Trong cuối những năm 1960, một bác sĩ nhãn khoa ở San Francisco là Alan Scott và Edward Schantz là những người đầu tiên đưa độc tố botulin vào các mục đích điều trị. Năm 1973, Scott đã sử dụng độc tố botulin type A (BTX-A) trên các thí nghiệm trên khỉ. Năm 1980, ông chính thức sử dụng BTX-A lần đầu tiên ở người để điều trị bệnh lác mắt (blepharospasm), một tình trạng mà mắt không tự mở được và không kiểm soát được việc nháy mắt.
Năm 1986, Scott và nhà phân phối của BTX-A không còn có thể cung cấp thuốc vì không đảm bảo được an toàn trong thử nghiệm. Mãi tới tháng 12 năm 1989, Botox được sản xuất bởi Allergan, Inc… được sự chấp thuận của Cục Quản lý Thực phẩm và Dược phẩm Mỹ (FDA) để điều trị bệnh lác mắt (blepharospasm) cho những bệnh nhân trên 12 tuổi. Năm 2002, FDA đã phê chuẩn việc sử dụng Botox (Botulinum toxin-A) với mục đích thẩm mỹ bằng việc làm giảm đường nhăn giữa trán thông qua việc làm liệt cơ mặt. Các chế phẩm khác
25
Botox cosmetic®, độc tố botulin type A (Botox; Allergan, Irvine, California), xuất hiện đầu tiên tại Hoa Kỳ, độ an toàn của nó đã được kiểm tra.
Dysport® (Ipsen dược phẩm) (Độc tố botulin type A). Tại châu Âu, độc tố botulin của type huyết thanh tương tự được bán trên thị trường của một công ty khác (Dysport®; Speywood, Vương quốc Anh).
Xeomin® là độc tố botulin type A thứ ba được cấp phép tại Vương quốc Anh. Xeomin® là một sáng tạo xây dựng Botulin type A, trong đó các protein phức đã được loại bỏ bởi một quá trình thanh lọc rộng từ khu phức hợp độc tố botulin.
Neurobloc® (Myobloc) là thương hiệu được đăng ký của Solstice, Khoa học thần kinh Inc, San Francisco, California. Nó là Clostridium botulinum type B có sẵn tại Anh năm 2001.
Myobloc® (Elan), Dysport® có hiệu quả hơn 12 tháng. Tính năng này rất thuận lợi cho lịch trình bệnh nhân, trong đó Myobloc là một độc tố botulin type B.
Theo báo cáo của Dressler D & Benecke R (2007) đã có vài trường hợp hiếm gặp gây tử vong khi sử dụng độc tố botulin cho việc điều trị, tử vong có thể phát sinh khi chất độc lan rộng vượt ra ngoài chỗ tiêm và dẫn đến suy hô hấp.
Trong những năm 1950, các nhà nghiên cứu đã phát hiện ra rằng khi cơ bắp hoạt động quá mức thì độc tố botulin type A sẽ giúp giảm hoạt động cơ bắp do cơ chế ngăn chặn sự phát hành của acetylcholine bởi các tế bào thần kinh.
Nghiên cứu của Naumann (2001 và 2002) cho biết trong trường hợp đổ mồ hôi nặng, dùng BoTX-A tiêm dưới da cho hiệu quả tới 94% trong khi ở nhóm khác chỉ đạt 36%. Trong thử nghiệm này, các nhóm khác cho tác dụng phụ nhiễm khuẩn cao hơn nhóm tiêm BoTX-A. Các tác giả sau đó Dressler, Benecke, Baumann, Halem (2003) cũng lặp lại thử nghiệm này với BoTX-B cho kết quả tương đương, tuy nhiên có gặp tác dụng phụ là làm khô miệng, gây khó khăn trong điều tiết mắt. Hiện BoTX-A được chỉ định chính thức dùng cho chứng tiết mồ hôi khu trú vừa và nặng tại nhiều nước như Canada, Australia, Vương quốc Anh.
