Tuyển chọn một số chủng vi khuẩn bacillus thuringiensis phân lập từ các mẫu đất tại huyện tiên phước, tỉnh quảng nam

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM KHOA SINH - MÔI TRƯỜNG …………… PHAN NGUYỄN GIA LINH TUYỂN CHỌN MỘT SỐ CHỦNG VI KHUẨN BACILLUS THURINGIENSIS TỪ CÁC MẪU ĐẤT PHÂN LẬP TẠI HUYỆN TIÊN PHƯỚC, TỈNH QUẢNG NAM KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Đà Nẵng, Năm 2019 ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM KHOA SINH - MÔI TRƯỜNG NGUYỄN …………… PHAN GIA LINH LỜI CAM TUYỂN CHỌN MỘT SỐĐOAN CHỦNG VI KHUẨN Tôi xin cam đoanTHURINGIENSIS công trình nghiênTỪ cứu khoa riêng tơi Các số BACILLUS CÁChọcMẪU ĐẤT liệu kết khóa luận trung thực chưa công bố PHÂN LẬP TẠI HUYỆN TIÊN PHƯỚC, TỈNH QUẢNG NAM cơng trình khác Tác giả khóa luận Phan Nguyễn Gia Linh Chuyên ngành : Công nghệ sinh học Giáo viên hướng dẫn : ThS Lê Vũ Khánh Trang Đà Nẵng, Năm 2019 LỜI CẢM ƠN Đề tài khóa luận tốt nghiệp cơng trình nghiên cứu khoa học đầu tư kỹ lưỡng Đây cơng trình gặp phải nhiều vấn đề khó khăn, vấn đề khuất mắc trình nghiên cứu tơi Tuy nhiên, thành đem lại xứng đáng ghi nhận Tất thành không riêng nỗ lực trị chúng tơi mà giúp đỡ, ủng hộ mặt vật chất lẫn tinh thần từ gia đình, thầy bạn bè để tơi hồn thành tốt khóa luận Trước hết, tơi xin chân thành cảm ơn ba mẹ, cảm ơn người giúp đỡ, động viên tôi, hậu phương vững hỗ trợ tơi tập trung hồn thành tốt đề tài Đặc biệt, xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến cô Lê Vũ Khánh Trang cô Lê Thị Mai, người cô, người chị tận tâm hỗ trợ, giúp đỡ tôi, động viên thực khóa luận Cảm ơn ln theo sát, truyền đạt kiến thức chuyên ngành, đưa góp ý kinh nghiệm thực tiễn ngành sống suốt thời gian vừa qua Tôi xin gửi lời cảm ơn đến quý thầy cô khoa Sinh – Môi trường giúp đỡ, hỗ trợ tội suốt trình học tập bốn năm giảng đường đại học, tạo điều kiện hội để sinh viên học tập, rèn luyện tốt Sau cùng, xin gửi lời cảm ơn thân thương đến người bạn, người anh, người chị bạn sinh viên khóa ln đồng hành tôi, chia sẻ kiến thức hỗ trợ giúp đỡ lẫn trình nghiên cứu, học tập Tôi xin chân thành cảm ơn! Đà Nẵng, tháng năm 2019 Sinh viên Phan Nguyễn Gia Linh MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN LỜI CẢM ƠN DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT DANH MỤC BẢNG BIỂU DANH MỤC HÌNH ẢNH MỞ ĐẦU 1 Đặt vấn đề Mục tiêu nghiên cứu Ý nghĩa khoa học ý nghĩa thực tiễn đề tài CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Khái quát Bacillus thuringiensis 1.1.1 Lịch sử phát Bacillus thuringiensis 1.1.2 Đặc điểm phân bố 1.1.3 Đặc điểm sinh lý Bacillus thuringiensis 1.1.4 Đặc điểm sinh hóa Bacillus thuringiensis 1.1.5 Phân loại gene độc tố Bacillus thuringiensis 1.1.6 Các loại độc tố Bacillus thuringiensis 1.1.7 Cơ chế tác động protein tinh thể lên côn trùng 1.2 Một số nghiên cứu vi khuẩn Bacillus thuringiensis 1.2.1 Một số nghiên cứu giới 1.2.2 Một số nghiên cứu nước 1.3 Một số chế phẩm Bacillus thuringiensis thị trường 10 CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 11 2.1 Đối tượng, vật liệu phạm vi nghiên cứu 11 2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 11 2.1.2 Môi trường nuôi