Alvarez-Perez S et al đã tiến hành nghiên cứu về tỷ lệ nhiễm Clostridium dificile ở heo con tiêu chảy, kết quả phân lập được 25,9% vi khuẩn C difficile ở lợn con

sơ sinh tại Tây Ban Nha với triệu chứng lâm sàng điển hình là tiêu chảy

Theo kết quả nghiên cứu của Hopman et al (2011) về vi khuẩn Clostridium difficile trên lợn phát hiện 100% lợn con được thử nghiệm đều cho kết quả dương tính với C difficile Ngoài ra, qua kết quả của Debast SB et al (2009) các giống chủng C difficile không chỉ

được tìm thấy trên gia súc mà còn gặp ở trên con người

 Tình hình nghiên cứu và ghi nhận về vi khuẩn Clostridium colinum

Clostridium colinum được coi là tác nhân chính của bệnh viêm ruột loét ở một số loài gia cầm, trong kết quả nghiên cứu của Peckham (1959, 1960, 1978) và Kondo et al

(1988) về tình hình bệnh ở một số đàn gà thịt rất nhỏ ở vùng Negev của Israel trong

những năm gần đây cho kết quả xác định C colinum được coi là nguyên nhân chính gây

bệnh

Viêm ruột loét hay còn gọi là UE là một bệnh nhiễm khuẩn cấp tính ở gà non, gà tây, các loài chim ở vùng cao, bệnh khởi phát đột ngột và tử vong nhanh chóng

Theo Morse & G B (1970) bệnh UE lần đầu tiên được báo cáo tại Hoa Kỳ trong năm

1907 Ngoài ra, trong 2 thập kỷ qua, dựa trên các báo cáo của Gallagher & B A (1924)

và LeDune (1935) xuất hiện bệnh ở chim cút, gà gô và gà tây hoang dã Các loài gia cầm khác dễ bị tìm thấy bao gồm chim bồ câu và chim cút ở California (Glover & J S, 1951)

Qua kết quả nghiên cứu của Peckham & M C (1960) về tính gây bệnh của C difficile

thì viêm ruột loét thường xuyên được tìm thấy ở chim non, gà từ 4-12 tuần tuổi, gà tây 3-8 tuần tuổi cũng nằm trong số động vật dễ bị nhiễm và chim cút 4-12 tuần tuổi, không chỉ ảnh hưởng đến những con non mà bệnh còn gây nhiễm ở cả những con lớn, điển hình

là báo cáo của Kirkpatrick et al (1953) cho thấy một dịch bệnh đã được báo cáo ở chim

cút lớn

Sự phổ biến của bệnh UE xuất hiện hầu hết trên thế giới, một số báo cáo của Harris &

A H năm 1961 cho thấy dịch bệnh xuất hiện ở nước Anh, Nhật Bản, Canada, Đức và

Ấn Độ

2.1.2 Một số nghiên cứu và ghi nhận về sự ảnh hưởng của vi khuẩn Clostridium spp trong nước

Theo nghiên cứu của Phan Thanh Phượng et al (1996) và Nguyễn Bá Hiên (2001) về tỷ

lệ nhiễm vi khuẩn Clostridium perfringens trên mẫu phân lợn bị tiêu chảy, kết quả phân lập cho thấy 100% mẫu đều có sự hiện diện của vi khuẩn C perfringens

Qua kết quả của Nguyễn Văn Sửu et al (2008) khi ông làm nghiên cứu bệnh viêm ruột hoại tử trên mẫu phân lợn cho thấy tỷ lệ trung bình phân lập được Clostridium perfringens trong phân lợn nghi bị tiêu chảy do bệnh viêm ruột hoại tử là 57,43%

Từ kết quả của Trần Thị Hạnh et al (2000) cho thấy khi lợn chết vì tiêu chảy thì tỷ lệ phân lập được vi khuẩn Clostridium perfringens cao nhất là ở ruột non 85,7% kế đến ở

gan là 71,43%, và không tìm thấy vi khuẩn trong mẫu hạch ruột, lách, thận, máu tim Năm 2008, khi nghiên cứu tình hình dịch tễ bệnh viêm ruột hoại tử ở lợn con tại một số huyện của tỉnh Thái Nguyên, Nguyễn Văn Sửu và Nguyễn Quang Tuyên cho biết có thể

phân lập được vi khuẩn Clostridium perfringens từ phủ tạng (lách, thận, hạch, gan, máu

tim) của lợn chết do viêm ruột hoại tử, tỷ lệ phân lập được cao nhất ở ruột già (84,62%), ruột non (46,15%) và gan (38,46%)

Với kết quả nghiên cứu của Nguyễn Đức Hiền về mức độ nhiễm của vi khuẩn

Clostridium botulinum, kiểm tra tính nhạy cảm của vi khuẩn đối với các loại kháng sinh

ở vịt và môi trường chăn thả tại thành phố Cần Thơ năm 2012 đã phân lập được vi khuẩn này từ 14,7% mẫu chất chứa trong ruột vịt và 27,71% mẫu bùn, kết quả kháng sinh đồ cho thấy 100% vi khuẩn nhạy cảm với ceftiofur, fosformycin và cephalexin, 80% nhạy cảm với norfloxacin

Theo nghiên cứu của Nguyễn Đức Hiền (2012) sử dụng vi khuẩn Clostridium botulinum

phân lập được từ mẫu ruột vịt mắc bệnh “cúm cần” ở các trại chăn nuôi vịt Cần Thơ và

từ ao bùn trại nuôi vịt có thể gây chết 100% chuột thí nghiệm khi tiêm vào xoang bụng 1m/con dịch nổi ly tâm canh khuẩn nuôi cấy 5 ngày trong điều kiện yếm khí trên môi trường MCMM pha loãng 1/10 Ngược lại, nếu xử lý nhiệt dịch này trước khi tiêm thì tất cả chuột đều sống bình thường

