Phân lập, tuyển chọn một số chủng vi khuẩn cố định đạm Azospirillum trong rễ cây ngô tại một số địa điểm của tỉnh Đăk Nông

Nhóm vi khuẩn này có khả năng cố định N, tổng hợp nhiều chất kíchthích sinh trưởng thực vật IAA, GA3… góp phần nâng cao độ phì nhiêu của đất,kích thích tăng trưởng, tăng năng suất cây tr

MỞ ĐẦU

1 Tính cấp thiết của đề tài

Phân vi sinh có nhiều ưu điểm so với phân hóa học, ngoài tác dụng nângcao năng suất và chất lượng cây trồng, tiết kiệm phân vô cơ, giảm chi phí sản suấtthì phân vi sinh còn góp phần quan trọng trong việc bảo vệ môi trường và pháttriển nông nghiệp bền vững Tuy nhiên tình hình sản xuất phân vi sinh ở nước tavẫn chưa đáp ứng đủ nhu cầu thực tiễn sản xuất của nền nông nghiệp, do quy môsản xuất nhỏ, chất lượng sản phẩm chưa hoàn thiện và ổn định Do đó, nghiên cứu

để hoàn thiện và nâng cao chất lượng phân vi sinh là việc làm hết sức cần thiết.Trong đó, việc phân lập và tuyển chọn các chủng vi sinh vật là khâu đầu tiên vàquan trọng trong quy trình tạo ra chế phẩm [5]

Hướng đến một nền sản xuất nông nghiệp sinh thái bền vững, trong vàichục năm gần đây ngày càng gia tăng các nghiên cứu vi khuẩn có ích khu trútrong rễ cây trồng không thuộc cây họ đậu, đặc biệt ở cây ngũ cốc Theo

Doebereiner, vi khuẩn Azospirillum ở trong rễ cây không gặp phải sự cạnh tranh

nguồn Carbon như vi khuẩn khu trú trên bề mặt rễ và có thể cung cấp đạm chocây trồng mà không phải nhờ đến khi tế bào chết [35]

Nhóm Azospirillum là vi khuẩn sống trong rễ các loại cây ngũ cốc như

lúa, ngô Nhóm vi khuẩn này có khả năng cố định N, tổng hợp nhiều chất kíchthích sinh trưởng thực vật IAA, GA3… góp phần nâng cao độ phì nhiêu của đất,kích thích tăng trưởng, tăng năng suất cây trồng, hạn chế bón phân hóa học vàphát triển nền nông nghiệp sinh thái bền vững [35]

Ở Việt Nam đã có một số nghiên cứu, phân lập các chủng vi khuẩn thuộc

chi Azospirillum trong rễ lúa Bên cạnh đó, ngô là một đối tượng có vòng đời

sinh trưởng và phát triển tương đối ngắn, ít đầu tư, hiệu quả kinh tế cao, đượctrồng phổ biến Tuy nhiên, những nghiên cứu về vi khuẩn cố định đạm

Azospirillum trong rễ cây ngô còn rất ít Đặc biệt, hiện nay chưa có một nghiên

cứu nào về thành phần loài của chi Azospirillum trong rễ cây ngô tại một số địa

phương của tỉnh Đăk Nông

Xuất phát từ thực tế đó, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: “Phân lập, tuyển chọn một số chủng vi khuẩn cố định đạm Azospirillum trong rễ cây ngô tại một số địa điểm của tỉnh Đăk Nông”

2 Mục tiêu của đề tài

- Phân lập và tuyển chọn được một số chủng Azospirillum cố định đạm

trong rễ cây ngô

- Xây dựng qui trình nhân sinh khối một số chủng Azospirillum có hoạt

tính cố định đạm làm phân sinh học chuyên dụng cho cây ngô

3 Ý nghĩa của đề tài

Ý nghĩa khoa học

Xác định được một số chủng Azospirillum có khả năng cố định đạm, sống

nội sinh trong rễ cây ngô

Ý nghĩa thực tiễn

Kết quả của đề tài là cơ sở cho việc lựa chọn các chủng Azospirillum sống

nội sinh trong rễ cây ngô có hoạt tính cố định đạm để sản xuất phân vi sinh cóhiệu quả, nâng cao độ phì nhiêu của đất, hạn chế bón phân hóa học, tăng năngsuất cây ngô và góp phần phát triển một nền nông nghiệp sinh thái bền vững

PHẦN I TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Giới thiệu về cây ngô

1.1.1 Phân loại thực vật

Ngô có tên khoa học là Zea mays L (Zea: Từ Hi Lạp để chỉ cây ngũ cốc và

từ Mays là từ “Mahix” tên gọi cây ngô của người bản địa da đỏ [7] Cũng có thểMays là từ “Maya” tên một bộ tộc da đỏ ở vùng Trung Mỹ - xuất xứ của câyngô) [18]

Cây ngô thuộc: Ngành : Maopholiophyta

Lớp : Liliopsida

Bộ : PoalesChi : ZeaLoài : Mays

1.1.2 Đặc điểm hình thái cây ngô [7],[15],[16]

Rễ ngô: trong quá trình sinh trưởng phát triển, cây ngô có 3 loại rễ Đó là:

rễ mầm, rễ đốt và rễ chân kiềng

Thân ngô: thân đặc, đường kính thân khoảng 2 – 4cm tùy thuộc vào giống, mùa vụ và trình độ thâm canh, thân có nhiều lóng Trong điều kiện bình thường ngô cao từ 1,8 – 2m, từ khi mọc đến khi cây có 6 – 7 lá thân phát triển chậm, từ lúc 8 – 9 lá đến nhú cờ, nở hoa cây phát triển nhanh và đến khi hoa đực phơi màu, bắp phun râu cây vẫn tiếp tục lớn Sau khi thụ phấn thì thân ngừng phát triển.

Lá ngô: gồm có lá mầm, lá thân, lá ngọn và lá bẹ Lá được chia thành các bộ phận như: bẹ lá, phiến lá và thìa lá Phiến lá rộng và dài, mép lá gợn sóng, có nhiều lông tơ Gân lá song song Lá mang bắp có chiều dài dài nhất.

Hoa ngô: gồm hoa đực ( bông cờ) và hoa cái Bông cờ có nhiều nhánh, mỗi nhánh có nhiều hoa xếp thành từng chùm, mỗi chùm có hai hoa, mỗi hoa

có 3 nhị đực, mỗi nhị đực có 1 bao phấn, một bao phấn có hai ô, một ô chứa

từ 1000 – 2500 hạt phấn Hoa cái sinh ra từ nách lá gồm có lõi bắp có nhiều

đốt ngắn có lá bao bi, mỗi hoa cái có một râu Hoa cái mọc từng đôi trên hoa

tự Mỗi chùm hoa có hai hàng hoa nhưng hoa thứ hai bị thoái hóa chỉ một hoa hình thành hạt, một đôi chùm hoa cho hai hàng hạt nên hàng hạt ở trên bắp luôn luôn chẵn.

Hạt ngô: thuộc loại quả dĩnh, gồm các bộ phận chính là vỏ hạt, lớp alơron, phôi và nội nhũ, phía dưới của hạt có gốc hạt là phần dính liền hạt với lõi ngô Hạt ngô được hình thành gồm các giai đoạn: từ thụ phấn đến chín sữa là 10 – 15 ngày, từ chín sữa đến chín sáp là 15 – 20 ngày và từ chín sáp đến chín hoàn toàn là 10 – 15 ngày.

1.1.3 Yêu cầu sinh thái của cây ngô [18],[22]

1.1.3.1 Yêu cầu nhiệt độ

Ngô là cây trồng ưa khí hậu ẩm, nhiệt độ thích hợp vào khoảng 20 0 C

-28 0 C Nhiệt độ có thể ảnh hưởng đến thời gian sinh trưởng của cây ngô Trong cả chu kỳ sống cũng như trong từng thời kỳ sinh trưởng phát triển của cây ngô cần một lượng tích nhiệt nhất định Đủ lượng nhiệt cây mới sinh trưởng phát triển bình thường Tùy vào từng giống khác nhau mà cần một lượng nhiệt khác nhau Giống càng chín muộn thì cần lượng tích nhiệt càng cao.

1.1.3.2 Yêu cầu về ánh sáng

Ngô là cây có nguồn gốc nhiệt đới thuộc nhóm cây ngày ngắn Ánh

sáng là yếu tố quan trọng cho sinh trưởng và phát triển của cây ngô, tạo điềukiện thuận lợi cho quá trình tích luỹ chất dinh dưỡng và ảnh hưởng đến độ dài

của quá trình sinh trưởng Trung bình cần 12 giờ chiếu sáng/ngày.

Nghiên cứu phản ứng của cây ngô với độ dài ngày cho thấy cây ngô hình thành các kiểu hình thái khác nhau D.Azit đã chỉ ra rằng: Các giống ngô ở châu Âu do kết quả chọn lọc đã hoàn thành được chu kỳ ánh sáng trong điều kiện ngày dài, loại trừ được yêu cầu ngày ngắn Cuperman và Razumov cho rằng rút ngắn thời gian chiếu sáng ban ngày đến 12 giời sẽ thúc đẩy sự trổ cờ và hình thành bắp.

Ánh sáng ảnh hưởng đến sinh trưởng của cây ngô ở hai mặt là số giờ chiếu sáng và chất lượng ánh sáng Những tia sáng dài đã kìm hãm sự sinh trưởng của cây ngô, các tia sáng ngắn lại thúc đẩy sự phát triển Nghiên cứu của Cuperman đã xác định thời gian chiếu sáng và chất lượng ánh sáng đã gây ảnh hưởng rất lớn đến sự phát triển của bắp và bông cờ của cây ngô Trong điều kiện chiếu sáng bằng ánh sáng trắng và xanh lam thì sự phát triển của cây diễn ra nhanh nhất Trong diều kiện chiếu sáng bằng ánh sáng đỏ thì

sự phát triển của bông cờ hầu như không bị ảnh hưởng nhưng sự hình thành của bắp chậm lại Ánh sáng lục kìm chế sự sinh trưởng và phát dục của bắp 1.1.3.3 Yêu cầu về nước

Ngô là cây trồng cạn, bộ rễ ngô phát triển rất mạnh, hút nước khỏe và

sử dụng tiết kiệm nước Cây ngô sinh trưởng nhanh tạo ra sinh khối lớn Do vậy cây cần một lượng nước rất lớn Trung bình cây ngô trong một chu kỳ sống cần khoảng 200 lít nước để sinh trưởng và phát triển Ở các thời kì sinh trưởng khác nhau cây ngô yêu cầu lượng mưa và lượng nước tưới khác nhau Cây ngô không chịu được úng, độ ẩm của đất quá cao, lớn hơn 80% có ảnh hưởng xấu đến sinh trưởng phát triển của cây ngô, đặc biệt là từ lúc cây mọc đến khi cây được 8 lá Vào giai đoạn này chỉ cần ngập nước 1 – 2 ngày cây ngô cũng có thể bị chết úng Ẩm độ thích hợp khoảng 70%.

1.1.3.5 Yêu cầu chế độ không khí trong đất

Để thu hoạch sản lượng ngô cao, ngoài việc cung cấp nước và dinh dưỡng còn phải chú ý đến chế độ không khí ở trong đất Chế độ không khí

ảnh hưởng gián tiếp thông qua nhiều khâu khác nhau như là vi sinh vật, quá trình biến đổi hóa học trong đất Cây ngô đặc biệt là rễ ngô phát triển tốt trong điều kiện háo khí, nếu đất chặt bí thiếu tơi xốp thì rễ ngô phát triển kém, ăn nông, rễ ngắn ít lông hút, khả năng hút dinh dưỡng khoáng và nước kém Dẫn đến tình trạng cây ngô thiếu dinh dưỡng sẽ sinh trưởng, phát triển kém

1.1.4 Vai trò các chất dinh dưỡng với cây ngô[17],[21]

1.1.4.1 Vai trò của đạm

Đạm là yếu tố dinh dưỡng quan trọng nhất, đóng vai trò tạo năng suất

và chất lượng của ngô, 66% đạm được tích luỹ trong hạt Cây ngô hút đạm tăng dần từ khi cây có 3 – 4 lá tới trước trổ cờ Ở nước ta, một số kết quả nghiên cứu cho thấy thời kỳ hút đạm mạnh nhất là 6 – 12 lá và trước khi trổ

cờ, nếu các giai đoạn này mà thiếu đạm thì năng suất giảm rõ rệt.

Triệu chứng thiếu đạm ở ngô: cây thấp, lá nhỏ có màu vàng, các lá già

có vệt xém đỏ, cây sinh trưởng chậm, cằn cỗi, cờ ít, bắp nhỏ, năng suất thấp 1.1.4.2 Vai trò của lân

Lân có vai trò quan trọng với cây ngô tuy nhiên khả năng hút lân ở giai đoạn cây non lại rất yếu Thời kỳ 3 – 4 lá, cây ngô hút không được nhiều lân,

đó là thời kỳ khủng hoảng lân của ngô, nếu thiếu lân trong giai đoạn này sẽ làm giảm năng suất nghiêm trọng Cây ngô hút nhiều lân nhất ( khoảng 62% tổng lượng lân yêu cầu) ở thời kỳ 6 – 12 lá sau đó giảm đi ở các thời kỳ sau

Triệu chứng thiếu lân của ngô biểu hiện bằng màu huyết dụ trên bẹ lá

và gốc cây, trái cong queo Trường hợp thiếu nặng lá sẽ chuyển vàng và chết Hiện tượng này xảy ra ở lá già trước, sau đó chuyển sang lá non và phổ biến ở ngô vụ đông trong điều kiện thời tiết khắc nghiệt.

1.1.4.3 Vai trò của kali

Kali có vai trò rất quan trọng tới sự sinh trưởng, phát triển và năng suất của ngô Kali tích luỹ nhiều ở thân, lá (khoảng 80%) và tích luỹ trong hạt ít hơn Cây ngô hút kali mạnh ngay từ giai đoạn sinh trưởng ban đầu Từ khi cây mọc tới trổ cờ ngô đã hút khoảng 70% lượng kali cây cần

Thiếu kali, protein và sắt sẽ tích tụ gây cản trở quá trình vận chuyển chất hữu cơ Thiếu kali là nguyên nhân rễ ngang phát triển mạnh, rễ ăn sâu kém phát triển, do đó cây dễ đổ Thiếu kali thể hiện ở các triệu chứng như chuyển nâu và khô dọc theo mép và chóp lá, bắp nhỏ, nhiều hạt lép ở đầu bắp (bắp đuôi chuột) và năng suất thấp.