cấy thuốc thử 11 2.1.3 Phạm vi nghiên cứu 11 2.2 Nội dung nghiên cứu 11 2.3 Phương pháp nghiên cứu 12 2.3.1 Sơ đồ bố trí thí nghiệm 12 2.3.2 Phân lập tuyển chọn chủng vi khuẩn Bacillus thuringiensis 12 2.3.3 Các phép thử sinh lý, sinh hóa 14 2.3.4 Phương pháp thử nghiệm hoạt tính diệt sâu tơ (Pluella xylostella) chủng Bacillus thuringiensis giả định 15 2.3.5 Phương pháp định danh Bacillus sp 16 2.3.6 Phương pháp xử lý số liệu 16 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 17 3.1 Kết phân lập, tuyển chọn vi khuẩn Bacillus sp có tinh thể độc phân lập từ đất huyện Tiên Phước 17 3.2 Kết xác định đặc tính sinh lý, sinh hóa vi khuẩn Bacillus thuringiensis phân lập 20 3.3 Xác định hoạt tính diệt sâu tơ (Pluella xylostella) chủng Bacillus thuringiensis giả định 25 3.3.1 Kết xác định số lượng bào tử 24 nuôi cấy 25 3.3.2 Kết hoạt lực diệt sâu 26 3.4 Kết định danh phương pháp khuếch đại vùng gene 16S rRNA 28 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 32 TÀI LIỆU THAM KHẢO 33 PHỤ LỤC DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT B thuringiensis (Bt) Bacillus thuringiensis CAB Center for Advanced Bioimaging NCBI National Center for Biotechnology Information TCVN Tiêu chuẩn Việt Nam PCR Polymerase Chain Reaction DNA Deoxyribonucleic acid RNA Ribonucleic acid tRNA transfer Ribonucleic acid rRNA ribosome Ribonucleic acid KL Khuẩn lạc ĐC Đối chứng TNHH MTV Trách nhiệm hữu hạn thành viên DANH MỤC BẢNG BIỂU Kí hiệu bảng 1.1 Tên bảng Phân loại gene cry Bacillus thuringiensis Trang Đặc điểm hình thái khuẩn lạc số đặc điểm sinh học 3.1 chủng vi khuẩn phân lập 42oC 17 3.2 Kết thử nghiệm khả di động 21 3.3 Kết thử nghiệm khả chịu mặn 22 3.4 Kết thử phản ứng oxidase 23 3.5 Kết thử phản ứng catalase 24 3.6 Số lượng bào tử/ml dung dịch lên men sau 24 26 3.7 Hoạt lực diệt sâu chủng vi khuẩn nghiên cứu 26 DANH MỤC HÌNH ẢNH Tên hình ảnh Số hiệu Trang 1.1 Bào tử tinh thể độc Bacillus thuringiensis 1.2 Cơ chế diệt sâu vi khuẩn Bacillus thurigiensis 2.1 Sơ đồ bố trí thí nghiệm 12 3.1 Hình thái khuẩn lạc hình thái tế bào chủng B1 (VK100) 19 Hình thái khuẩn lạc hình thái tế bào chủng B4 3.2 (VK100) 19 3.3 Hình thái khuẩn lạc hình thái tế bào chủng B7 (VK100) 19 3.4 Hình thái khuẩn lạc hình thái tế bào chủng B9 (VK100) 20 3.5 Khả di động chủng B1, B4, B7, B9 21 3.6 3.7 Canh trường chứa 10% NaCl sau 10 ngày thử nghiệm mẫu đối chứng sau 24 nuôi cấy Kết thử nghiệm khả chịu mặn chủng B1, B4, B7, B9 22 23 3.8 Phản ứng oxidase chủng B1, B4, B7, B9 24 3.9 Phản ứng catalase chủng B1, B4, B7, B9 25 3.10 Sâu tơ qua giai đoạn thử nghiệm 27 3.11 DNA tổng số chủng B7 28 3.12 Khuếch đại vùng gene 16S rRNA chủng B7 29 3.13 Kết tìm kiếm trình tự tương đồng chủng vi khuẩn B7 30 MỞ ĐẦU Đặt vấn đề Với xu nay, để đáp ứng nhu cầu người tiêu dùng, người nông dân chủ doanh nghiệp chuyển sang hướng đến nông nghiệp hữu cơ, nông nghiệp thân thiện với môi trường, với việc phát triển công nghệ kỹ thuật tiên tiến Các chế phẩm vi sinh vật với loại thảo dược dần thay thuốc bảo vệ thực vật hóa học độc hại để kiểm soát tốt dịch bệnh sâu hại, nâng cao suất chất lượng nông sản mà không gây ảnh hưởng xấu đến hệ sinh thái sức khỏe cộng đồng Bacillus thuringiensis loài vi khuẩn có khả tổng hợp protein gây tê liệt ấu trùng số lồi trùng gây hại, có sâu đục bơng, lồi sâu đục thân ngô Chúng sâu hại thực vật phổ biến, có khả gây tàn phá nghiêm trọng [41] Hiện nay, vi khuẩn Bacillus thuringiensis sử dụng rộng rãi để kiểm sốt lồi gây hại khác ảnh hưởng đến nông nghiệp toàn giới Theo Trung tâm quốc tế CAB (2010), chế phẩm Bacillus thuringiensis chiếm khoảng 53% thị trường toàn cầu thuốc trừ sâu sinh học, tạo doanh thu năm 210 triệu đô la Trong năm gần đây, nhà khoa học nghiên cứu phân lập vi khuẩn từ môi trường tự nhiên nước giới với hy vọng tìm chủng Bacillus thuringiensis có phổ gây bệnh khoảng gây bệnh rộng, nâng cao hoạt tính chủng Bacillus thuringiensis nhóm trùng mới, hay tìm kiếm nguồn gene từ chủng phân lập cho kỹ thuật di truyền Nhìn chung, độc tố Bacillus thuringiensis chiến lược thành cơng việc kiểm sốt sinh học côn trùng gây hại Huyện Tiên Phước biết đến vùng trung du miền núi với loại trồng đem lại kinh tế cao như: quế, hồ tiêu, bòn bon, trà, măng cụt… Hương vị nơng sản nơi có vị riêng tạo nên đặc sản tiếng tỉnh Quảng Nam Thế nhưng, quy mô sản xuất trồng trọt nơi cịn nhỏ lẻ, sản phẩm nơng nghiệp phần lớn đủ cung cấp cho nội địa, bà nông dân chưa tiếp cận tiến kỹ thuật nên cịn gặp nhiều vấn đề khó khăn phịng trừ sâu bệnh hại Với hy vọng giúp đỡ người dân nơi tiếp cận phương pháp sản xuất tiên tiến mà thân thiện môi trường, khai thác tiềm sinh vật địa để đối phó với sâu bệnh gây hại, tơi tiến hành thực đề tài nghiên cứu: “Tuyển chọn số chủng vi khuẩn Bacillus thuringiensis phân lập từ mẫu đất huyện Tiên Phước, tỉnh Quảng Nam” Mục tiêu nghiên cứu Phân lập tuyển chọn số chủng Bacillus thuringiensis đánh giá số đặc điểm sinh lý, sinh hóa chúng Ý nghĩa khoa học ý nghĩa thực tiễn đề tài 3.1 Ý nghĩa khoa học Kết nghiên cứu đề tài cung cấp dẫn liệu khoa học mới, đánh giá mức độ đa dạng vi khuẩn Bacillus thuringiensis phân lập từ mẫu đất khác huyện Tiên Phước, tỉnh Quảng Nam 3.2 Ý nghĩa thực tiễn Các kết thu qua q trình nghiên cứu góp phần xác định số đặc điểm hình thái khuẩn lạc hình thái tế bào vi khuẩn Bacillus thuringiensis Bên cạnh đó, việc thực đề tài nghiên cứu khóa luận giúp sinh viên tiếp cận với công tác khoa học, qua nâng cao trình độ chun mơn đồng thời tạo cho thân sinh viên tác phong làm việc nghiêm túc nghiên cứu khoa học 26 Bảng 3.6: Số lượng bào tử/ml dung dịch lên men sau 24 Số lượng bào tử (x109)/ml STT Kí hiệu chủng B1 1,23 B4 6,82 B7 7,18 B9 3,18 dịch lên men Kết cho thấy, bốn chủng vi khuẩn nghiên cứu, chủng B7 có tốc độ sinh trưởng nhanh nên cho số lượng bào tử tinh thể cao (7,18x109 bào tử/1ml dung dịch) so với chủng lại Do tế bào chủng vi khuẩn bị phá vỡ giải phóng bào tử tinh thể độc Bằng cách đếm số lượng bào tử, ta ước tính số lượng tinh thể độc có dịch lên men, theo dõi tốc độ sinh trưởng chủng vi khẩn nghiên cứu 3.3.2 Kết hoạt lực diệt sâu Để tiến hành thử nghiệm hoạt lực diệt sâu, tiến hành pha loãng dịch lên men chủng (B1, B4, B7, B9) đạt đến nồng độ 109 bào tử/ml Thí nghiệm thử hoạt lực diệt sâu bố trí đĩa petri, đĩa 10 sâu (tương đối đồng kích thước, tuổi) Kết