Năm 2013, với đề tài nghiên cứu phân lập Clostridium spp tại tỉnh Trà Vinh và Long

An của Trương Minh Trung cho kết quả 31,25% có sự hiện diện của vi khuẩn trong bùn

đất, trong đó C colinum chiếm 31,25%, không có sự hiện diện của vi khuẩn C botulinum

2.2 Giới thiệu về vi khuẩn Clostridium spp

2.2.1 Phân loại

Vi khuẩn Clostridium spp thuộc

 Giới (regnum): Bacteria

Bảng 1: Sự khác biệt về cấu trúc phân tử giữa các chủng vi khuẩn Clostridium

Vi khuẩn Clostridium là trực khuẩn kỵ khí, bắt màu Gram dương, có kích thước 0,3- 1,3

x 3- 10 micromet (Quinn et al., 1999) có khả năng hình thành bào tử, khi thành bào tử

thì tế bào có hình thoi hoặc hình dùi trống Trong quá trình hoạt động một vài vi khuẩn

có khả năng tiết ra độc tố mạnh đó là nguyên nhân gây ra các bệnh như bệnh ngộ độc uốn ván, viêm ruột hoại tử, viêm ruột loét,…

Hầu hết các loài vi khuẩn Clostridium đều có khả năng di động nhờ vào lông nhung, chỉ riêng C perfringens là loài duy nhất không di động

Hình 1: Hình thái của vi khuẩn Clostridium

2.2.3 Đặc tính nuôi cấy của vi khuẩn Clostridium spp

Trong loài vi khuẩn Clostridium khi nuôi cấy đều yêu cầu môi trường yếm khí, tuy nhiên

một số loài yếm khí triệt để và không phát triển khi có sự hiện diện của oxy, một số loài khác vẫn có thể phát triển với một mức oxy trong điều kiện cho phép, trong khi đó một vài chủng vẫn có thể phát triển trong điều kiện môi trường bình thường

Các môi trường thích hợp cho sự phát triển của vi khuẩn Clostridium là môi trường thạch

máu và được nuôi trong điều kiện yếm khí Bên cạnh đó, các môi trường lỏng hoặc bán lỏng như Cooked Meat Broth và môi trường Thioglycollate thường được sử dụng để nuôi cấy và giữ giống

Trong phòng thí nghiệm, Clostridium botulinum thường được phân lập và tăng trưởng

trong môi trường Tryptose Sulfite Cycloserine (TSC) ở một điều kiện yếm khí với ít hơn 2% oxy

Các phương tiện tốt nhất để phân lập vi khuẩn C colinum là môi trường Agar Tryptose

Phosphate được thêm vào 0,2% glucose, 0,5% chiết xuất nấm men và 8% huyết tương ngựa Nuôi cấy phải được ủ trong môi trường kỵ khí 24-48 giờ ở nhiệt độ 35-42°C, khuẩn

lạc tạo thành có màu trắng, tròn và lồi Theo Cato et al (1986) khi nuôi cấy vi khuẩn C colinum trên môi trường thạch máu sẽ xuất hiện dung huyết dạng alpha điển hình Tuy nhiên cũng có trường hợp xuất hiện dạng dung huyết beta (Timoney et al., 1988) 2.2.4 Đặc tính sinh hóa

Bảng 2: Đặc tính sinh hóa của một số chủng vi khuẩn Clostridium

2.2.5 Sự đề kháng của vi khuẩn

Theo nghiên cứu của Peck vào năm 2009 cho thấy khi vi khuẩn Clostridium bị rơi vào

môi trường bất lợi như nhiệt độ, pH, ẩm độ hay thiếu dinh dưỡng thì chúng có khả năng tạo thành bào tử để tồn tại, bào tử có khả năng chịu nhiệt và thường được tìm thấy trong môi trường đất

Tính nhạy cảm/ kháng với kháng sinh: Johnson et al (2007) cho thấy tính nhạy cảm của

vi khuẩn Clostridium spp với kháng sinh Clostridium spp có thể thay đổi tùy theo thời

gian và địa điểm; tuy nhiên, hầu hết các chủng đều rất nhạy cảm với kháng sinh như

penicillin, chloramphenicol, metronidazole, amoxicillin, erythromycin

Chất khử trùng: Các chất khử trùng có thể giết chết bào tử Clostridium như rượu ethyl

và proply, 8% formaldehyde, 20 ppm sodium hypochlorite

Tác nhân vật lý: Mặc dù các bào tử Clostridium chịu được nhiệt độ cao nhưng theo

Slovis CM & Jones ID (1998) nghiên cứu khi đặt chúng ở nhiệt độ 800C trong 30 phút hoặc 1000C trong 10 phút thì các bào tử và cả độc tố sẽ bị tiêu diệt Dựa trên nghiên cứu của Segner ( 1971) cho thấy bào tử type C được báo cáo là dễ bị xử lý nhiệt nhất khi so sánh với các bào tử của type A và B, ngoài ra độc tố type C được sản sinh trong điều kiện kỵ khí ở nhiệt độ từ 100C đến 47°C với sản xuất độc tố tối ưu giữa 350C và 37°C

(Mitchell et al., 1987)

