Chuẩn bị chuồng nuôi chuột, trấu, thức ăn, nước uống….
Chuồng nuôi được thiết kế bằng các hộp nhựa hình chữ nhật, bên trên nắp hộp được đục các lỗ nhỏ nhằm tạo không khí lưu thông. Nắp hộp được trang trí màu, còn lại toàn thân hộp trong suốt nên ta có thể dễ dàng quan sát chuột từ bên ngoài mà không phải mở nắp hộp ra vô nhiều lần gây kích động chuột.
Nền chuồng được lót bằng trấu đã sấy khô và tiệt trùng nhằm hạn chế các tác động bên ngoài ảnh hưởng đến kết quả thử độc lực.
Hình 15: Kết quả kháng sinh đồ (1) (5) (4) (3) (2) (1): Norfloxacin (2): Erythromycin (3): Tetracyline (4): Penicillin (5): Trimethoprime
35
Thức ăn, nước uống được cung cấp từ một nguồn giống nhau và cùng điều kiện nuôi dưỡng, chăm sóc, với mỗi chuồng đặt một đĩa thức ăn và chai nước uống riêng, tránh để lẫn lộn. Nước uống được đặt trong chai nhựa có ống thông nên chuột có thể chủ động trong việc uống.
Việc thay trấu được thực hiện hằng ngày vào buổi sáng, khẩu phần ăn 5g/con/ngày, mỗi ngày cho ăn 2 lần sáng và chiều. Nước uống được thay 2 lần/ tuần.
3.2.5.2 Phương pháp lấy mẫu
Từ 40 mẫu dương tính với vi khuẩn Clostridium spp. có 8 mẫu là vi khuẩn Clostridium botulinum, ta tiến hành lấy 8 mẫu đó tiếp tục thử độc tố botulin trên chuột bạch.
Quy trình tiến hành
Sử dụng tăm bông bắt hết khuẩn lạc cho vào 2,5ml nước muối sinh lý 0,9% đã tiệt trùng rồi để yên trong vòng 2 giờ ở nhiệt độ thường.
Ly tâm 12000 vòng/phút trong vòng 20 phút.
Lọc, chia phần dịch bệnh phẩm sau khi lọc làm 2 phần bằng nhau, mỗi phần 1ml. Phần thứ nhất (lô I) không đun, cho thêm 100UI penicillin và 100µg streptomycin
cho 1ml dung dịch bệnh phẩm
Phần thứ hai (lô II ) được xử lý nhiệt ở 1000C trong 30 phút. 3.2.5.3 Phương pháp tiến hành thí nghiệm
Mỗi chủng vi khuẩn Clostridium botulinum tiến hành trên 2 lô (mỗi lô 2 con) tiêm vào xoang bụng chuột với liều 0,5ml/ con. Theo dõi các triệu chứng có thể xảy ra đối với chuột thí nghiệm trong vòng 7 ngày sau khi tiêm.
Cách đọc kết quả
Chuột lô I sẽ xuất hiện các triệu chứng bất thường hoặc chết. Chuột lô II sống bình thường và không có biểu hiện khác thường. Các chỉ tiêu theo dõi sự bất thường của chuột:
- Khả năng vận động, - Tính nhanh nhẹn, lanh lợi, - Nhịp thở,
- Chế độ ăn uống…
Nếu trong thời gian theo dõi bệnh mà chuột chết thì ta ghi lại thời gian chết và tiến hành mổ khám, quan sát bệnh tích trên toàn bộ cơ thể. Ghi nhận cẩn thận các bệnh tích đó.
36
3.2.6 Phương pháp xử lý số liệu
Số liệu được xử lý bằng phương pháp thống kê phân tích và sử dụng phần mềm Excel và Minitab 16,0 (Chi-quare Yates).