1.1.4.4 Vai trò các nguyên tố vi lượng

Đối với cây ngô, các chất vi lượng thường thiếu là kẽm và molypđen Thiếu kẽm lá có màu trắng (bệnh bạch tạng), giữa các gân lá có những dải màu vàng sáng, các lóng ngắn lại Hiện tượng thiếu kẽm thường xảy ra trên đất kiềm, nghèo mùn, đất giàu lân dễ tiêu hay bón quá nhiều lân Thiếu molypđen lá chuyển xanh nhạt, lá non teo lại và héo, nặng hơn lá ngọn không bung ra được, có nhiều vết xém vàng.

1.2 Tổng quan về vi khuẩn cố định Nitơ (N )

Vi sinh vật cố định N có một vai trò quan trọng trong chu trình tuần hoànN2 và cung cấp một lượng N đáng kể cho cây trồng Theo tính toán của các nhàkhoa học, các nhóm vi sinh vật cố định N BNF (Biological nitrogen fixation) cóthể cung cấp tới 240 x 106 tấn N/năm trên cả hành tinh, gấp 6 lần lượng N mà cảthế giới sản xuất bằng con đường hóa học

Vi sinh vật cố định N là các nhóm vi sinh vật có khả năng chuyển hóa khíN2 dồi dào trong không khí (79%) thành dạng NH4+ cung cấp cho cây Vi khuẩn

cố định N gồm có hai nhóm lớn:[5]

- Vi khuẩn cố định N tự do gồm:

+ Vi khuẩn cố định N tự do hiếu khí: Azotobacter và Beijerinskia sp + Vi khuẩn cố định N kỵ khí: Vi khuẩn thuộc nhóm Clostridium.

- Vi khuẩn cố định N cộng sinh như cộng sinh với rễ cây họ đậu

Rhizobium, cộng sinh với rễ lúa Azoarcus,

1.2.1 Vi khuẩn cố định N tự do

1.2.1.1 Vi khuẩn cố định N tự do hiếu khí

Nhóm này gồm hai chi chính là Beijerinskia sp và Azotobacter sp.[5]

- Beijerinskia sp.

Được phân lập bởi Starkey (1939), là loại có đặc điểm giống với Azotobacter

sp Tế bào có hình dạng thay đổi như hình cầu, hình que, hình bầu dục Beijerinski là vi khuẩn gram âm, không sinh bào tử Có khả năng sống tốt trong

môi trường axit ( pH=3) Vi khuẩn có khả năng cố định được 16 - 20 mg N khiđồng hóa hết 1g dinh dưỡng Carbon Ngoài khả năng cố định N chúng còn cókhả năng tổng hợp các chất kích thích sinh trưởng cho cây trồng

- Azotobacter sp

Là vi khuẩn gram âm, không sinh bào tử có khả năng cố định N tự do Khichưa trưởng thành tế bào thường có hình que, sinh sản bằng cách phân cắt, dichuyển nhờ tiêm mao Khi trưởng thành mất khả năng di chuyển, kích thước thunhỏ thành dạng cầu được bao bọc bởi một lớp nhầy

Khuẩn lạc của Azotobacter có dạng cầu lồi, nhẵn bóng, có khi nhăn nheo.

Các nòi phân lập từ tự nhiên có khả năng cố định 10 - 15mg N khi tiêu thụ hết 1gdinh dưỡng Carbon Một số nòi tuyển chọn có khả năng cố định tới 30mg/1gdinh dưỡng Carbon

Trong đất, Azotobacter tập trung ở vùng đất xung quanh rễ cây Ngoài khả

năng cung cấp dinh dưỡng N cho cây nó còn có khả năng kích thích nảy mầm,

kích thích sinh trưởng Trong đất, Azotobacter thường phổ biến các nòi sau:

+ Azotobacter chrococum: kích thước tế bào 2,0 x 3,1 micromet, có khả

năng di động khi còn non Khi già hình thành nang xác Khuẩn lạc có màu nâuhoặc đen khi về già, không khuếch tán ra môi trường

+ Azotobacter beijerinckii: có kích thước 2,4 x 4,6 micromet Không có

khả năng di động và hình thành nang xác Khuẩn lạc khi già có màu nâu sáng,sắc tố không khuếch tán ra môi trưòng nuôi cấy

+ Azotobacter vinelandii: tế bào có kích thước 1,5 x 3,4 micromet, có khả

năng di động và hình thành nang xác Khuẩn lạc màu lục huỳnh quang, sắc tốkhuếch tán vào môi trường

+ Azotobacter agilis: tế bào có kích thước 2,8 x 3,3 micromet, có khả

năng di động, không hình thành nang xác, khuẩn lạc màu vàng lục huỳnh quang,sắc tố khuếch tán vào môi trường [5]

1.2.1.2 Vi khuẩn cố định N tự do kỵ khí Clostridium

Clostridium được phát hiện lần đầu tiên bởi Vinogradxki (1893) Vi khuẩn Clostridium có kích thước 2,5 – 7,5 x 0,7 – 1,3 micromet, có thể đứng riêng rẽ

hoặc kẹp đôi thành chuỗi ngắn Bào tử hình bầu dục, có khả năng chịu được

nhiệt độ cao và khô hạn Clostridium có khả năng tích lũy được 10 - 15mg N

phân tử khi đồng hóa hết 1g đường Carbon [5]

1.2.2 Vi khuẩn cố định N cộng sinh

1.2.2.1 Các vi khuẩn sống cộng sinh với cây họ Đậu

Vi khuẩn cố định N cộng sinh với cây họ đậu còn gọi là vi khuẩn nốt sần.Chúng hình thành các nốt sần với rễ cây họ đậu như cây đậu tương, lạc, điềnthanh, muồng, cốt khí, trinh nữ, chúng sử dụng dinh dưỡng carbon của cây và

cố định N không khí để sử dụng và cung cấp một phần cho cây chủ

Gồm có: Rhizobium, Bradyrhizobium, Azorhizobium và Sinorhizobium[9].

- Rhizobium

Năm 1868, nhà khoa học Hà Lan M.W.Beijrinck đã phân lập được loài vikhuẩn sống cộng sinh trong nốt sần ở rễ một cây thuộc bộ đậu, ông đã đặt tên là

Basilusradicicola.

Năm 1889, vi khuẩn này được xếp vào chi Rhizobium ( B.Frank, 1989).