Đối với vi khuẩn C colinum, theo nghiên cứu của Berkhoff & H A (1991) và Cato et

al (1986) kết luận rằng C colinum thường nhạy cảm với tetracylin, chloramphenicol, clindamycin, erythromycin, penicillin G và bacitracin Trong tự nhiên, bào tử C colinum

có thể tồn tại trong môi trường đến 16 năm ở 20°C và có thể chịu được nhiệt độ ở 70°C trong 3 giờ, 80°C trong 1 giờ và 100°C trong 3 phút (Peckham & M C, 1960)

Ngoài ra, theo nhiều nghiên cứu cho kết quả khác nhau về tính mẫn cảm và đề kháng

của vi khuẩn Clostridium botulinum đối với kháng sinh, Robert (1974) và Sato (1987) kết luận rằng sự mẫn cảm và đề kháng của C botulinum phụ thuộc vào thời điểm và địa

phương khảo sát

2.2.6 Sự phân bố và những ảnh hưởng của vi khuẩn Clostridium spp trong tự nhiên Kết quả nghiên cứu của Poxton et al (2006) và Johnson et al (2007) cho thấy vi khuẩn Clostridium spp tập trung sinh sống chủ yếu ở đất, nước thải và trầm tích biển, đôi khi

có ở ruột của cả động vật và con người Một số loài khác của Clostridium có thể hiện

diện trong các vật liệu mục nát, xác các loài gặm nhấm nhỏ, xác chết con chim hoặc

trong phân bón Vì vậy, việc phân lập vi khuẩn Clostridium spp từ nhiều nguồn khác

nhau là rất cần thiết trong chăn nuôi thú y, nó góp phần hạn chế, giảm bớt được một phần

nào mối nguy hiểm cho sức khỏe của vật nuôi

Sự khuếch tán oxy trong đất là điều kiện cần thiết và quan trọng đối với vi khuẩn yếm

khí Vi khuẩn Clostridium thường ngừng phát triển trong sự hiện diện của O2, nhưng sự tăng trưởng lại tiếp tục khi nồng độ O2 nằm trong mức thích hợp của từng chủng Mức

độ giới hạn oxy cho sự tăng trưởng ở mỗi chủng khác nhau, một số chủng có thể chịu được nồng độ cao đến 3% O2 Các loại đất đại diện cho sự khuếch tán oxy trong đất tốt

là đất ruộng, đất phù sa, đất đầm lầy,…

Theo P W Inglett (2005) đất chua là do các ion NO3-, Fe3+, Mn2+… hoạt động, cùng với sự hình thành các acid hữu cơ trong quá trình phân giải xác động vật và các loại thực vật thủy sinh

2.3 Độc tố của vi khuẩn Clostridium spp

Phần lớn các vi khuẩn Clostridum không gây bệnh cho người và động vật, chỉ hơn 10 loài Clostridium có khả năng sinh độc tố, đáng chú ý là C botulinum, C perfringens, C tetani, C difficile và C colinum

2.3.1 Độc tố của vi khuẩn Clostridium botulinum

Botulin là một bệnh ngộ độc gây bại liệt do nuốt phải một loại độc tố được sản xuất bởi

vi khuẩn Clostridium botulinum

Nguyên nhân gây bệnh

Theo Holdeman & L V (1970) các yếu tố cần thiết cho một con vật bị ngộ độc là sự hiện diện của sinh vật gây bệnh, điều kiện môi trường thích hợp cho sự tăng trưởng và sản xuất độc tố, sự hấp thu chất độc và tính nhạy cảm của cơ thể đối với vật chủ

Nghiên cứu của Peck & MW (2009) cho thấy C botulinum có khả năng hình thành bào

tử khi gặp điều kiện bất lợi và chúng thường được tìm thấy trong đất Vì thế, khi động vật tìm kiếm thức ăn, vô tình chúng sẽ ăn các bào tử của vi khuẩn cùng với nước, đất và trầm tích Các bào tử của vi khuẩn khi vào cơ thể gặp điều kiện thích hợp sẽ phát triển

và gây bệnh cho vật chủ Theo thống kê của Rosen & M N (1971) trong các vụ dịch thì vịt là loài thường xuyên bị ảnh hưởng nhất

Cơ chế gây bệnh

Năm 1949, Burgen et al phát hiện ra rằng độc tố botulin tác động như một độc tố thần

kinh mạnh làm ức chế phóng thích acetylcholine Các độc tố ức chế hoạt động sản xuất

của acetylcholine trong các tế bào thần kinh kết nối tới các cơ, dẫn đến tê liệt của phổi hay các cơ vận động khác Độc tố thần kinh botulin đến thiết bị đầu cuối thần kinh ở các khớp thần kinh, nơi mà nó liên kết với các màng tế bào thần kinh, di chuyển vào trong

tế bào chất của các thiết bị đầu cuối sợi trục và ngăn chặn dẫn truyền qua synap, dẫn đến liệt mềm (Halpern & Neale, 1995)

Độc tố của Clostridium botulinum tác dụng qua 3 giai đoạn: kết nối, thâm nhập, ức chế

sự phóng thích chất dẫn truyền thần kinh Độc tố này không ảnh hưởng vào tổng hợp hay dự trữ acetylcholine nhưng ảnh hưởng vào sự phóng thích chất này ở sợi tận cùng đầu tiếp hợp

Hình 2: Cơ chế tác dụng của độc tố botulin

(Arnon et al., 2001)