Bệnh phẩm có độc tố botulin
Sơ đồ 2: Quy trình thử độc tố trên chuột thí nghiệm
Tiêm vào xoang bụng 2 chuột thí nghiệm 0,5ml/con (lô I)
Tiêm vào xoang bụng 2 chuột thí nghiệm 0,5ml/con (lô II)
2 chuột lô I xuất hiện các triệu chứng bất thường hoặc chết trong khi 2 chuột lô I sống bình thường và không có biểu hiện khác thường
Để 2 giờ ở nhiệt độ bình thường (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Ly tâm 12000 vòng/phút trong 20 phút
Thu tất cả khuẩn lạc vào ống nghiệm có sẵn 2,5ml nước muối sinh lý 0,9%
Lọc, chia làm 2 phần
Xử lý nhiệt ở 1000C/30 phút
Không đun và thêm penicillin+streptomycin
37
Chương 4
KẾT QUẢ THẢO LUẬN
4.1 Tổng quan về địa điểm lấy mẫu
Phú Tân nằm trên cù lao Kết giống hình con Quy giữa hai con sông lớn, đó là sông Tiền và sông Hậu, là một trong 04 huyện cù lao của tỉnh An Giang thuộc vùng đồng bằng phù sa màu mỡ, với hệ thống sông ngòi chằng chịt, có thế mạnh kinh tế là sản xuất nông nghiệp, thuận lợi cho việc phát triển trồng trọt, nhất là cây nếp và nuôi trồng thủy sản (đất trồng trọt hơn 24.000 ha). Ngoài ra, giao thông đường bộ có tuyến tỉnh lộ 954 chạy qua, đường thủy tiếp giáp với 03 sông lớn (sông Tiền, sông Hậu và sông Vàm Nao) tạo điều kiện thuận lợi cho giao thương hàng hóa, góp phần quan trọng trong phát triển kinh tế - xã hội của địa phương.
Châu Phú tuy là vùng đất được khai khẩn sau nhưng lại có vị trí quan trọng. Đây là vùng có kênh rạch chằng chịt, đất đai màu mỡ, phong phú về cá, tôm, lúa, gạo… con người nơi đây khi xưa sống bằng nghề nuôi tôm, cá, dần dần về sau đổi sang trồng bông vải, kế đến là lúa thóc. Đồng thời kênh Vĩnh Tế là đường giao thông chiến lược nối liền Châu Đốc- Hà Tiên, một công trình thủy lợi phục vụ khai hoang và phát triển kinh tế- xã hội, tạo cơ sở hình thành nhiều cụm dân cư. Việc khai khẩn đất và sản xuất lúa gạo gia tăng, hứa hẹn một tiềm năng kinh tế nông nghiệp dồi dào. Giao thông thuận lợi đẩy mạnh hoạt động thương mại, chủ yếu là lúa gạo và sản phẩm nông nghiệp. Điển hình là chợ Cái Dầu được hình thành từ rất sớm, đến năm 1930 trở nên sung túc và trở thành một trung tâm thương mại giao lưu rộng rãi với các nơi về lúa, bắp, đậu… Năm 1935, núi Sam (Vĩnh Tế) trở thành trung tâm phân phối trâu, bò miền Tây, tổ chức chợ phiên 1 năm 2 lần (http://www.angiang.gov.vn).
38
4.2 Kết quả phân lập vi khuẩn Clostridium spp. trong đất ruộng tại huyện Phú Tân và Châu Phú tỉnh An Giang
Bảng 9: Tỷ lệ nhiễm vi khuẩn Clostridium spp. trong đất tại huyện Phú Tân và Châu Phú tỉnh An Giang
Địa điểm Tổng số mẫu kiểm tra Số mẫu nhiễm Tỷ lệ (%)
Phú Tân 36 33 91,67a
Châu Phú 10 7 70,00a
Tổng 46 40 86,96
Nhũng số trong cùng 1 cột mang chữ số mũ khác nhau thì khác nhau có ý nghĩa thống kê (P< 0,05).