xác định hoạt lực diệt sâu thời điểm sau 24 giờ, 48 72 (tính theo cơng thức Abbott) trình bày bảng 3.7 hình 3.10: Bảng 3.7: Hoạt lực diệt sâu chủng vi khuẩn nghiên cứu Tỉ lệ sâu chết (%) STT Kí hiệu chủng 24 48 72 B1 5,28 14,33 38,23 B4 24,67 52,33 73,81 B7 46,67 80, 21 100 B9 26,67 58,03 81,25 27 Từ bảng 3.7 cho thấy, bốn chủng vi khuẩn nghiên cứu có khả diệt trừ sâu tơ Trong đó: - Chủng B1 có hoạt lực diệt sâu yếu nhất: sau 24 (5,28%); 48 (14,33%); 72 (38,23%) - Chủng B4 B9 có hoạt lực diệt sâu cao so với chủng B1 yếu so với chủng B7:  Chủng B4: sau 24 (24, 67%); 48 (52,33%); 72 (73,81%)  Chủng B9: sau 24 (26, 67%); 48 (58,03%); 72 (81,25%) - Chủng B7 có hoạt lực diệt sâu mạnh chủng: 24 (26,67%); 48 (58,03%); 72 (81,25%) Các bào tử tinh thể Bacillus thuringiensis xâm nhập vào sâu qua đường tiêu hóa Sau đó, protein Bacillus thuringiensis hoạt hóa tác động môi trường kiềm ruột sâu Độc tố hoạt hóa bám vào phân tử cảm thụ đặc biệt nằm màng vi thể tế bào thành ruột sâu Sự gắn kết ruột sâu làm thay đổi gradient điện hóa tạo thành lỗ rò (kênh ion) Việc làm phá hủy cân áp suất thẩm thấu màng tế bào, làm cho tế bào phồng lên chọc thủng ruột gây tổn thương làm chúng ngừng ăn Sau thời gian (vài đến vài ngày) sâu bị tiêu diệt Hình 3.9: Sâu tơ qua giai đoạn thử nghiệm 28 (A): Sâu chưa bị nhiễm độc (B): Sâu nhiễm độc, có tượng bỏ ăn, bụng sâu chuyển sang màu vàng trương phình (C): Sâu chết, vùng bụng chuyển sang màu đen, thành ruột bị phá vỡ Như kết cho thấy, bốn chủng vi khuẩn nghiên cứu có hoạt lực diệt sâu Trong đó, chủng B7 có hoạt lực diệt sâu cao có khác biệt có ý nghĩa mặt thống kê Đây chủng có khả tăng trưởng tốt có tinh thể độc đa dạng Chính tơi định chọn chủng B7 để tiến hành định danh đến loài sinh học phân tử 3.4 Kết định danh phương pháp khuếch đại vùng gene 16S rRNA Tiến hành định danh chủng B7 cách khuếch đại vùng gene 16S rRNA phản ứng PCR Sản phẩm PCR tinh chế gửi giải trình tự Cơng ty TNHH MTV Sinh hóa Phù Sa (Cần Thơ) Kết sau: Tách chiết DNA tổng số DNA tổng số sau tách chiết kiểm tra kỹ thuật điện di sử dụng gel agarose 0,8% Kết trình bày hình 3.11 Hình 3.11: DNA tổng số chủng B7 29 Lượng DNA tổng số thu có chất lượng tốt (sạch bị đứt gãy) sử dụng làm DNA khuôn mẫu để khuếch đại vùng gene 16S rRNA Khuếch đại vùng gene 16S rRNA Sản phẩm khuếch đại vùng gene 16S rRNA kiểm tra kỹ thuật điện di sử dụng gel agarose 0,8% Kết trình bày hình 3.12 Hình 3.12: Khuếch đại vùng gene 16S rRNA chủng B7 Sản phẩm khuếch đại có kích thước khoảng 1000bp, khơng có sản phẩm phụ sử dụng để gởi đọc trình tự Đọc trình tự sản phẩm PCR Sản phẩm khuếch đại đọc trình tự Cơng ty TNHH MTV Sinh hóa Phù Sa (Cần Thơ) Trình tự 5’ – 3’ gene 16S rRNA (1438bp): TTATACATGCAAGTCGAGCGAATTGGATTAAGAGCTTGCTCTTATGAAGTTAG CGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCCATAAGACTGGGATAAC TTTCGGGAAACCGGGGCTAATACCGGATAACATTTTGAACCGCATGGTTCGAA ATTGAAAGGCGGCTTCGGCTGTCACTTATGGATGGACCCGCGTCGCATTAGCT AGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCAACGATGCGTAGCCGACCTGAGAG GGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCA GCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGT 30 