2.3.2 Độc tố của vi khuẩn Clostridium perfringens

Vi khuẩn Clostridium perfringens phân bố rộng rãi trong tự nhiên, thường được tìm

thấy trong đất, nước và chất thải Vi khuẩn cũng thường cư trú trong đường tiêu hóa của các loài gia súc, gia cầm như dê, cừu, trâu, bò, heo, gà Chúng là nguyên nhân gây các bệnh nhiễm độc máu, viêm ruột tiêu chảy, hoại thư sinh hơi và gây ngộ độc thực

phẩm cho cả động vật và con người Điển hình C perfringens là nguyên nhân chính

gây ra bệnh viêm ruột hoại tử ở gà Đây là bệnh truyền nhiễm cấp tính, xảy ra đột ngột với tỷ lệ chết rất cao

Vi khuẩn có khả năng sản sinh độc tố, theo Hatheway (1990) cho thấy đã xác định

được 14 loại độc tố của vi khuẩn C perfringens gây bệnh, tuy nhiên chỉ có 4 loại chính

thường gặp là alpha, beta, epsilon, iota và được chia thành 5 type độc tố A, B, C, D và

E

Bảng 3: Bệnh do các type độc tố của Clostridium perfringens

tử

(Songer JG et al., 1998)

2.3.3 Độc tố của vi khuẩn Clostridium tetani

Uốn ván hay khóa hàm là một bệnh nhiễm trùng nghiêm trọng do vi khuẩn Clostridium tetani gây ra, vi khuẩn sản sinh ra độc tố ảnh hưởng đến não và hệ thần kinh Trong đó,

các độc tố dẫn đến cứng khớp trong cơ hàm cũng như các cơ khác, bệnh cũng có thể gây

ra co thắt cơ, khó thở nghiêm trọng và cuối cùng có thể gây tử vong

Cơ chế

Bào tử xâm nhập vào cơ thể thông qua bất kỳ loại tổn thương nào ở da, trong môi trường yếm khí, các bào tử sẽ nảy mầm và cuối cùng tạo thành bệnh nhiễm trùng do vi khuẩn hoạt động Các vi khuẩn sau đó tạo ra một ngoại độc tố gọi tetanospasmin, ảnh hưởng đến hệ thống thần kinh, các chất độc khác như tetanolepsin cũng được sản xuất, nhưng không đáng kể về mặt lâm sàng Cơ xương co do sự tắc nghẽn thần kinh điều tiết sự co

cơ, điều này dẫn đến sự co cơ liên tục và chủ yếu ở cơ cổ và cơ hàm Nếu không được điều trị sớm thì tỷ lệ tử vong của bệnh này rất cao

Các triệu chứng thường xuất hiện khoảng 10 ngày sau khi bị nhiễm, tuy nhiên điều này

có thể khác nhau từ 4 ngày đến khoảng 3 tuần và trong một số trường hợp có thể mất vài tháng Bệnh nhân có thời gian ủ bệnh ngắn hơn thì các triệu chứng bệnh sẽ nặng hơn

Độ cứng thường bắt đầu với các cơ nhai gây khóa hàm, co thắt cơ bắp sau đó lây lan đến

cổ họng gây khó nuốt, cổ và cơ ngực co cứng có thể dẫn đến việc thở khó khăn và gây

tử vong

Hình 3: Ảnh hưởng của Clostridium tetani trên vật nuôi

2.3.4 Độc tố của Clostridium difficile

Độc tố C difficile đã được phân lập từ phân của ít hơn 1% của 161 ngựa con khỏe mạnh

và 10% từ mẫu phân mắc bệnh tiêu chảy của ngựa con và ngựa trưởng thành, C difficile

đã được Beier et al (1994) kết luận rằng nó là nguyên nhân chính của bệnh tiêu chảy ở

động vật

C difficile có thể sản sinh ra độc tố, các độc tố thường gây viêm ruột nặng và nhiễm độc

đường ruột, xuất huyết được xem là bệnh tích phổ biến, manh tràng phình to, tiêu chảy

có máu và có khi gây tử vong

Nghiên cứu của Jones et al (1987 và 1988) cho kết quả ngựa con bị nhiễm bệnh thường

biểu hiện nặng ở ruột bị xuất huyết và hoại tử, triệu chứng đau bụng, suy nhược và mất nước Tử vong thường trong vòng 24 giờ sau khi bắt đầu có dấu hiệu lâm sàng, tỷ lệ tử vong trong các vụ dịch thường rất cao với con số lớn hơn 90%

Bệnh tiến triển nhanh chóng gây tiêu chảy cấp tính, các loài chim thường chết trong vòng

3 ngày kể từ ngày khởi phát triệu chứng

2.3.5 Độc tố của vi khuẩn Clostridium colinum

Viêm ruột loét (UE) là một bệnh nhiễm khuẩn cấp tính gây ra bởi C colinum ở gà non,

gà tây và các loài chim ở vùng cao, bệnh khởi phát đột ngột và gây tử vong nhanh chóng Chim thường chết sau 24-48h, ở những con có diễn biến lâm sàng dài hơn 7 ngày thường thấy cơ thể hốc hác và cơ ngực teo Theo nghiên cứu của Berkhoff & H A (1991) cho

thấy tỷ lệ tử vong đạt 100% ở chim cút non, trong khi ở gà trưởng thành khoảng 10%,

có khi lên đến hơn 30% (Tsai et al., 1986)

Từ các kết quả nghiên cứu của Peckham (1960, 1978) thông thường những con gia cầm

bị ảnh hưởng ở độ giữa 4 đến 15 tuần tuổi, sự xuất hiện của viêm ruột loét thường được xem là bệnh thứ phát sau một số bệnh chính như cầu trùng, thiếu máu, bệnh Gumboro