26
Hình 10: Tác dụng của botox
Người phụ nữ này đang bị một tình trạng gọi là “blepharospasm”. Trong bức ảnh đầu tiên cô không thể mở mắt do co cơ bất thường. Ở hình giữa, cô có thể mở mắt nhờ vào bàn tay, nhưng vẫn không thể giữ chúng tự mở được. Bức tranh thứ ba là sau khi tiêm với độc tố botulin. Bây giờ cô ấy có thể giữ cho đôi mắt của cô hoàn toàn mở mà không cần chạm vào chúng (Nguồn từ Cục Quản lý Dược và Thực Phẩm Hoa Kỳ).
2.6Đặc điểm sinh học chuột bạch
Chuột thí nghiệm, thường được gọi là chuột bạch, thông thường có bộ lông màu trắng được sử dụng phổ biến trong các thí nghiệm khoa học về các lĩnh vực y học, sinh học, tâm lý học hoặc các lĩnh vực khác. Trong cộng đồng khoa học, bộ gặm nhấm là đối tượng thí nghiệm phổ biến nhất. Có đến 95% các nghiên cứu trên động vật ở Mỹ được thực hiện trên loài gặm nhấm. Còn ở châu Âu, loài gặm nhấm chiếm 79% các thí nghiệm lên động vật trong các nghiên cứu, với đặc trưng của chuột bạch là tính hiền lành, dễ nuôi và quan trọng hơn là do tính tương đồng cao trong bộ gene của chuột và bộ gene của người nên hiện nay chuột bạch được coi là đối tượng quan trọng cho các nghiên cứu Y- sinh học. Y- sinh học cũng là lĩnh vực nghiên cứu sử dụng chuột bạch làm mẫu thí nghiệm nhiều nhất. Chuột bạch còn được dùng để thử các tác dụng phụ của vaccine, thử tác dụng chữa bệnh của thuốc, tác dụng và ảnh hưởng của các loại thức ăn. Tuy nhiên, có một điều là đừng quên rằng chuột không phải là loài động vật linh trưởng. Trong khi các loài linh trưởng có sự gắn kết rất chặt chẽ với con người về khía cạnh di truyền học (có thể nói giống nhau đến 99%), việc sử dụng loài linh trưởng trong nghiên cứu vẫn còn gây rất nhiều tranh cãi (http://vnreview.vn/).
Chuột khỏe mạnh có các biểu hiện như mắt đỏ, vận động nhanh và mạnh, lông dày, mượt, đuôi to, dài, mạch máu ở đuôi thẳng và rõ.
Chuột bạch có tuổi thành thục sinh dục là 2 tháng ( 60- 80 ngày), thời gian mang thai 20- 21 ngày, số con trên lứa đẻ là 5- 8 con.
27
Tần số hô hấp: 136- 216 lần/ phút. Nhịp tim: 520- 780 lần/ phút. Nhiệt độ bình thường: 37,40C.
2.6.1 Chăm sóc, nuôi dưỡng chuột bạch trước thí nghiệm:
Theo dõi sức khỏe của chuột thí nghiệm, lấy nhiệt độ cơ thể chuột trước khi tiêm 1 ngày.
Thay chất lót chuồng 1 lần/ ngày, sau khi thay vệ sinh sạch sẽ chuồng cũ, sát trùng và đem phơi khô để sử dụng cho lần sau.
Cho ăn chỉ nên bỏ một số lượng vừa đủ ăn trong ngày.
Cho uống, nếu cho uống nước bằng chai, cần thay nước ít nhất 2 lần mỗi tuần gồm một lần sau khi khử trùng chai và một lần vào 3- 4 ngày sau. Lần thay nước giữa 2 lần cần phải cho chai nào trở về chuồng đó để tránh việc truyền bệnh. Nước nên lấy ngay từ vòi nước, nếu không có nước máy thì nên dùng nước đun sôi để nguội.
2.6.2 Chăm sóc, nuôi dưỡng chuột sau thí nghiệm:
Tránh để lẫn lộn các chuồng làm sai lệch kết quả.
Hằng ngày theo dõi tình trạng sức khỏe: lấy nhiệt độ, ghi nhận triệu chứng xuất hiện. Nếu con vật chết, tiến hành mổ khám và lấy bệnh phẩm động vật thí nghiệm:
Trước khi mổ khám động vật thí nghiệm. Xem xét tư thế chết, biểu hiện bên ngoài. Trong khi mổ khám:
Tránh làm vỡ các bộ phận.