Kết quả ở bảng 9 cho thấy từ 46 mẫu đất kiểm tra có 40 mẫu dương tính với vi khuẩn
Clostridium spp. chiếm 86,96%. Tỷ lệ nhiễm này rất cao, chứng tỏ vi khuẩn Clostridium spp. hiện diện nhiều trong các vùng đất chăn thả vịt chạy đồng, đây cũng là một trong số các nguyên nhân chính gây nên các dịch bệnh “cúm cần” ở vịt trên 2 địa phương này. Tỷ lệ nhiễm vi khuẩn Clostridium spp. cao được giải thích là do khi có sinh vật chết, xác các loài động, thực vật bị vùi lấp vào đất và bị phân hủy sẽ làm tăng mức độ trầm tích của đất, đồng thời tăng tính acid tạo điều kiện thuận lợi cho vi khuẩn phát triển và tồn tại trong đất. Các vi khuẩn này có khả năng trở thành bào tử, bào tử tồn tại được trong môi trường đất một thời gian dài và gây bệnh cho động vật qua việc động vật sống ăn phải các bào tử của vi khuẩn cùng với nước, đất và trầm tích. Ngoài ra, tỷ lệ nhiễm cũng phụ thuộc vào thời gian thu thập mẫu, mẫu được lấy từ tháng 7 đến tháng 11 khi nhiệt độ môi trường cao, đây là nhiệt độ thích hợp cho sự phát triển của vi khuẩn, theo Mitchell
et al. (1987) cho biết vi khuẩn sẽ sản sinh ra độc tố mạnh nhất khi được đặt trong môi trường có nhiệt độ giữa 350C và 37°C. Bên cạnh đó, khi vào mùa mưa trầm tích đất cao sẽ làm giảm lượng oxy hòa tan, sự hiện diện của các vật chất hữu cơ cũng có thể làm tăng nguy cơ bùng phát ngộ độc. Thêm vào đó, đối với huyện Phú Tân và Châu Phú là nơi đã từng xảy ra dịch bệnh nên sự tồn tại của các vi khuẩn là rất cao.
Kết quả phân lập bảng trên phù hợp với nghiên cứu của Johnson et al. (2007) cho thấy vi khuẩn Clostridium được tìm thấy nhiều trong đất, phân, nước thải và trầm tích biển, vì thế sự hiện diện của Clostridium spp. trong môi trường đất là nguồn lây bệnh chủ yếu cho các gia súc, gia cầm khỏe.
Theo bảng, tỷ lệ nhiễm của vi khuẩn Clostridium spp. tại huyện Phú Tân là 91,67% và tại huyện Châu Phú là 70,00%. Tuy nhiên, sự sai khác giữa 2 địa phương này không có ý nghĩa thống kê. Việc này do vị trí địa lý gần kề nhau nên có sự giống nhau về điều kiện
39
khí hậu, nhiệt độ, sự tương đồng về các yếu tố môi trường như chất lượng đất, độ ẩm, kim loại nặng, độ pH, mức độ lưu thông nước trên các sông…
4.3 Kết quả phân lập các chủng vi khuẩn Clostridium spp. thông qua các đặc tính sinh hóa sinh hóa
Bảng 10: Tỷ lệ nhiễm các chủng vi khuẩn Clostridium từ các mẫu đã phân lập
Chủng vi khuẩn Số mẫu kiểm tra Số mẫu nhiễm Tỉ lệ (%)
C. botulinum 46 8 17,39a (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
C. colinum 46 32 69,57a
Khác 46 6 13,04b
Nhũng số trong cùng 1 cột mang chữ số mũ khác nhau thì khác nhau có ý nghĩa thống kê (P< 0,05).
Kết quả xác định các chủng vi khuẩn Clostridium spp. bằng phản ứng sinh hóa ở bảng 10 cho thấy trong 46 mẫu đất kiểm tra có 32 mẫu phân lập được vi khuẩn Clostridium colinum chiếm tỷ lệ cao nhất (69,57%), kế đến 8 mẫu là vi khuẩn Clostridium butulinum
(17,39%) và 6 mẫu (13,04%) chưa định type. Sự sai khác giữa tỷ lệ nhiễm chủng vi khuẩn C. colinum và C. botulinum không có ý nghĩa thống kê (P> 0,05). Tỷ lệ nhiễm vi khuẩn Clostridium botulinum là khá cao (17,39%), điều này cho thấy đây là nguy cơ gây bệnh cho các đối tượng vật nuôi, đặc biệt là vịt khi chúng sục tìm thức ăn trong đất, cây cỏ, nước, Clostridium botulinum sản sinh độc tố, nhất là độc tố botulin type C và D. Sự hiện diện của Clostridium botulinum trong đất cao được Peck (2009) giải thích là do vi khuẩn C. botulinum có khả năng sản xuất bào tử có thể chịu được các điều kiện bất lợi mà vi khuẩn khác không thể. Ngoài ra C. botulinum còn là vi khuẩn sống hoại sinh từ các chất hữu cơ do xác động, thực vật thối rữa có trong bùn và đất.