Trên môi trường đặc, chúng có khuẩn lạc trơn bóng, nhầy, khi còn non có khảnăng di động nhờ tiêm mao, khi tế bào già trở nên bất động

Rhizobium thuộc loại hảo khí ưa pH trung tính hoặc kiềm ( pH từ 6,5

-7,5), nhiệt độ thích hợp 24 – 260C Chúng xâm nhiễm vào rễ cây bộ đậu thôngqua lông hút, đôi khi qua vết thương ở vỏ rễ Dưới ảnh hưởng của vi khuẩn, rễtiết ra enzyme polyalacturonase phân huỷ thành lông hút tạo điều kiện cho vikhuẩn xâm nhập vào rễ Theo tính toán của các nhà khoa học nhóm vi khuẩn này

có khả năng cung cấp cho cây 80 -120kg N/ ha

- Bradyrhizobium

Vi khuẩn hình que, kích thước trung bình 0,5 - 0,9 x 1,2 - 3,0 µm, thườngchứa chất dự trữ PHB Trên môi trường đặc, khuẩn lạc của chúng có dạng trơn,bóng, nhầy, không màu

Bradyrhizobium là vi khuẩn hiếu khí, tuy nhiên chúng có thể phát triển

được ngay trong trường hợp chỉ có một áp lực oxy rất thấp khoảng 0,001atm.Chúng phát triển thích hợp ở pH= 6,5 - 7,5 Nhiệt độ phát triển thích hợp là 24 –

260C, nhiệt độ 370C sự phát triển của chúng bị cản trở một cách rõ rệt

- Azorhizobium

Azorhizobium là một giống mới được đề nghị với một loài là Azorhizobium caulinodans chính là các vi khuẩn cộng sinh ở rễ và thân của Sesbania rostrata

- Sinorhizobium

Gồm các vi khuẩn phát triển nhanh, cộng sinh ở nốt rễ cây đậu nành được

phân lập từ Trung Quốc Giống Sinorhizobium gồm có 2 loài là Sinorhizobium fredii và Sinorhizobium xinjiangensis

1.2.2.2 Các vi khuẩn sống cộng sinh với cây không thuộc họ Đậu

- Vi khuẩn lam (Cyanobacteria): Một số vi khuẩn lam tự dưỡng đạm hay

thanh tảo sống chung với nhiều vi sinh vật chân hạch, từ các loại nấm cho đếncác thực vật hạt kín [5]

- Azospirillum

Phát hiện năm 1974, là vi khuẩn Gram âm có dạng xoắn, sống tự do, đườngkính 1µm, dài 2,1 - 3,8µm chuyển động trong môi trường lỏng bởi một tiêm maodài ở đầu ( polan flagellum), trong môi trường đặc ở 300C nhiều tiêm mao bên(lateral flagellum) ngắn hơn cũng được thành lập

Trong những năm gần đây người ta phát hiện nhiều nhóm vi khuẩn nàysống ở trong vùng rễ, trong rễ cây, thân cây và lá các cây không thuộc họ đậunhư lúa, bắp, mía, sorghum, và một số loại cỏ

Azospirillum giúp tăng năng suất lúa từ 32 - 81% ở điều kiện nhà lưới

(Mirza và ctv, 2000; Malik và ctv, 2002) Nhưng ở điều kiện ngoài đồng vikhuẩn nầy chỉ làm tăng năng suất lúa được 10 - 30% [9]

Azospirillum tăng sinh ở cả trong điều kiện hiếu khí và kỵ khí với sự hiện

diện hoặc không có hợp chất nitơ trong môi trường, nhưng thích hợp là vi hiếukhí Nhiệt độ tối hảo từ 35 - 370C Một số dòng Azospirillum là những vi sinh vật

tự dưỡng không bắt buộc Vi khuẩn Azospirillum phát triển tốt trên muối của

những acid hữu cơ như malate, succinate, hay pyruvate Fructore và nhữngđường đôi khác cũng có thể được vi khuẩn sử dụng như là nguồn carbon Một

số dòng Azospirillum cần biotin cho sự phát triển của chúng [5], [9].

Ngoài khả năng cố định nitơ chúng còn có khả năng khử nitrat, chống lại

vi khuẩn gây bệnh thối lá ở cây dâu tằm Theo Eckert (2001) chi Azospirillum

có 7 loài là: A brasilense; A lipoferum ; A amazonense; A irakense; A halopraeferens; A largimobile và A doebereineae [35].

Một số báo cáo gần đây cho thấy vi khuẩn này có thể tiết ra những kíchthích tố tăng trưởng như: IAA (Indole - 3 - acetic acid), IBA (Indole - 3 - butyricacid), ABA (abscisic acid) và cytokynins Những kích thích tố đó làm tăng chiềudài rễ, tăng thể tích rễ và số lượng rễ Từ đó, chúng làm tăng khả năng hấp thukhoáng chất và nước, tăng khả năng sinh trưởng và phát triển cũng như tăngnăng suất của cây Ngoài ra, chúng còn giúp cho cây chống chịu được điều kiệnkhô hạn

- Gluconacetobacter diazotrophicus [9].

Năm 1988, được Cavalcante V A và Dobereiner J phân lập lần đầu tiên từ

rễ và thân cây mía trồng ở nhiều khu vực khác nhau trên khắp Brazil

G diazotrophicus là vi khuẩn Gram âm; ưa acid; vi hiếu khí bắt buộc; tế

bào dạng que thẳng tròn đầu ( 0,7 - 0,9µm đến khoảng 1 - 2µm) tồn tại ở dạngđơn, đôi hoặc chuỗi mà không có nội bào tử; sử dụng đường (glucose, fructose,sucrose…) ở nồng độ khác nhau làm nguồn C nhưng tăng trưởng tốt nhất là ởnồng độ sucrose 10% và pH = 5,5

G diazotrophicus có khả năng cố định đạm và sản xuất ra hormone thực vật ( auxin, gibberellin), có thể hoà tan Zn và phosphorus nên G diazotrophicus

được xem là một loài vi khuẩn đầy hứa hẹn, với khả năng cung cấp gần một nửanitơ cố định được ở dạng hữu ích cho cây [9]

- Herbaspirillum [9].

Herbaspirillum là các vi khuẩn hình que, Gram âm, rộng khoảng 0,5

-0,6µm Chúng sinh trưởng tốt trong môi trường có dicarboxylic và tổng hợp nitơtrong một khoảng pH biến thiên từ 5,3 - 8 Trong môi trường bán đặc vi khuẩn

Herbaspirillum tạo thành một lớp màng mỏng, trắng, mịn ( pellicle) Khi cấy

chuyển lên môi trường đặc JNFb thì lớp màng này phát triển thành khuẩn lạcnhỏ, ẩm, ánh xanh và trên môi trường đặc BMS thu được khuẩn lạc màu trắngsữa

Herbaspirillum có khả năng cố định đạm cộng sinh trong mô của những

cây thân cỏ như: Lúa, bắp, mía, sorghum, chuối và khóm Ngoài ra chúng còntạo ra những sản phẩm của phytohormones như auxins và gibberillins rất tốt cho

sự tăng trưởng của cây

- Burkholderia [9].