Lấy bệnh phẩm còn tươi (lúc vừa mới chết). Sau khi mổ khám: (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Mang xác hủy ở nhiệt độ 1210C trong vòng 30 phút.
Sát trùng nơi mổ khám, dụng cụ, trang thiết bị trong quá trình mổ khám.
28
CHƯƠNG 3
PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1 Phương tiện nghiên cứu
3.1.1 Nội dung, thời gian, địa điểm, đối tượng nghiên cứu
Nội dung nghiên cứu
- Nuôi cấy, phân lập vi khuẩn Clostridium spp. từ các mẫu bùn đất ở ruộng, nơi xảy ra tình trạng vịt với các biểu hiện như liệt cánh, liệt chân, liệt cổ (bệnh cúm cần). - Định danh một số chủng vi khuẩn Clostridium spp. phân lập được thông qua một
số phản ứng sinh hóa.
- Thực hiện kháng sinh đồ, kiểm tra mức độ nhạy, mức độ kháng của vi khuẩn
Clostridiumspp. đối với một số loại kháng sinh.
- Khảo sát triệu chứng, bệnh tích của chuột bạch khi tiêm dịch bệnh phẩm từ chủng vi khuẩn Clostridium botulinum phân lập được.
Thời gian thực hiện: từ tháng 07/2014 đến tháng 11/2014. Địa điểm lấy mẫu: huyện Châu Phú và Phú Tân, tỉnh An Giang.
Địa điểm thực hiện đề tài: phòng thí nghiệm Vi trùng và Miễn dịch, Bộ môn Thú Y, khoa Nông Nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng, Trường Đại Học Cần Thơ.
Đối tượng nghiên cứu:
- Mẫu được lấy trên ruộng, nơi theo điều tra có dịch bệnh “cúm cần” xảy ra trên vịt tại huyện Châu Phú và Phú Tân, tỉnh An Giang.
- Chuột bạch thí nghiệm có trọng lượng 20- 25g do trại Thực nghiệm thuộc công ty Vemedim cung cấp.
3.1.2 Dụng cụ, thiết bị và máy móc
Máy autoclave, cân điện tử, tủ lạnh, tủ sấy, tủ ấm, ống đong, ống hút, lame, kính hiển vi, đèn cồn, thùng đá, bình yếm khí, tủ ấm CO2, túi yếm khí, lưới lọc 0,45µm, bếp đun cách thủy, máy ly tâm, ống nghiệm các loại,…
3.1.3 Hóa chất và môi trường
Hóa chất
- Cồn 96°, cồn 90°, cồn 70°, nước cất, dầu ceda,…
- Các loại thuốc nhuộm: Crystal violet, Lugol, Safranine,…
29
- Các loại đường: Glucose monohydrate, Maltose monohydrate, Lactose monohydrate, Saccharose.
- Chỉ thị màu Bromocresole purple.
- Các loại đĩa kháng sinh: norfloxacin, erythromycin, tetracyline, penicillin, trimethoprime.
- Bộ API 20A (analytical profile index), Bio-Mérieux, Pháp. Môi trường nuôi cấy
- Môi trường TSA: Tryptis Soy Agar. - Môi trường NA: Nutrient Agar. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
- Môi trường MHA: Mueller Hinton Agar. - Môi trường Cooked Meat.
- Môi trường Peptone Water. - Máu cừu.
3.2 Phương pháp nghiên cứu
3.2.1 Phương pháp lấy mẫu
- Ở mỗi địa điểm lấy ngẫu nhiên 5- 7 mẫu đất nghi có sự hiện diện của của vi khuẩn
Clostridium spp., mẫu được lấy ở độ sâu 5- 10cm so với mặt đất, trọng lượng mỗi mẫu là 20- 30g.
- Bảo quản mẫu trong túi nilong vô trùng, vuốt và đẩy không khí ra ngoài, mỗi mẫu được đặt vào túi riêng được ký hiệu rõ ràng, mẫu được bảo quản lạnh rồi đưa về phòng thí nghiệm phân tích.