Tương tự vi khuẩn C. colinum cực kỳ kháng với các chất hóa học và thay đổi vật lý, bào tử C. colinum vẫn còn có thể hoạt động sau 16 năm ở 200C (Peckham, 1960). Do đó, C. botulinumvà C. colinum hiện diện thường xuyên ở những nơi trước đây đã t ừ n g x ả y r a bệnh và môi trường có nhiều chất hữu cơ.
Kết quả trên phù hợp với nghiên cứu của Trương Minh Trung (2013) từ các mẫu đất xét nghiệm cho thấy sự xuất hiện của vi khuẩn Clostridium colinum (31,25%) cao hơn vi khuẩn Clostridium botulinum (0% ). Tuy nhiên, tỷ lệ nhiễm C. botulinum này lại thấp hơn so với nghiên cứu của Nguyễn Đức Hiền (2012) tại thành phố Cần Thơ (25,71%). Từ các kết quả so sánh trên cho thấy các tính chất của đất, mức độ trầm tích, mức độ sông ngòi, tình hình dịch bệnh và cách phòng ngừa, điều trị bệnh ở mỗi nơi khác nhau cũng ảnh hưởng đến tỷ lệ nhiễm của 2 chủng vi khuẩn này.
40
4.4 Kết quả kiểm tra độ nhạy của vi khuẩn Clostridium spp. phân lập được đối với một số loại kháng sinh một số loại kháng sinh
Tiến hành lấy đại diện 22 mẫu từ 40 mẫu dương tính với vi khuẩn Clostridium spp. thực hiện kiểm tra kháng sinh đồ của vi khuẩn Clostridium spp. với một số loại kháng sinh.
4.4.1 Kết quả kháng sinh đồ của vi khuẩn Clostridium spp. phân lập được đối với một số loại kháng sinh
Bảng 11: Kết quả kháng sinh đồ của vi khuẩn Clostridium spp. phân lập được đối với một số loại kháng sinh STT Kháng sinh Số mẫu kiểm tra Nhạy Trung bình Kháng Số mẫu nhiễm Tỷ lệ (%) Số mẫu nhiễm Tỷ lệ (%) Số mẫu nhiễm Tỷ lệ (%) 1 Tetracyline 22 15 68,18 6 27,27 1 4,55 2 Erythromycin 22 10 45,46 8 36,36 4 18,18 3 Norfloxacin 22 22 100 0 0 0 0 4 Penicillin 22 0 0 0 0 22 100 5 Trimethoprime 22 0 0 0 0 22 100
Kết quả ở bảng trên cho thấy, vi khuẩn Clostridium spp. nhạy cảm cao nhất với norfloxacin (100%), kế đến là tetracyline (68,18%), tiếp theo là erythromycin (45,46%) và vi khuẩn đã có sự kháng thuốc cao nhất đối với pennicillin và trimethoprime (100%), tiếp theo là erythromycin (18,18%). Qua bảng ta kết luận vi khuẩn Clostridium spp.
kháng hoàn toàn với penicillin và trimethorime, điều này được giải thích do đây là dạng kháng sinh phối hợp giá rẻ được nhiều người chăn nuôi chuyên dùng để phòng ngừa và trị bệnh phổ biến cho vật nuôi, điều đó đã tạo sự đề kháng cho vi khuẩn Clostridium spp.
Tuy nhiên cũng theo Johnson et al (2007) tính nhạy cảm với kháng sinh của Clostridium spp. có thể thay đổi theo thời gian và địa điểm lấy mẫu. Từ kết quả phân lập được ta có thể sử dụng các kháng sinh còn mẫn cảm này để nhằm tiêu diệt vi khuẩn, hạn chế dịch bệnh.