Vi khuẩn Burkholderia thuộc vi khuẩn Gram âm, có hình dạng hình que,

đường kính khoảng 1µm, chúng có thể di chuyển nhờ các chiên mao ở đầu( Jesús et al, 2004)

Burkholderia sinh trưởng và phát triển trong điều kiện kỵ khí hoặc hiếu

khí, nhưng trong môi trường ít khí oxy thì phát triển tốt nhất, chúng phát triển sâutrong môi trường nuôi cấy từ 1 - 4mm (Paulina et al, 2001) Trong môi trườngnuôi cấy chúng tạo thành các khuẩn lạc màu trắng hoặc hơi vàng, đường kínhkhoảng 2 - 4mm, tròn, phẳng hoặc dài (Jesús et al, 2004)

Burkholderia sống cộng sinh với cây trồng và có khả năng cố định đạm.Ví

dụ như khi các vi khuẩn Burkholderia sống cộng sinh với cây luá sẽ cố định

đạm khoảng 19% tổng lượng đạm cần thiết cho nhu cầu của cây lúa Năng suất

của cây lúa có chủng loài Burkholderia vietnamiensis tương đương với năng suất của cây lúa không chủng loài Burkholderia vietnamiensis nhưng có bón phân

đạm 25 - 30kg/ha (Van et al, 2000)

1.3 Tình hình nghiên cứu ngoài nuớc

Hiệu quả của việc nhiễm chế phẩm Azotobacter sp cho đất và hạt giống,

cây con đã được chứng minh trên các thí nghiệm đồng ruộng Theo nghiên cứu

của Puneet (1998) cho thấy việc nhiễm Azotobacter sp kích thích nẩy mầm của

hạt, kích thích ra rễ và sinh trưởng, năng suất lúa mì, ngô tăng 10-15% so với đốichứng [32]

Tổng kết các kết quả nghiên cứu của Nhật Bản, Hoa Kỳ, Trung Quốc, Ấn

Độ cho thấy sử dụng chế phẩm Azotobacter có thể cung cấp cho cây trồng từ

30-60 kg N/ha/năm và tổng lượng N do vi sinh vật tổng hợp trên hành tinh có thể

đạt đến 240 triệu tấn/năm Vi khuẩn cố định N tự do Azotobacter còn có khả

năng tổng hợp B1, giberellin, cytokinin kích thích tăng trưởng cây trồng [35]

Fulchieri (1993) nghiên cứu sử dụng 3 chủng Azospirillum để xử lý hạt

cho ngô Kết quả cho thấy đã làm tăng chiều cao cây, tăng sinh khối và tăngnăng suất ngô lên 59% so với đối chứng, các chủng này có thể cung cấp khoảng

60 kg N/ha [35]

Nghiên cứu của Puneet (1998) cũng cho thấy nếu bón phối hợp

Azotobacter sp với các chủng phân giải P như Aspergillus niger sẽ làm tăng

năng suất lúa mì tăng 17,7%, trong khi Azotobacter chỉ tăng 9% Kapoor cũng cho kết quả tương tự khi phối hợp chủng Azotobacter sp với các chủng phân giải phosphat như Bacillus sp, Pseudomonas sp Thí nghiệm làm tăng năng suất lúa,

bông vải lên 10-20% [32]

El-Komy (2005) nghiên cứu phối hợp hai chủng cố định N Azospirillum

và phân giải lân Bacillus megaterium xử lý cho lúa mì Kết quả cho thấy hàm

lượng N trong thân lúa mì của các thí nghiệm có xử lý hai chủng này tăng 53%; hàm lượng P trong thân tăng 48,6%; hàm lượng K tăng 10-14,3% so vớiđối chứng không xử lý Kết quả nghiên cứu cũng cho thấy xử lý phối hợp haichủng có tác dụng cộng hưởng, tốt hơn xử lý đơn chủng [35]

37-Zemrany (2006) nghiên cứu sử dụng chủng A lipoferum cho ngô Kết quả

cho thấy khi sử dụng chủng này đã làm giảm 50% lượng N cho cây mà năng suấtngô vẫn đảm bảo [35]

Abbas Akbari và cộng sự (2007) đã phân lập và tuyển chọn được một số

chủng Azospirillum sp có khả năng sinh tổng hợp IAA kích thích sinh trưởng của cây lúa mì Kết quả là sự nhiễm các chủng Azospirillum ssp đã làm tăng đường

kính gốc lúa, chiều dài rễ, trọng lượng khô và số lượng lông rễ so với đối chứng[29]

Elazar Fallik and Yaacov Okon ( 1996) nghiên cứu sử dụng Azospirillum brasilense kết hợp với than bùn cho Setaria italica và ngô Kết quả cho thấy

chiều dài thân, trọng lượng khô, năng suất tăng đáng kể Sinh khối vi khuẩn là

108 CFU/1g than bùn có hiệu quả gây nhiễm hạt giống cao nhất [26]

Fabricio Cassa´n và cộng sự ( 2009) đã nghiên cứu phối hợp hai chủng

Azospirillum brasilense Az39 và Bradyrhizobium japonicum E109 xử lí cho ngô

và đậu tương Kết quả cho thấy xử lí phối hợp hai chủng cho hiệu quả cao hơn sovới xử lí đơn chủng Tỉ lệ nảy mầm, chiều cao cây, chiều dài rễ, trong lượng khôđều tăng so với đối chứng [27]

Cristiana Felici và cộng sự (2008) đã nghiên cứu phối hợp hai chủng

Bacillus subtilis và Azospirillum brasilense xử lý cho cà chua Kết quả cho thấy

khi phối hợp hai chủng cho hiệu quả kém hơn so với xử lý đơn chủng [24]

G Holguin, C L Patten, B R Glick (1999) đã tổng hợp nghiên cứu về di

truyền và sinh học phân tử của vi khuẩn Azospirillum, cho thấy các gen nif H, nif

DK quy định tổng hợp nitrogennase cần cho quá trình cố định đạm của vi khuẩn[28]

Martı´n Dı´az-Zorita và cộng sự (2009) đã nghiên cứu xử lý gây nhiễm vi

khuẩn Azospirillum cho lúa mì, trong điều kiện trồng khô hạn Kết quả cho thấy

cây tăng trưởng tốt, tăng chiều cao, đường kính gốc, hàm lượng tích lũy chất khôtăng, năng suất hạt khô tăng 260kg/ha, tương đương sản lượng tăng 8% (so vớiđối chứng [30]

Andres D Naiman và cộng sự ( 2009) đã nghiên cứu xử lý gây nhiễm vi

khuẩn Azospirillum brasilense và Pseudomonas fluorescens cho lúa mì Kết quả

cho thấy chiều cao cây tăng 12%, đường kính gốc thân tăng 40%, năng suất tăng16% [23]

1.4 Nghiên cứu trong nước

Nhằm mục tiêu phát triển nông nghiệp sinh thái bền vững và ứng dụngCNSH vào nông nghiệp, trong những năm gần đây Việt Nam có khá nhiều

nghiên cứu về Azotobacter và Azospirillum làm phân sinh học

Phạm Bích Hiên và cộng sự ( 2003) đã nghiên cứu 10 chủng Azotobacter

của Việt Nam và nhận thấy rằng ngoài khả năng cố định N chúng còn có khảnăng sinh tổng hợp chất kích thích sinh trưởng IAA Nhiệt độ thích hợp của cácchủng này là 25-300C, pH thích nghi rộng từ 5,5- 8,0 [8]

Phạm Ngọc Lan (1999) đã phân lập được 37 chủng Azotobacter trên đất

gò đồi vùng Thừa Thiên - Huế Nhóm nghiên cứu cũng tuyển chọn được haichủng có khả năng kháng kháng sinh, tồn tại được ở pH kiềm ( pH = 8) Kết quảthử nghiệm gây nhiễm cây giống keo tai tượng trong vườn ươm đã làm tăng tỷ lệ

sống, sinh khối, chiều cao cây và hàm lượng N trong lá cũng cao hơn so với đốichứng [13]