3.2.2 Phương pháp nuôi cấy, phân lập mẫu
Ước lượng 1g mẫu đất cho vào môi trường Cooked Meat (chú ý bỏ lớp đất bên ngoài, chỉ lấy phần đất nằm bên trong), đặt một tấm long đền đã hơ nóng vào trong môi trường Cooked Meat, đóng lọ cẩn thận tránh không khí vào. Đem môi trường Cooked Meat ủ trong tủ ấm CO2 trong 24- 48 giờ ở nhiệt độ 370C.
Sau khi ủ yếm khí, sử dụng tăm bông vô trùng nhúng vào canh trùng ria cấy trực tiếp lên môi trường thạch máu, ủ ở tủ ấm CO2 trong 24- 48 giờ ở nhiệt độ 370C.
Chọn những khuẩn lạc màu trắng đục, to, nhầy, bề mặt khô, không bóng, không tròn đều, đường kính khoảng từ 0,5- 1cm, rìa ngoài khuẩn lạc sẽ cho kết quả tốt hơn.
30
Nhuộm Gram, xem hình dạng vi khuẩn dưới kính hiển vi ở vật kính 100, thử một số phản ứng sinh hóa và giữ giống trên môi trường Cooked Meat.
3.2.3.Kiểm tra đặc tính sinh hóa của vi khuẩn Clostridium spp.
Phương pháp kiểm tra hình thái dưới kính hiển vi
Làm tiêu bản, nhuộm Gram, và xem dưới kính hiển vi quang học ở vật kính 100.
Cho 1 gram mẫu đất vào môi trường Cooked Meat Thêm long đền đã hơ nóng
Ủ trong tủ ấm CO2 24-48 giờ, 370C
Ria cấy lên môi trường thạch máu
Ủ trong tủ ấm CO2 24-48 giờ, 370C
Chọn những khuẩn lạc có màu trắng đục, nhầy (đường kính 0,5- 1cm)
Ria cấy trên môi trường thạch máu để chọn khuẩn lạc thuần
Nhuộn Gram, kiểm tra một số đặc tính sinh hóa
Giữ giống trên môi trường Cooked Meat
31
Phương pháp kiểm tra một số chỉ tiêu sinh hóa của vi khuẩn Clostridium spp.
Sau quy trình cấy trên môi trường thạch máu và đạt kết quả thuần ta tiến hành thử một số chỉ tiêu sinh hóa của vi khuẩn Clostridium spp.
Kiểm tra đặc tính sinh hóa ở khả năng sử dụng đường Glucose, Maltose, Lactose và Saccharose.
Thử sự tạo thành Indole trên môi trường pepton.
So sánh kết quả với các đặc tính sinh hóa chuẩn của một số chủng vi khuẩn Clostridium (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
ở bảng 2.
Hình 13: Kết quả lên men đường của vi khuẩn Clostridium botulinum
Với những mẫu là chủng C. botulinum trong phản ứng sinh hóa đường, ta tiến hành khẳng định vi khuẩn với bộ sinh hóa cho vi khuẩn Gram âm API 20A (Trần Linh Thước, 2006).
Các bước tiến hành:
Chuẩn bị canh trùng
+ - + - - Hình 11: Vi khuẩn Clostridium dưới kính hiển vi quang học ở vật kính 100
Hình 12: Hình dạng khuẩn lạc Clostridium spp. trên môi trường thạch máu
32
- Mở ống môi trường API 20A.
- Chuẩn bị canh trùng của vi khuẩn thuần sao cho đạt nồng độ lớn hơn hoặc tương đương 3 lần McFarland (bằng cách so độ đục với ống chuẩn McFarland).
Chuẩn bị thanh
- Chuẩn bị một hộp ủ (bao gồm khay và nắp), thêm 5ml nước muối sinh lý 0,9% vào các giếng honeycomb để tạo độ ẩm không khí.
- Lấy thanh API 20A ra khỏi bao và đặt vào khay ủ.
- Sử dụng pipet vô trùng cho canh trùng đã chuẩn bị vào thanh API 20A, tránh tạo thành bọt khí và nghiêng thanh nhẹ nhàng về phía trước.
- Với giếng GEL, phủ đầy cả ống.
- Giếng IND, phủ vừa đủ ống và làm đầy phần hình chén bằng dầu khoáng.