41
4.4.2 Kết quả kháng sinh đồ của các chủng vi khuẩn Clostridium phân lập được với một số kháng sinh số kháng sinh
Bảng 12: Kết quả kháng sinh đồ của các chủng vi khuẩn Clostridium phân lập được với
một số kháng sinh STT Kháng Sinh C. botulinum (N= 8) C. colinum (N= 14) N TB K N TB K 1 Tetracyline 62,50 37,50 0 71,43 21,43 7,14 2 Erythromycin 37,50 62,50 0 50 21,43 28,57 3 Norfloxacin 100 0 0 100 0 0 4 Penicillin 0 0 100 0 0 100 5 Trimethoprime 0 0 100 0 0 100
Qua kết quả ở bảng 12 cho thấy cả 2 chủng vi khuẩn phân lập đều mẫn cảm rất cao với norfloxacin (100%), kết quả này phù hợp với nghiên cứu của Nguyễn Đức Hiền (2012) cho kết quả vi khuẩn Clostridium botulinum mẫn cảm cao với norfloxacin (80%). Tính nhạy cảm đối với kháng sinh của vi khuẩn Clostridium colinum cao hơn vi khuẩn
Clostridium botulinum với tỷ lệ lần lượt là 71,43% và 62,5% (kháng sinh tetracyline), 50% và 37,5% (kháng sinh erythromycin). Điều này phù hợp với nghiên cứu của Berkhoff & H. A (1991) và Cato et al. (1986) cho biết C. colinum thường nhạy cảm với tetracycline và erythromycin. Và theo nhiều nghiên cứu của Robert (1974) và Sato (1987) đã chứng minh rằng tính đề kháng và mẫn cảm của C. botulinum đối với kháng sinh phụ thuộc vào thời điểm và địa phương khảo sát.
Tuy nhiên, cả 2 chủng vi khuẩn đều kháng hoàn toàn với penicillin và trimethromycin. Điều này cho thấy cả 2 chủng vi khuẩn Clostridium đều đã có tiếp xúc với 2 loại kháng sinh này, việc đó tạo nên sức đề kháng cho vi khuẩn đối với 2 loại kháng sinh này.
4.4.3 Tính đa kháng của vi khuẩn Clostridium spp. đối với kháng sinh
Từ kết quả kháng sinh đồ của vi khuẩn Clostridium spp., ta tiến hành lập bảng tính đa kháng của vi khuẩn Clostridium spp. phân lập được đối với một số loại kháng sinh.
42
Bảng 13: Tính đa kháng của vi khuẩn Clostridium spp. phân lập được đối với một số loại kháng sinh Kháng sinh Tổng mẫu kiểm tra Số lượng mẫu kháng Tỷ lệ (%)
Tetracyline, erythromycin, penicillin, trimethoprime 22 1 4,55
Erythromycin, penicillin, trimethoprime 22 4 18,18
Penicillin, trimethoprime 22 22 100
Theo kết quả bảng 13 cho thấy từ 22 mẫu đại diện của vi khuẩn Clostridium spp. phân lập được cho 1 mẫu kháng với cả 4 loại kháng sinh (tetracyline, erythromycin, penicillin, trimethoprime) chiếm 4,55%, 4 mẫu cho kết quả kháng với 3 loại kháng sinh (erythromycin, penicillin, trimothoprime) chiếm 18,18% và 22 mẫu hoàn toàn kháng với 2 loại kháng (penicillin và trimethoprime) chiếm 100%. Qua đó có thể suy luận, mặc dù vi khuẩn Clostridium spp. tồn tại nhiều trong đất, bùn… nhưng cũng chịu rất nhiều sự tác động của kháng sinh. Từ đó cho ta thấy hiện tượng kháng, đa kháng của vi khuẩn đối với kháng sinh ở vùng chăn thả vịt chạy đồng nói riêng cũng như vùng chăn nuôi gia súc, gia cầm nói chung đang ngày càng gia tăng, đang là mối quan tâm của nhiều nhà nghiên cứu và là nỗi lo của người dân. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
4.5 Kết quả thử độc tố botuin trên chuột thí nghiệm
Từ kết quả phân lập vi khuẩn Clostridium spp., tổng số mẫu dương tính với chủng
botulinum là 8 mẫu. Từ 8 mẫu Clostridium botulinum ta tiến hành thử độc tố trên chuột bạch. Mỗi mẫu thí nghiệm trên 4 con chuột chia thành 2 lô:
Lô I canh khuẩn không xử lý nhiệt (2 con chuột). Lô II canh khuẩn đã xử lý nhiệt (2 con chuột).
43
4.5.1 Kết quả thử độc tố botulin trên chuột thí nghiệm
Bảng 14: Kết quả thử độc tố của vi khuẩn C. botulinum trên chuột thí nghiệm
Ký hiệu mẫu
Lô I Lô II
Số chuột chết
Số chuột biểu hiện triệu chứng khác
thường
Số chuột chết
Số chuột biểu hiện triệu chứng khác thường Đ4 0/2 2/2 0/2 0/2 Đ5 0/2 2/2 0/2 0/2 Đ6 0/2 2/2 0/2 0/2