GAGTGATGAAGGCTTTCGGGTCGTAAAACTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGT GCTAGTTGAATAAGCTGGCACCTTGACGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCT AACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTATCCGGAA TTATTGGGCGTAAAGCGCGCGCAGGTGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCC ACGGCTCAACCGTGGAGGGTCATTGGAAACTGGGAGACTTGAGTGCAGAAGA GGAAAGTGGAATTCCATGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATATGGAGGAAC ACCAGTGGCGAAGGCGACTTTCTGGTCTGTAACTGACACTGAGGCGCGAAAG CGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATG AGTGCTAAGTGTTAGAGGGTTTCCGCCCTTTAGTGCTGAAGTTAACGCATTAA GCACTCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTGAAACTCAAAGGAATTGACG GGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGA ACCTTACCAGGTCTTGACATCCTTTGACAACCCTAGAGATAGGGCTTCTCCTTC GGGAGCAGAGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGAT GTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGATTTTAGTTGCCATCATTT AGTTGGGCACTTTAAGGTGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGAT GACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGG ACGGTACAAAGAGCTGCAAGACCGCGAGGTGGAGCTAATCTCATAAAACCGT TCTCAGTTCGGATTGTAGGCTGCAACTCGCCTACATGAAGCTGGAATCGCTAG TAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACC GCCCGTCACACCACGAGAGTTTGTAACACCCGAAGTCGGTGGGGTAACCTTAT TGGAGCCAGCCGCCTAAGAAGG Sử dụng cơng cụ Blast web NCBI để tìm kiếm trình tự tương đồng cho kết sau: Hình 3.13: Kết tìm kiếm trình tự tương đồng chủng vi khuẩn B7 31 Chủng vi khuẩn B7 có trình tự vùng gene 16S rRNA tương đồng 99% với loài Bacillus thurigiensis, cho phép kết luận chủng B7 loài Bacillus thurigiensis (Phụ lục) Như vậy, qua bước định danh cấp độ lồi, nhóm nghiên cứu xác định chủng vi khuẩn thuộc chi Bacillus (B7) vi khuẩn loài Bacillus thurigiensis Đây bước tiền đề cho nghiên cứu loài 32 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận Trên sở kết thu được, rút kết luận sau đây: Từ mẫu đất thu huyện Tiên Phước phân lập chủng vi sinh vật nghi thuộc chi Bacillus có khả sống sót 42oC Trong có 4/9 chủng có khả sinh tinh thể độc Đó chủng B1, B4, B7, B9 Bước đầu tuyển chọn chủng Bacillus thuringiensis Đã khảo sát đặc điểm sinh lý, sinh hóa: có khả di động, có khả sinh enzyme oxidase sinh enzyme catalase, sống nhiệt độ cao 42oC không sống điều kiện mơi trường có 10% NaCl Từ đây, lần khẳng định chủng tuyển chọn thuộc chi Bacillus Đã chọn chủng B7 dựa khả hình thành bào tử, sản sinh tinh thể độc đa dạng hoạt tính diệt sâu cao Đây chủng tiềm tiêu diệt nhiều loại côn trùng gây hại cho trồng khác Kết định danh chủng vi khuẩn B7 việc giải trình tự gene 16S rRNA cho thấy chủng thuộc loài Bacillus thuringiensis Kiến nghị Qua kết thu trình nghiên cứu, tơi đưa số định hướng nghiên cứu tương lai sau: Định danh sâu mặt di truyền chủng (B1, B4, B7, B9) để xác định phổ diệt côn trùng gây hại cho trồng huyện Tiên Phước, tỉnh Quảng Nam Nghiên cứu tạo biến chủng vi khuẩn để nâng cao hoạt tính sinh học cho chủng phân lập Phân lâp thêm số chủng vi sinh vật có lợi đất huyện Tiên Phước tạo nên hệ đa chủng nhằm sản xuất chế phẩm sinh học hỗ trợ, khuyến khích người dân nơi phát triển theo hướng nông