Kể từ khi nhiễm trùng tái diễn hàng năm ở một số nơi thì sự tồn tại của C colinum trong

đất đã được khẳng định

Phát hiện bằng kính hiển vi cho thấy các dấu hiệu bong tróc các tế bào biểu mô niêm mạc, phù nề thành ruột, ứ máu trong các mạch máu cục bộ và sự xâm nhập của các tế bào lympho

Tiêu chảy trắng thường xuất hiện, ủ rủ, chậm vận động, lờ đờ, lông xù, tiêu chảy ra máu cũng được quan sát thấy

Bệnh tích thường gặp là xuất huyết ở tá tràng, manh tràng hoại tử và loét, sự tắc nghẽn lách, xuất huyết, hoại tử cũng có thể xảy ra, các tổn thương thường không được thấy trong các cơ quan khác (Berkhoff & H A, 1991)

2.4 Bệnh do nhiễm độc tố của vi khuẩn Clostridium botulinum

2.4.1 Phân loại độc tố botulin

Độc tố botulin là một protein và là chất độc thần kinh sản xuất bởi các vi khuẩn

Clostridium botulinum, botulin có thể gây ngộ độc, một căn bệnh nghiêm trọng và đe

dọa tính mạng ở cả con người và động vật Các độc tố botulin có thể gây ra một căn bệnh bại liệt trạng thái bình thường nghiêm trọng ở người và động vật (Lindström, 2006) Tuy nhiên, độc tố của nó sẽ bị biến tính ở nhiệt độ lớn hơn 80°C và khi nhiệt độ thấp, cụ thể

là dưới 3°C sẽ làm chậm sự tăng trưởng của vi khuẩn Clostridium botulinum

Theo Peck et al (2011) và Shukla HD & Sharma SK (2005) vi khuẩn C botulinum được

chia thành bốn nhóm kiểu hình khác nhau (nhóm I-IV), bên cạnh đó dựa vào đặc tính của độc tố thần kinh mà vi khuẩn được phân thành 7 type (A- G) Bốn trong số các type (A, B, E và hiếm khi F) gây ngộ độc của con người, trong khi các type C, D và E gây bệnh ở động vật có vú, chim và cá Một độc tố thứ tám, type H được phát hiện bởi các nhà nghiên cứu tại Khoa Y tế cộng đồng California vào năm 2013, với một liều gây chết

là 2ƞg khi tiêm hoặc 13ƞg khi hít phải, nó được coi là chất độc nhất trên Trái Đất (MacKenzie & Debora, 2013)

Bảng 4: Các nhóm kiểu hình của Clostridium botulinum

Nhóm kiểu hình của Clostridium botulinum

Nhóm các chủng

Clostridium

sporogenes, putrificum

butyricum, beijerinickii

haemolyticum, novyi type A

subterminale,h aemolyticum

gây bệnh của con người, nhóm I sản xuất độc tố A, B hoặc F trong khi nhóm II sản xuất

độc tố B, E, F Theo nghiên cứu của Franciosa et al (1997) chỉ ra rằng có những loài sản xuất được một loại độc tố nhưng mang một gen im lặng khác, các chủng Clostridium khác, cụ thể là C butyricum và C baratii cũng được biết đến để sản xuất loại độc tố E

và F tương ứng

Kiểu hình, chủng C botulinum nhóm I và II khác nhau đáng kể Sinh vật nhóm I dường

như có nhiều ở gốc trên cạn, ở vùng khí hậu ôn đới, trong khi các chủng nhóm II, đặc biệt là type E, thường được tìm thấy trong môi trường thủy sản ở bán cầu phía Bắc Trong khi các bào tử nhóm I có khả năng chịu nhiệt cao và gây ra các vấn đề trong đóng hộp và bảo quản các loại rau, thịt thì các bào tử nhóm II có khả năng chịu nhiệt thấp hơn một chút lại là mối quan tâm lớn trong các loại thực phẩm chế biến đóng gói kệ ở nhiệt

độ lạnh

Theo Smith & L D (1975) các type gây bệnh ảnh hưởng con người chủ yếu là các type

A, B, E, F còn các type gây bệnh ảnh hưởng loài chim và động vật khác chủ yếu do các type A, C và E Động vật dễ bị ảnh hưởng nhất là loài chim hoang dã, gia cầm, gia súc, ngựa và một số loài cá

Mặc dù type G đã được phân lập từ đất ở Argentina nhưng không được công nhận là nguyên nhân gây bệnh

Bảng 5: Độc tố botulin và các loài ảnh hưởng chủ yếu

* Hiếm khi phát hiện trong tự nhiên; ít thông tin để đánh giá

(Tonie E Rocke & Milton Friend, 1999)

2.4.2 Ảnh hưởng của độc tố botulin trên người

Hatheway et al (1987) đã phân lập được vi khuẩn Clostridium botulinum type B và F từ

các trường hợp ngộ độc con người ở New Mexico và California

Bảng 6: Nhiệt độ phát triển của các type độc tố

* C argentinense được đề xuất cho nhóm này (Hatheway CL, 1995)

Liều gây độc: Đây là chất độc cấp tính nguy hiểm nhất được biết đến, với một con người

trung bình ước tính liều gây chết (LD-50) là 1,3-2,1ƞg/ kg khi tiêm tĩnh mạch hoặc tiêm

bắp và 10-13 ƞg/ kg khi hít vào (Arnon et al., 2001)