Nguyễn Thị Phương Chi (1999) nghiên cứu bón thử nghiệm chủng cố

định N tự do Azotobacter và chủng phân giải phosphate Archomobacter, Pseudomonas aeruginosa Kết quả cho thấy chế phẩm sinh học làm tăng sinh

trưởng chiều cao mạ 7,47 - 16,93% và năng suất lúa tăng từ 13,39 – 55,85% [3]

Lâm Minh Tú, Trần Văn Tuân (2003) nghiên cứu sản xuất một số phânbón đơn chủng, đa chủng cho cây trồng Các chủng sử dụng trong nghiên cứu là

Azotobacter bejerinski, Azotobacter vinelandii, Bacillus subtilis, Bacillus polymyxa Thử nghiệm trên khoai tây làm tăng năng suất từ 100 - 300% so với

đối chứng [20]

Phạm Văn Toản (2003) sử dụng phân bón sinh học giảm được 20% phânbón vô cơ N, P, K nhưng năng suất khoai tây vẫn tăng so với đối chứng 15-50%,

cà chua tăng 12-34%, lạc tăng 30% và giảm đáng kể bệnh héo xanh [19]

Nguyễn Ngọc Dũng, Hồ Thị Kim Anh (1999) nghiên cứu ảnh hưởng củacác chủng cố định N trong rễ lúa đến sinh trưởng của mầm lúa CR 203 Nhómtác giả đã phân lập được 78 chủng cộng sinh với rễ lúa Các chủng này có đặc

điểm của chi Azospirillum Các chủng này kích thích sự nảy mầm và rễ của lúa

CR 203 [1]

Lăng Ngọc Dậu (2004) đã nghiên cứu khả năng tạo IAA của vi khuẩn

Azospirillum lipoferum, tiến hành nuôi cấy chủng vi khuẩn này trên môi trường

Nfb có bổ sung Tryptophan, theo dõi tại những thời điểm khác nhau Kết quảcho thấy tại thời điểm 10 ngày sau khi cấy ủ khả năng tao IAA cao nhất [4]

PHẦN II NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Nội dung nghiên cứu

Để đạt được mục tiêu của đề tài chúng tôi tiến hành nghiên cứu các nộidung sau:

1 Phân lập và mô tả đặc điểm sinh học một số chủng Azospirillum

2 Tuyển chọn các chủng Azospirillum có khả năng cố định đạm bằng

nghiên cứu thử nghiệm trên cây ngô

3 Nghiên cứu xây dựng quy trình nhân sinh khối của các chủng

Azospirillum được tuyển chọn.

2.2 Vật liệu và địa điểm nghiên cứu

2.2.1 Vật liệu và thiết bị nghiên cứu

* Vật liệu:

- Các chủng vi khuẩn cố định đạm Azospirillum được phân lập từ rễ cây

ngô trong giai đoạn trổ cờ tại huyện Krông Nô, Cư Jut, Đăk Mil thuộc tỉnh ĐăkNông

- Giống ngô lai C919 cung cấp bởi Công ty Monsanto Việt Nam.

- Vi khuẩn Azospirillum lipoferum AL10 do viện nghiên cứu và phát triển

Công Nghệ Sinh học - Đại học Cần Thơ cấp

- Cặp mồi chuyên biệt để nhận diện Azospirillum lipoferum được Viện

nghiên cứu và phát triển Công Nghệ Sinh học, Trường Đại học Cần Thơ thiết kế

dựa theo trình tự gen nif H của vi khuẩn Azospirillum lipoferum gồm:

+ Mồi xuôi: 5’-GTA AAT CCA CCA CCT CCC-3’ và

+ Mồi ngược: 5’ -TGT AGA TTT CCT GGG CCT-3’

* Hóa chất: Acid Malic, KH2PO4, Na2MoO4, CuSO4, ZnSO4, Saccarose,

Agar, Biotin, Pyridoxine

* Thiết bị nghiên cứu: Đĩa petri, micropipette, que cấy, box cấy vô trùng,

máy quang phổ spectrophotometer Plus 100 (Nhật Bản), máy ủ nhiệt, nồi hấp

khử trùng, PCR C1000 (Biorad, Mỹ); GelDoc (Biorad, Mỹ); Điện di Biorad(Mỹ).

2.2.2 Địa điểm nghiên cứu

- Địa điểm thu mẫu: được thực hiện tại các huyện Krông Nô, Cư Jut, ĐăkMil thuộc tỉnh Đăk Nông

- Địa điểm thí nghiệm: được thực hiện tại Bộ môn Sinh học thực vật,Khoa Nông Lâm nghiệp, Phòng thí nghiệm CNSH & MT, Trường Đại học TâyNguyên

- Địa điểm thực nghiệm: tại Trại thực nghiệm Khoa Nông Lâm nghiệp,

trường Đại học Tây Nguyên

2.2.3 Thời gian nghiên cứu

Đề tài thực hiện từ tháng 08/2010 tới tháng 08/2011

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Phương pháp thu mẫu

Rễ cây ngô trong giai đoạn trổ cờ thuộc các giống khác nhau được thuthập một cách ngẫu nhiên, mỗi ruộng lấy năm cây (4 cây ở 4 góc và 1 cây ở giữaruộng) tại các huyện Krông Nô, Cư Jut, Đăk Mil thuộc tỉnh Đăk Nông Toàn bộ

bộ rễ được đựng trong túi nilon đã khử trùng Các mẫu sau khi lấy được ghi nhãnnơi lấy, ngày lấy và người thu mẫu Mẫu rễ cây ngô sau khi thu được đem tớiphòng thí nghiệm, rửa thật sạch đất bám ở rễ dưới vòi nước chảy, để ráo tựnhiên, để riêng từng mẫu rồi tiến hành phân lập hoặc bọc riêng từng mẫu trongtúi nilon đã khử trùng buộc chặt và bảo quản trong tủ lạnh (50C) nếu chưa phânlập ngay [5], [17]

2.3.2 Phương pháp phân lập

Cắt rễ thành những khúc nhỏ 2 - 3cm Các mẫu rễ được để riêng trong cácbình tam giác tiến hành khử trùng bề mặt Rễ được khử trùng bằng dung dịchchloromine 1% trong 30 phút, tiếp tục khử trùng bằng cồn 700 5 phút, H2O2 3phút rồi rửa thật sạch bằng nước cất vô trùng (6 lần) Sau đó lấy khoảng 2g mẫu

cho vào cối giã nhuyễn rồi thêm 0,5 - 2ml nước cất vô trùng vào cối, để yên 10phút và hút lấy phần trong cho vào eppendorf, để yên 10 phút cho dịch mẫu lắngxuống và lấy phần nước trong để tiến hành phân lập Lấy 0,5ml dịch nghiền rễcho vào ống nghiệm chứa 5ml môi trường NFb bán đặc (không đạm) Ủ ở nhiệt

độ 320C trong vòng 4 - 5 ngày, mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần

Quan sát những ống nghiệm có vòng đậm (vòng pellicle), cách bề mặt

môi trường 2 – 5 mm chỉ thị có sự hiện diện của vi khuẩn Azospirillum Chuyển

vi khuẩn từ môi trường bán đặc sang môi trường đặc tiến hành làm thuần giống[21]

Làm thuần giống: Cấy ria các khuẩn lạc được lựa chọn lên các đĩa petrichứa môi trường NFb đặc để thu khuẩn lạc đơn Quá trình làm thuần được tiếnhành 2 - 3 lần Chọn khuẩn lạc đơn đã được làm thuần cấy chuyền vào ống thạchnghiêng để giữ giống [5], [21]

* Môi trường Nfb không đạm: [25], [34]

- 2ml dung dịch vi lượng (200mg Na2MoO4 .2H2O, 235mg MnSO4.H2O,

280 mg H3BO3, 8 mg CuSO4.5H2O, 24 mg ZnSO4.7H2O hòa tan trong 200

* Môi trường đặc có chứa 15g/lít agar (Dobreigner, 1995)

2.3.3 Phương pháp mô tả đặc điểm hình thái, đặc điểm sinh học của các

chủng Azospirillum

Mô tả các đặc điểm hình thái của các chủng dưới kính hiển vi, xác địnhđặc điểm sinh học và định danh theo khoá phân loại của Bergey 1994

2.3.4 Phương pháp xác định khả năng tạo IAA của các chủng Azospirillum

Đánh giá khả năng tạo IAA của các chủng Azospirillum dựa trên nồng độ

IAA có trong dich chiết từ dịch nuôi cấy vi khuẩn Nồng độ IAA có trong dịchchiết càng cao chứng tỏ khả năng tạo IAA của chủng vi khuẩn càng mạnh Nồng

độ IAA được xác định bằng phương pháp so màu Salkowski ở bước sóng 530nm

* Phương pháp xác định phương trình đường chuẩn của mối tương quangiữa chỉ số OD530nm và nồng độ IAA

- Chuẩn bị dung dịch đệm phosphat ( 200ml)

A: KH2PO4 0,136g/100ml nước cất;

B: K2HPO4 0,174g/100ml nước cất;

Lấy 39ml A + 61ml B cho thêm nước cất vừa đủ 200ml, điều chỉnh pH 7

- Chuẩn bị thuốc thử Salkowski

Lấy 553 ml H2SO4 (98%) cho vào nước cất đủ 1 lít, để nguội sau 12 giờđược dung dịch H2SO4 đậm đặc 10,8M

Cân 4,5g FeCl3 cho vào 1 lít H2SO4 10,8M đã pha ở trên để được thuốcthử Salkowski

- Chuẩn bị đường chuẩn IAA

Cân 1,6 mg IAA tổng hợp hòa tan với 10 ml dung dịch đệm phosphatđược nồng độ là 160mg/l Sau đó tiến hành pha loãng ra các nồng độ 0, 5, 10, 16,

20, 40, 80 mg/l

Lấy 4 ml thuốc thử cho vào các ống nghiệm có nồng độ IAA khác nhau cóthể tích 2 ml, mỗi nồng độ lặp lại 3 lần

Để 10 phút trong tối ở nhiệt độ phòng để phản ứng xảy ra hoàn toàn, sau

đó tiến hành đo OD ở bước sóng 530 nm

Từ kết quả trên, chúng tôi xác định được phương trình đường chuẩn củadung dịch IAA thông qua chỉ số OD530nm Dựa vào phương trình đường chuẩn đểxác định nồng độ IAA ( mg/l) do các vi khuẩn tạo ra có trong môi trường nuôicấy

Bảng nồng độ IAA thành lập đồ thị đường chuẩn

Thể tích IAA 160 mg/l 0 1,0 0,50 0,25 0,20 0,125 0,0625Dung dich đệm (ml) 2,0 1,0 1,50 1,75 1,80 1,875 1,9375Tổng thể tích (ml) 2,0 2,0 2,0 2,0 2,0 2,0 2,0

Thuốc thử Salkowski

Thực hiện nuôi cấy các chủng Azospirillum phân lập được trên môi trường

chiết khoai tây (BMS) Chuẩn bị môi trường lỏng trong các bình tam giác, mỗibình chứa 50ml dịch môi trường, hấp khử trùng, để nguội Tiến hành cấy các

chủng Azospirillum vào các bình tam giác chứa môi trường đã khử trùng Nuôi ở

nhiệt độ phòng, trên máy lắc xoay vòng 150 vòng/phút Sau 72h thu dịch nuôicấy và li tâm 8000 vòng/phút, li tâm 4 phút, lấy dịch trong để đo lượng IAAđược vi khuẩn tổng hợp và tiết ra môi trường bằng phương pháp so màuSalkowski ở bước sóng 530 nm, thí nghiệm được lặp lại 3 lần

2.3.5 Phương pháp tuyển chọn các chủng Azospirillum có khả năng cố định

đạm bằng nghiên cứu thử nghiệm trên cây ngô

Đánh giá hoạt tính cố định đạm của các chủng Azospirillum dựa trên N

tổng số có trong lá và các chỉ tiêu sinh trưởng của cây ngô N tổng số có trong lá

và các chỉ tiêu sinh trưởng của cây ngô của các lô thực nghiệm càng cao hơn sovới lô đối chứng, chứng tỏ hoạt tính cố định đạm của chủng vi khuẩn càng mạnh.

* Phương pháp thí nghiệm: Hạt ngô lai C919 được khử trùng bằng H2O23% trong 3 phút, rửa lại 4 lần với nước cất Sau đó, cho hạt vào đĩa petri có bông

đã được khử trùng, với một ít nước và ủ cho tới khi hạt nứt mộng chuẩn bị nảy

mầm Rửa sạch hạt bằng nước cất Vi khuẩn Azospirillum được nuôi trong ống

nghiệm sau 72h lấy dịch sinh khối tế bào cho hạt ngô vào và ngâm 15 phút Sau

đó đem gieo 1 hạt/bầu đất Loại đất đóng bầu là đất đỏ Bazan chỉ lấy lớp đất mặt, mỗi bầu đóng khoảng 5 kg đất Mỗi chủng Azospirillum có 1 nghiệm thức, mỗi nghiệm thức có 15 bầu đất, thí nghiệm được lặp lại 3 lần

Nghiệm thức 1: Đối chứng không bón phân, không nhiễm vi khuẩn

Azospirillum

Nghiệm thức 2: Không bón phân, nhiễm vi khuẩn Azospirillum

Các chỉ tiêu theo dõi cây ngô sau khi gieo 45 ngày: Chiều cao cây, số lá trên cây, chiều dài lá, đường kính gốc, chiều dài rễ, khối lượng tươi, khô.