nghiệp hữu 33 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu Tiếng Việt [1] Ngơ Đình Bính, Nguyễn Quỳnh Châu, Nguyễn Văn Thưởng, Trịnh Thị Ngọt, Nguyễn Ánh Nguyệt (2000), “Sự phân bố Bacillus thuringiensis mẫu đất Việt Nam”, Tài nguyên sinh vật đất phát triển bền vững hệ sinh thái đất, trang – [2] Ngơ Đình Bính, Nguyễn Quỳnh Châu, Nguyễn Văn Thưởng, Nguyễn Ánh Nguyệt, Trịnh Thế Cường, Jasser Mohamad Jamil, Ngơ Đình Anh Trí, Nguyễn Hồi Trâm (2000), “Những vấn đề nghiên cứu sinh học”, Báo cáo khoa học hội nghị sinh học quốc gia, trang 484 – 488 [3] Ngơ Đình Bính, Nguyễn Quỳnh Châu, Nguyễn Ánh Nguyệt, Nguyễn Xuân Cảnh, Vi Thị Đoan Chính, Nguyễn Hồi Trâm, Nguyễn Văn Tuất (2003), “Tách dịng biểu gene mã hóa protein Cry1C diệt sâu khoang từ Bacillus thuringiensis subsp aizawai”, Những vấn đề nghiên cứu Khoa học Sự sống, Báo cáo khoa học hội nghị toàn quốc lần thứ hai, trang 830 – 832 [4] Ngơ Đình Bính (2005), Giáo trình thuốc trừ sâu sinh học [5] Ngơ Đình Bính, Lê Thị Minh Thành, Trịnh Thị Thu Hà, Phạm Kiều Thúy, Phạm Minh Hương, Nguyễn Thị Luy, Lê Thị Hồng Nhung, Đặng Văn Tiến (2010), “35 năm nghiên cứu phát triển thuốc trừ sâu sinh học Bacillus thuringiensis Việt Nam”, Hội nghị khoa học kỷ niệm 35 năm Viện Khoa học Công nghệ Việt Nam, trang 288 – 300 [6] Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đình Quyến, Phạm Văn Ty (2000), Vi sinh vật học, Nhà xuất Giáo dục [7] Nguyễn Thiện Phú, Trần Thanh Thủy (2013) “Phân lập, tuyển chọn chủng Bacillus thuringiensis từ rừng ngập mặn Cần Giờ có hoạt tính diệt sâu” Tạp chí Khoa học Đại học Sư phạm thành phố Hồ Chí Minh, số 51, trang 49 – 58 34 [8] Đặng Trọng Lương, Vũ Đức Quang, Nguyễn Hữu Đống, Trần Duy Quý (1999), “Thiết kế lại cấu trúc gene Bt để chuyển vào hai mầm”, Báo cáo Hội nghị sinh học toàn quốc, trang 1371 – 1376 [9] TCVN 5960:1995, “Chất lượng đất – Lấy mẫu – Hướng dẫn thu thập, vận chuyển lưu giữ mẫu đất để đánh giá trình hoạt động vi sinh vật hiếu khí phịng thí nghiệm” [10] Lê Thị Minh Thành, Nguyễn Thị Thanh Hạnh, Nguyễn Xuân Cảnh, Nguyễn Ánh Nguyệt, Nguyễn Đình Tuấn, Phạm Kiều Thúy, Ngơ Đình Bính (2005), “Nghiên cứu phân bố đa dạng gene vi khuẩn Bacillus thuringiensis phân lập số tỉnh thuộc vùng Bắc Bộ”, Tạp chí Di truyền ứng dụng, số 4, trang 29 – 34 Tài liệu Tiếng Anh [11] Ahmed H Badran, Victor M Guzov, Quing Huai, Malissa M Kemp, Prashanth Vishwanath, Wendy Kain, Autumn M Nance, Artem Evdokimov, Farhad Moshiri, Keith H Turner, Ping Wang, Thomas Malver & David R Liu (2016), “Continuous evolution of Bacillus thuringiensis toxins overcomes insect resistance”, Natural, (533), 58 – 63 [12] Aronson, I.A., Beckman, W and Dumn, P (1986), “Bacillus thuringiensis and related insect pathogenes”, Microbiolgical Reviews 50 (1): – 24 [13] Azizoglu, U., Yilmaz, S., Ayvaz, A., Karabörklü, S and Atciyurt, Z.B (2017), “Mosquitocidal Potential of Native Bacillus thuringiensis Strain SY49 – against Disease Vector, Culex pipiens (Diptera: Culicidae)”, Tropical Biomedicine 34(2): 256 – 262 [14] Bravo, A Gill, S.S., Soberón, M., (2007), “Mode of action of Bacillus thuringiensis Cry and Cyt toxins and their potential for insect