Nguyên nhân cái chết của bệnh là suy hô hấp do liệt cơ hô hấp, vì vậy việc điều trị bao gồm thuốc kháng độc và hô hấp nhân tạo cho đến khi độc tố thần kinh được thải ra ngoài hoặc được chuyển hóa Nếu bệnh được điều trị vào khoảng thời gian đầu, những phương pháp này có hiệu quả khá cao, tuy nhiên khi độc tố đã vào các tế bào thì việc sử dụng kháng huyết thanh không cho kết quả tốt Thỉnh thoảng, việc phục hồi chức năng có thể mất vài tuần đến vài tháng hoặc nhiều hơn

Có nhiều nguyên nhân gây ngộ độc botulin trên con người nhưng chủ yếu được chia thành 5 loại sau:

 Ngộ độc thực phẩm

Ngộ độc thực phẩm là việc tiêu thụ thực phẩm có chứa chất độc thần kinh được hình thành từ trước, tùy thuộc vào liều lượng chất độc và tình trạng cơ thể mà thời gian ủ bệnh có thể thay đổi từ 12 đến 72 giờ

Ngoài các dấu hiệu chung của bệnh ngộ độc, các triệu chứng về tiêu hóa như buồn nôn, nôn và táo bón Việc điều trị chủ yếu là chăm sóc triệu chứng chuyên sâu, bao gồm hỗ trợ hô hấp

Nghiên cứu của Sobel et al (2004) cho thấy ở các nước phát triển, tỷ lệ tử vong của bệnh

ngộ độc thực phẩm là từ 5 đến 10% Một cuộc khảo sát vào năm 1995 về các trường hợp ngộ độc thực phẩm trên toàn thế giới của Hatheway & C L (1995) cho kết quả hơn một nửa các trường hợp (52%) là do độc tố type B, tương ứng với các type A và E chiếm 34% và 12% Trong những trường hợp hiếm, độc tố type F có liên quan đến ngộ độc

thực phẩm (Harvey et al., 2002)

Hình 4: Các báo cáo về ngộ độc thực phẩm do botulin ở Mỹ trong năm 1988 đến 1995

Hai kháng độc tố botulin chính có sẵn để điều trị ngộ độc thực phẩm

• Hóa trị ba (A, B, E) thuốc kháng độc botulin có nguồn gốc từ các nguồn kháng thể ngựa (Fab và Fc) Thuốc kháng độc này có sẵn từ các cơ sở y tế địa phương thông qua CDC tại Mỹ

• Thuốc kháng độc thứ hai là Heptavalent (A, B, C, D, E, F, G)

 Ngộ độc trẻ sơ sinh

Trong hầu hết các trường hợp ngộ độc ở trẻ sơ sinh, nguyên nhân gây độc chưa rõ nhưng với nghiên cứu của Franciosa (2002) cho thấy 15% các trường hợp có liên quan đến mật

ong, mật ong có thể chứa một số lượng lớn bào tử C botulinum Có nhiều báo cáo từ các

nước trên thế giới, hầu hết các trường hợp được báo cáo ở Mỹ, các type độc tố chủ yếu

ở những trường hợp này là A và B

Ngộ độc thường xảy ra ở trẻ em dưới một tuổi và chủ yếu là những trẻ nhỏ sáu tháng

tuổi trở xuống Do ruột của trẻ nhỏ còn yếu chưa hoạt động mạnh, vì thế bào tử C botulinum có thể nảy mầm và hình thành độc tố trong ruột

Triệu chứng

Các báo cáo của Johnson et al (1979) cho thấy các biểu hiện lâm sàng của ngộ độc trẻ

sơ sinh thay đổi từ cận lâm sàng đến cái chết đột ngột, triệu chứng thường bắt đầu với táo bón, có thể kéo dài nhiều ngày, tiếp theo là liệt mềm, biểu hiện đặc biệt là sự giảm

ăn do suy yếu cơ bắp ở miệng và cổ họng, liệt cơ mặt và liệt mí mắt

Điều trị

Không khuyến khích sử dụng thuốc kháng sinh ở trẻ sơ sinh bị ngộ độc, bởi vì như thế

sẽ làm tăng nguy cơ hàm lượng độc tố trong máu Trong thí nghiệm mô hình chuột và

dựa trên kinh nghiệm, Wang YC et al (1984) cho kết quả kháng sinh aminoglycosid sẽ

làm tăng sự phong tỏa thần kinh cơ, bên cạnh đó, thuốc tẩy có chứa magie nên tránh bởi

vì có những báo cáo cho rằng tăng nồng độ magie có thể làm tăng tác động của độc tố

botulin (Shapiro RL et al., 1998)

Việc điều trị chủ yếu cho bệnh ngộ độc ở trẻ sơ sinh là chăm sóc hỗ trợ, đặc biệt chú ý tập trung vào dinh dưỡng của trẻ và hô hấp, theo thống kê của Trung tâm Kiểm soát và Phòng ngừa Dịch bệnh (1998) tỷ lệ tử vong ít hơn 2%

 Ngộ độc vết thương

Trong số 40 trường hợp được công bố trong các tài liệu của Mechem CC & Walter FG, (1994) về ngộ độc botulin ở người cho thấy 78% nguyên nhân liên quan đến vết thương, trong đó có trầy xước, gãy xương hỡ, vết rách, vết thương đâm thủng và áp- xe

Khi nạn nhân bị vết thương sâu hoặc vết áp- xe, nơi vết thương sẽ hình thành môi trường

yếm khí, tạo điều kiện thích hợp cho bào tử C botulinum nảy mầm và phát triển

Kết quả lâm sàng tương tự như ngộ độc thực phẩm nhưng không có biểu hiện của đường tiêu hóa