Đậy nắp khay và ủ trong tủ ấm CO2 đọc kết quả sau 24 giờ. So sánh kết quả với bảng 7.
Bảng 7: Các chỉ tiêu định danh vi khuẩn C. botulinum của bộ API 20A
IND URE GLU MAN LA C SAC MAL SAL XYL ARA GEL ESC GLY CEL MNE MLZ RAF SOR RHA TRE SPOR GRAM COCC - - + - - - + - - - + - - - - - - - - ± + + -
(1) Chuẩn bị canh trùng, hộp ủ, thanh API
(3) Cho canh trùng vào thanh API
(2) Cho nước muối sinh lý vào các giếng
33
(6) Đọc kết quả
Hình 14: Các bước làm phản ứng API 20A
3.2.4. Phương pháp kiểm tra độ nhạy của vi khuẩn đối với kháng sinh. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Phương pháp kháng sinh đồ dựa trên sự khuếch tán của kháng sinh trên thạch đĩa của Kirby-Bauer (Bauer et al., 1966), dựa trên đường kính vòng vô khuẩn theo tiêu chuẩn của Clinical and Laboratory Standards Institute (2007) để đánh giá mức độ nhạy cảm kháng sinh. Tính nhạy cảm của Clostridium spp. đối với 5 loại kháng sinh được xác định dựa vào đường kính vòng vô khuẩn được trình bày qua bảng 8.
Môi trường làm kháng sinh đồ: môi trường MHA (Mueller Hinton Agar), pH của môi trường phải là 7,2- 7,6. Môi trường được khử trùng ở nhiệt độ 1210C trong 15 phút. Đổ môi trường lên đĩa petri vô trùng, bề dày thạch phải đạt 4mm.
Phương pháp thực hiện kháng sinh đồ: Chuẩn bị canh trùng của vi khuẩn Clostridium spp. thuần sao cho đạt nồng độ 108 CFU/ml (bằng cách so độ đục với ống chuẩn Mc Farland 0,5). Dùng que tăm bông vô trùng nhúng vào canh trùng, ép vào thành ống nghiệm cho bớt nước rồi ria đều khắp mặt thạch MHA. Dùng kẹp vô trùng đặt các đĩa kháng sinh đã chọn lên mặt thạch, các đĩa kháng sinh cách nhau 2,5cm đến 3,5cm và cách rìa đĩa thạch 2cm. Đĩa được ủ trong tủ ấm CO2 ở nhiệt độ 370C. Sau 24 giờ đọc kết quả.
Đọc kết quả bằng cách đo đường kính vòng vô khuẩn, rồi đối chiếu với bảng tiêu chuẩn để đánh giá.
(5) Đậy nắp và đem ủ trong tủ ấm CO2 24 giờ
34
Bảng 8: Đánh giá mức độ mẫn cảm của vi khuẩn với một số loại kháng sinh
STT Loại kháng
sinh Hàm lượng
Đường kính vòng vô khuẩn (mm)
Mẫn cảm cao Mẫn cảm trung bình Kháng thuốc 1 Tetracyline 30µg ≥19 15- 18 ≤ 14 2 Erythromycin 15µg ≥ 23 14- 22 ≤ 13 3 Norfloxacin 10µg ≥ 17 13- 16 ≤ 12 4 Penicillin 10 UI ≥ 29 ≤ 28 5 Trimethoprime 1.25/23.75 µg ≥ 16 11- 15 ≤ 10
(Nguồn: Trường Đại Học Y Dược TpHCM, 2002)
3.2.5 Nuôi chuột thử độc tố:
3.2.5.1 Bố trí thí nghiệm
Chuẩn bị chuồng nuôi chuột, trấu, thức ăn, nước uống….
Chuồng nuôi được thiết kế bằng các hộp nhựa hình chữ nhật, bên trên nắp hộp được đục các lỗ nhỏ nhằm tạo không khí lưu thông. Nắp hộp được trang trí màu, còn lại toàn thân hộp trong suốt nên ta có thể dễ dàng quan sát chuột từ bên ngoài mà không phải mở nắp hộp ra vô nhiều lần gây kích động chuột.
Nền chuồng được lót bằng trấu đã sấy khô và tiệt trùng nhằm hạn chế các tác động bên