control”, Toxicon (49), 423 – 435 [15] Bravo, A Likitvivatanavong, S., Gill, S.S., Soberón, M (2011), “Bacillus thuringiensis: a story of a successful bioinsecticide”, Insect Biochem, Mol Biol 41, 423 – 431 35 [16] Claus D and Berkeley, R.C.W (1986), “Geneus Bacillus In: Bergey's Mannual of Systematic Bacteriology”, Sneath P.H.A (ed) Vol 2, 1110 – 1137 The Williams and Wilkins Co., Baltimore [17] Fadel A Sharif and N Gfirdal Alaeddinoglu (1988), “A rapid and simple method for staining of the crystal protein of Bacillus thuringiensis” Journal of Industrial Microbiology, 227 – 229 [18] Federici, B.A., Bauer, L.S (1998), “Cyt1Aa protein of Bacillus thuringiensis is toxic to the cottonwood leaf beetle, Chrysomela scripta, and suppresses high levels of resistance to Cry3Aa”, Appl Environ Microbiol (64), 4368 – 4371 [19] Gawel N J., Jarret R L (1991), “A modified CTAB DNA extraction procedure for Musa and Ipomoea”, Plant Molecular Biology Reporter (9), 262-266 [20] Glare, T.R., O’Callaghan, M (2000) “Bacillus thuringiensis: Biology, Ecology and Safety” John Wiley & Sons, Chichester [21] Heimpel, A.M (1967) “A critical Review of Bacillus thuringiensis var thuringiensis (Berliner) and other crytalliferous bacteria”, Ann Rev Ent 12: 287 – 322 [22] Ignoffo, C.M., Hastetter, D.L., Pinneli, R.F and Garcia, C (1977), “Relative Susceptibility of six soybean caterpillars to standard preparation of Bacillus thuringiensis var kurstaki”, Journal of Economic Entomology 70: 60 – 65 [23] Liu Z, Lozupone C, Hamady M, Bushman FD, Knight R (2007) “Short pyrosequencing reads suffice for accurate microbial community analysis” Nucleic Acids Res 35: e120 [24] Maria Teresa Fernandez – Luna, Pavan Kumar, David G Hall, Ashaki D Mitchell, Michael B Blackburn & Bryony C Bonning (2019), “Toxicity of Bacillus thuringiensis – Derived Pesticidal Proteins Cry1Ab and Cry1Ba against Asian Citrus Psyllid”, Diaphorina citri (Hemiptera) Toxins, 11(3), 173 36 [25] Merchant, I.A and Packer, R.A (1967), “The Bacillus geneus Veterinary Bacteriologyl and virologyl Seventh edition”, The Lowa State University Press, Ames, Lowa U.S.A, 386 [26] Nester E.W, Thomashow L S, Metz M and Gordon M (2002), “100 years of Bacillus thuringiensis: A Critical Scientific Assessment”, American Academy of Microbiology, Washington, USA [27] Pardo-López, L., Soberón, M., Bravo, A (2012), “Bacillus thuringiensis insecticidal three- domain Cry toxins: mode of action, insect resistance and consequences for crop protection” FEMS Microbiol Rev 37, – 22 [28] Pigott, C.R., Ellar, D.J (2007), “Role of receptors in Bacillus thuringiensis crystal toxin activity”, Microbiol Mol Biol Rev 71, 255 – 281 [29] Prakai Thaphan, Suttipun Keawsompong, Jariya Chanpaisaeng (2008), “Isolation, toxicity and detection of cry gene in Bacillus thuringiensis isolates in Krabi province, Thailand”, Songklanakarin J Sci Technol, 30 (5), 597 – 601 [30] Rosas-Garcia, N.M (2009), “Biopesticide production from Bacillus thuringiensis: an environmentally friendly alternative”, Recent Pat Biotechnol 3, 28 – 36 [31] Saadeldin Mudawi Osman Mudawi (12/2007), “Isolation, characteriza