Thời gian ủ bệnh trung bình là 7 ngày Việc điều trị ngoài hỗ trợ hô hấp còn phải thực hiện việc phẫu thuật mở rộng vết thương, thuốc kháng sinh và thuốc kháng độc Các ước tính tỷ lệ trường hợp tử vong là 15% (Hatheway & C L, 1995) Giai đoạn phục hồi chậm, thuốc kháng độc có thể cần phải sử dụng nhiều lần

Hình 5: Ngộ độc vết thương do botulin

Các hình ảnh trên là chân của một người đàn ông được chẩn đoán bị ngộ độc Trong năm ngày trước khi ông được đưa vào bệnh viện, ông bắt đầu bị buồn nôn, nôn, nhìn mờ, khó khăn trong việc nói và suy nhược cơ thể Trong hai ngày trước khi ông vào viện, xuất hiện các dấu hiệu như nhìn đôi, khó thở, các triệu chứng nặng khác là liệt cơ vận động, liệt mắt (ophthalmoplegia), sụp mí mắt (Trung tâm Kiểm soát và Phòng ngừa dịch bệnh, 2008)

 Ngộ độc người lớn

Nguyên nhân chủ yếu gây ngộ độc ở người lớn là do hệ thực vật đường ruột thay đổi bởi phẫu thuật bụng, trong khi một nguyên nhân khác được đề cập là do điều trị kháng sinh kéo dài hoặc vết thương đường tiêu hóa và áp- xe Bệnh ngộ độc này rất hiếm xảy ra, bên cạnh đó các triệu chứng lâm sàng cũng giống như ngộ độc trẻ sơ sinh

Đặc điểm lâm sàng của trường hợp ngộ độc nhiềm khuẩn ở người lớn tương tự như ngộ độc thực phẩm trừ các triệu chứng tiêu hóa ban đầu

Trường hợp nghiên cứu của Hatheway CL (1995) ở hai bệnh nhân có dấu hiệu và triệu

chứng của ngộ độc lâm sàng đã được phân lập có sự hiện diện của C botulinum type A

trong 119 và 130 ngày sau khi bệnh được khởi phát Điều này cũng đã được mô tả với

tỷ lệ nhiễm lớn trong những năm gần đây

 Ngộ độc vô ý

Trường hợp này đã được báo cáo ở những bệnh nhân đã từng có lịch sử tiêm độc tố botulin type A vào cơ thể, đặc biệt là vào các bắp thịt lớn cho tác dụng toàn thân Hơn thế, theo Cherington M (1998) cho biết nhiều trường hợp gần đây của ngộ độc gây ra bởi việc sử dụng chất độc botulin để điều trị chứng loạn ngôn ngữ và các rối loạn vận động

khác Ở những trường hợp khi bệnh nhân có tật vẹo cổ và có sử dụng độc tố botulin type

A để điều trị, khi tiêm độc tố vào cơ bắp cổ có thể độc tố thâm nhập vào các cơ bắp hầu

xung quanh

Việc sử dụng điều trị của độc tố botulin cần thận trọng đặc biệt ở những bệnh nhân bị rối loạn cơ dẫn truyền thần kinh và ở những bệnh nhân được điều trị đồng thời với aminoglycosid

Các trường hợp khác của ngộ độc botulin là do sự hít vào và có thể do khí dung của các chất độc thần kinh Một vài trường hợp ở người đã được báo cáo bởi Holzer & V E (1962)

Báo cáo của Anonymous (2004) cho thấy một trường hợp đặc biệt của bệnh ngộ độc do thầy thuốc bởi việc điều trị độc tố botulin vụng về gây ra ngộ độc bốn người ở Florida vào tháng Mười năm 2004

Hình 6: Triệu chứng ngộ đôc botulin trên người

Những bức ảnh chụp một người đàn ông 17 tuổi với ngộ độc nhẹ

Hình A cho thấy bệnh nhân trong trạng thái bình thường nhưng hình B là khi bệnh nhân được yêu cầu

cười to, độc tố botulin làm cho người đàn ông bị giãn đồng tử, sụp mí mắt, mất nếp nhăn (Arnon SS et al., 2001)

2.4.3 Ảnh hưởng của độc tố botulin trên động vật

Những bào tử của vi khuẩn Clostridium botulinum bản thân là vô hại nhưng khi trong

điều kiện yếm khí và các yếu tố môi trường thuận lợi sẽ giúp chúng nảy mầm, phát triển

và tiết độc tố Trong đó, Hatheway CL (1995) đưa ra kết quả phân lập các chất độc liên quan trong các trường hợp ngộ độc ở động vật đã được xác định type C và D

Nguyên nhân

Các độc tố được sản xuất bởi vi khuẩn Clostridium botulinum, những vi khuẩn này

thường được tìm thấy trong đất, thực vật mục nát, thực phẩm hoặc xác súc vật, nơi mà

chúng có thể phát triển và sản xuất chất độc Ngộ độc xảy ra khi chim ăn thức ăn hoặc uống nước có chứa độc tố gây ngộ độc, các độc tố sau khi vào cơ thể sẽ tác động lên hệ thần kinh của động vật, gây suy yếu và tê liệt

Theo Trung tâm Sức khỏe Động vật Hoang dã Quốc gia cho biết một số yếu tố môi trường bao gồm pH, độ mặn, nhiệt độ, tiềm năng oxy hóa khử trong các trầm tích và cột nước sẽ gây ảnh hưởng đáng kể đến khả năng bùng phát ngộ độc ở vùng đất ngập nước Trong đó, các dấu hiện dễ thấy bên ngoài thường gặp là:

 Tính mùa vụ

Theo thống kê ở Hoa Kỳ và Canada, các vụ bùng phát dịch bệnh ngộ độc type C chủ yếu

ở tháng bảy đến tháng chín là tháng chủ yếu cho type C bùng phát ở Hoa Kỳ và Canada Tuy nhiên, các vụ dịch cũng có thể xuất hiện ở cuối tháng mười hai và tháng giêng, thỉnh thoảng là đầu mùa xuân ở các vùng phía nam của Hoa Kỳ và California

độc tố vi khuẩn Clostridium botulinum type E ở loài chim

Ngộ độc type C có xu hướng xảy ra phổ biến vào mùa mưa và khi ngập lụt xảy ra, vùng đất ngập nước và thoát nước, thuốc trừ sâu có thể giết chết đời sống thủy sinh, qua đó cung cấp cho việc sản xuất độc tố, nước thải và các cây mục nát là nguồn độc tố tiềm năng, khi các loài chim tìm kiếm thức ăn, chúng ăn phải thực phẩm hư thối, cây mục nát,

Cao Trung bình

Thấp

xác của một con chim chết, động vật nhỏ (như một con chuột chết) có chứa độc tố và dễ mắc bệnh Thêm vào đó, khi đất ẩm ướt thì lượng oxy trong đất thấp bởi sự che chắn các khe hở bằng nước, việc đó làm oxy không thể tiếp xúc đi sâu vào lòng đất tạo môi trường yếm khí thuận lợi cho các vi khuẩn trong đất phát triển và sản xuất độc tố

khuẩn Clostridium botulinum type C trong các loài chim ở Malles Venosta Trường hợp

ngoại lệ là kền kền do chúng có khả năng chống độc tố type C

Biểu hiện lâm sàng ở chim

Ở loài chim, sự liệt mềm tiến triển từ chân, cánh, cổ và mí mắt Ban đầu, những con chim

bị ảnh hưởng thường không thể bay và có thể tìm thấy chúng với biểu hiện lười vận

động, dáng đi khập khiễng, cánh rũ xuống

Chim nước không thể ngẩng đầu lên và kết quả là thường bị chết đuối Đôi khi chim được tìm thấy đã chết và không có bằng chứng về sự chống cự, không có tiêu chảy, chảy nước mũi và dấu hiệu của chấn thương Thường thì các loài chim trong cùng một đàn sẽ

bị ảnh hưởng cùng một lúc, đặc biệt là những con mạnh nhất và lớn nhất Điều này được giải thích do thói quen tranh giành thức ăn của các loài chim, khi xuất hiện con mồi những con khỏe mạnh trong đàn có xu hướng tranh nhau thức ăn, khi đó thì các con nhỏ

sẽ bị đẩy ra xa

Biểu hiện lâm sàng ở gia súc

Gia súc trong giai đoạn đầu của bệnh có biểu hiện ủ rủ, miễn cưỡng di chuyển, đôi khi táo bón có thể xảy ra ở giai đoạn này, khó nuốt cũng xuất hiện trong hầu hết trường hợp nhưng không phải tất cả Khi tình trạng tê liệt tiến triển mạnh, chúng không thể ăn và uống, nằm nghiêng sang một bên thở bụng, lưỡi có thể sẽ mất đi phản ứng và trở nên

hoàn toàn bị tê liệt Nghiên cứu của Sharpe AE et al năm 2008 cho thấy thêm các dấu

hiệu lâm sàng khác bao gồm chứng bại liệt có thể xuất hiện, tiêu chảy, chảy nước miếng, trào ngược và nôn

Biểu hiện lâm sàng trên cá

Một khi cá bị nhiễm với botulin type E chúng có thể bị ảnh hưởng đến trạng thái cân bằng, một con cá bị nhiễm thường chúng bơi gần mặt nước và sẽ nổi với cái đầu của nó hướng lên bề mặt và đuôi hạ xuống bên dưới Cá nhiễm thường chết rất nhanh và có thể nhìn thấy chúng trôi dạt vào bờ

Biểu hiện lâm sàng trên chuột

Theo nghiên cứu của Trung tâm Kiểm soát và Ngăn ngừa dịch bệnh (1998) cho thấy những con chuột với các dấu hiệu điển hình của ngộ độc botulin bao gồm yếu cơ và suy

hô hấp, những triệu chứng này thường xuất hiện trong vòng một ngày nhưng có khi cũng

có thể vài ngày mới xuất hiện Bên cạnh đó, với nghiên cứu về độc lực của botulin trên chuột của Nguyễn Đức Hiền (2012) cho kết quả 15% gây ảnh hưởng tới tim và 10% liên quan vấn đề ở phổi

Theo Deprez (2006) các biểu hiện khác có thể xảy ra như khô miệng, tắc ruột hoặc tiêu

chảy, bí tiểu và sự thay đổi của nhịp tim Ngoài ra nghiên cứu của Johnson AL et al

(2010) cho thấy ngộ độc type C có thể xuất hiện các triệu chứng rõ hơn như giãn đồng

tử với mức độ nhiều hơn, dấy hiệu khó thở nặng hơn các type khác

 Điều trị

Không có điều trị đặc hiệu cho ngộ độc, chim ảnh hưởng nhiều nhất sẽ dẫn đến cái chết Nguyên nhân chết chủ yếu do liệt cơ hô hấp Đối với những loài chim ăn chỉ với một lượng nhỏ độc tố thì có thể sống nếu như chúng được chăm sóc cẩn thận cho đến khi chất độc loại thải