and nematocidal activity of Bacillus thuringiensis from soil and water” Department of Botany and Agricultural Biotechnology Faculty of Agriculture University of Khartoum [32] Sanahuja, G., Banakar, R., Twyman, R.M., Capell, T., Christou, P (2011), “Bacillus thuringiensis: a century of research, development and commercial applications” Plant Biotechnol J 9, 283 – 300 [33] Sanchis, V (2011) “From microbial sprays to insect-resistant transgeneic plants: his- tory of the biospesticide Bacillus thuringiensis” A review Agron Sust Dev 31, 217 – 231 37 [34] Schnepf, E., Crickmore, N., Van Rie, J., Lereclus, D., Baum J., Feitelson, J., Zeigler, D.R and Dean, D.H (1998), “Bacillus thuringiensis and its pesticidal crystal proteins” Microbial Mol Biol Rev 62: 775 – 806 [35] Shahram Aramideh, Mohammad Hassan Saferalizadeh, Ali Asghar Pourmirza, Mahmuod Rezazadeh Bari, Mansureh Keshavarzi and Mahdi Mohseniazar (2010), “Characterization and pathogeneic evaluation of Bacillus thuringiensis isolates from West Azerbaijan province-Iran”, African Journal of Microbiology Research, Vol (12), 1224 – 1229 [36] Theiry and E Franchon (1997), “Identification, isolation, culture and preservation entomopathogeneic bateria”, Biotechniques Manual of Technology in insect Pathology, Edited by Lawrence A Lacey, Academic Press, 55 – 57 [37] Uribe, D., Martinez, W., and Cerón, J (2003), “Distribution and diversity of cry genes in native strains of Bacillus thuringiensis obtained from different ecosystems from Columbia”, Journal of Invertebrate Pathology, (82), 119 – 127 [38] Vachon, V., Laprade, R., Schwartz, J.L (2012), “Current models of the mode of action of Bacillus thuringiensis insecticidal crystal proteins: a critical review” J Invertebr Pathol 11, – 12 [39] Weiser, J (ed) (1991) “Biological Control of Vectors, Manual for Collecting, Field Determination and Handling of Biofactors for Control of Vectors” [40] Zeleke W Tenssay, Mogessie Ashenafi, Alexander Eiler and Stefan Bertilson (2009), “Isolation and characterization of Bacillus thuringiensis from soils in contrasting agroecological zones of Ethiopia”, Ethiop J Sci., 32(2): 117 – 128 Website [41] https://www.wikipedia.org [42] https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/ PHỤ LỤC Phụ lục 1: Trình tự vùng gene 16S DNA Phụ lục 2: Lấy mẫu đất xã Tiên Cảnh, huyện Tiên Phước Phụ lục 3: Một tiêu có dấu hiệu bị bệnh thán thư tuyến trùng Phụ lục 4: Rễ tiêu bị nhiễm tuyến trùng huyện Tiên Phước, tỉnh Quảng Nam Phụ lục 5: Thu thập sâu tơ phá hoại bí đao xanh ... Kết phân lập, tuyển chọn vi khuẩn Bacillus sp có tinh thể độc phân lập từ đất huyện Tiên Phước Từ mẫu đất lấy khu vực khác Tiên Phước, tiến hành phân lập theo phương pháp Traves, 1987 Trước phân. .. cứu Nghiên cứu phân lập chủng vi khuẩn Bacillus thuringiensis huyện Tiên Phước, tỉnh Quảng Nam Nghiên cứu đặc điểm hình thái khuẩn lạc, khả sinh bào tử tinh thể chủng vi khuẩn tuyển chọn Nghiên... dạng vi khuẩn Bacillus thuringiensis phân lập từ mẫu đất khác huyện Tiên Phước, tỉnh Quảng Nam 3.2 Ý nghĩa thực tiễn Các kết thu qua q trình nghiên cứu góp phần xác định số đặc điểm hình thái khuẩn