Các chỉ tiêu phân tích: Hàm lượng đạm tổng số, hàm lượng diệp lục

trong lá

* Phương pháp xác định hàm lượng đạm tổng số: Theo phương pháp

Kjeldanl [2],[14]

* Phương pháp xác định hàm lượng diệp lục: Hàm lượng diệp lục

(chlorophyll) và carotenoid được xác định bằng phương pháp so màu [36]

- Lấy 500mg lá, cắt nhỏ, ngâm trong 50ml aceton 80%, để trong tối

- Sau 3 ngày lấy toàn bộ dịch chiết định mức đến 100ml Sau đó lấy dịchchiết đo ở các bước sóng 663nm, 645nm và 440,5nm

Hàm lượng chlorophyll a (Ca), chlorophyll b (Cb) và carotenoid (Ccar)được tính theo công thức:

Ca = 0,0127 x OD663 - 0,00269 x OD645

Cb (mg x g-1) = 0,0299 x OD645 - 0,00468 x OD663

Ccar (mg x g-1) = 0,004695 x OD440,5 - 0,000268 x (Ca + Cb)

2.3.6 Phương pháp định danh các chủng Azospirillum được tuyển chọn

DNA được thực hiện trong thể tích 25 µl

Một phản ứng bao gồm: 1,0µL DNA vi khuẩn; 2,5µL 10X PCR buffer;1,0µL mồi xuôi; 1,0µL mồi ngược; 1,0µL dNTPs (dATP, dCTP, dGTP, dTTP);

0,5µL Taq polymerase; 18µL nước cất vô trùng.

Chu kỳ phản ứng PCR gồm các bước thứ tự như sau:

Bước 1: Biến tính các mẫu ADN ở 950C trong 5 phút

Bước 2: Thực hiện tiếp ở 950C trong 1 phút

Bước 3: Hạ nhiệt độ đến 550C trong 1 phút

Bước 4: Nâng nhiệt độ lên 720C trong 1 phút

Bước 2 đến bước 4 lặp lại 30 chu kỳ

Bước 5: Giữ ở 720C trong 10 phút

Bảo quản sản phẩm PCR ở 40C

Điện di gel chứa sản phẩm phản ứng PCR: Các sản phẩm sau khi đượckhuếch đại bằng phản ứng PCR, tiếp tục đem điện di trên gel agarose 1,2% có bổsung thêm ethidium bromide (EtBr)

2.3.7 Phương pháp nghiên cứu xây dựng quy trình nhân sinh khối của các

chủng Azospirillum được tuyển chọn

2.3.7.1 Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến

sinh khối của các chủng Azospirillum

Các chủng Azospirillum sẽ được nuôi trên 3 loại môi trường Nfb, Fallik,

môi trường nước chiết khoai tây ( BMS), ở nhiệt độ phòng, trên máy lắc xoayvòng 150 vòng/phút Sau 72 h tiến hành đo OD660 để xác định sinh khối tế bào.Mật độ tế bào được xác định tương quan OD660 = 1,0 tương đương với mật độ

109 tế bào/ml [26] Chọn môi trường thuận lợi nhất cho sinh trưởng của vi khuẩn

Azospirillum để tiến hành những thí nghiệm tiếp theo.

- Thành phần khoáng vi lượng, vitamin như môi trường phân lập

- Thêm nước cất cho đủ 1000ml

- Điều chỉnh pH: 6,8

* Môi trường nước chiết khoai tây (BMS) [12], [34]

- Nước chiết khoai tây: 500ml ( 200g/l )

- Acid Malic: 2,5g

- KOH: 2,0g

- Đường Sacarose: 2,5 g

- Thành phần khoáng vi lượng, vitamin như môi trường phân lập

- Thêm nước cất vừa đủ 1 lít

- pH điều chỉnh đến 6,8

2.3.7.2 Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến sinh

khối của các chủng Azospirillum

Tiến hành nuôi cấy các chủng Azospirillum trên môi trường thuận lợi nhất

chọn ra từ thí nghiệm trên, nuôi cấy ở nhiệt độ phòng, pH = 6,8 trên máy lắc 150vòng/phút Sau 24h, 48 h, 72h, 96h tiến hành đo OD660 để xác định sinh khối tế bào[6]

2.3.7.3 Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của tốc độ lắc đến sinh khối của

các chủng Azospirillum

Tiến hành nuôi cấy các chủng Azospirillum trên môi trường thuận lợi nhất

( môi trường ở dạng lỏng ) chọn ra từ thí nghiệm trên, nuôi cấy ở nhiệt độ phòng,

pH = 6,8 trên máy lắc xoay vòng ở các tốc độ 0, 100, 150, 200, 250 vòng/phút.Sau thời gian thuận lợi nhất chọn ra từ các thí nghiệm trên tiến hành đo OD660 đểxác định sinh khối tế bào [6]

2.3.7.4 Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của pH môi trường nuôi cấy

đến sinh khối của các chủng Azospirillum

Tiến hành nuôi cấy các chủng Azospirillum trên môi trường ( môi trường

ở dạng lỏng ), ở các pH 5,8; 6,3; 6,8; 7,3 và 7,8 Nuôi cấy ở nhiệt độ phòng, trênmáy lắc xoay vòng 150 vòng/phút Sau thời gian thuận lợi nhất chọn ra từ các thínghiệm trên tiến hành đo OD660 để xác định sinh khối tế bào [6]

2.3.7.5 Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy đến sinh

khối của các chủng Azospirillum

Tiến hành nuôi cấy các chủng Azospirillum cố định đạm trên môi trường,

pH thuận lợi nhất chọn ra từ các thí nghiệm trên ở các nhiệt độ 270C, 320C, 370C,

420C Sau thời gian thuận lợi nhất chọn ra từ các thí nghiệm trên tiến hành đoOD660 để xác định sinh khối tế bào [6]

2.3.8 Phương pháp đánh giá khả năng cố định đạm của các chủng vi khuẩn Azospirillum được tuyển chọn trên đồng ruộng

Hạt ngô lai C919 được khử trùng bằng H 2 O 2 3% trong 3 phút, rửa lại 4 lần với nước cất Sau đó, cho hạt vào đĩa petri có bông đã được khử trùng, với một ít nước và ủ cho tới khi hạt nứt mộng chuẩn bị nảy mầm Rửa sạch hạt bằng nước cất Các chủng vi khuẩn Azospirillum đã được tuyển chon được nuôi trong ống nghiệm sau 72 giờ lấy dịch sinh khối tế bào cho hạt ngô vào và ngâm 15 phút Với đối chứng thì ngâm bằng nước cất Sau đó đem gieo, mỗi hốc gieo 2 hạt

- Nghiệm thức 6: bón 50% phân đạm, nhiễm vi khuẩn Azospirillum chủng K25

- Nghiệm thức 7: bón 50% phân đạm, nhiễm vi khuẩn Azospirillum chủng D06

- Nghiệm thức 8: bón 75% phân đạm, nhiễm vi khuẩn Azospirillum chủng K17

- Nghiệm thức 9: bón 75% phân đạm, nhiễm vi khuẩn Azospirillum chủng K25.

- Nghiệm thức 10: bón 75% phân đạm, nhiễm vi khuẩn Azospirillum chủng D06.

- Nghiệm thức 11: bón 100% phân đạm, không nhiễm vi khuẩn Azospirillum

Diện tích mỗi ô thí nghiệm: 2m2 ( Chiều dài: 2m; Chiều rộng: 1m)

Tổng diện tích thí nghiệm: (11 ô x 2m2/ô) x 3 lần lặp lại = 66m2

+ Lượng phân bón cho 1 ha

Phân chuồng (hữu cơ): 8 tấn/ha

Phân vô cơ: 300kg Urea + 350kg Lân Văn Điển + 150kg KaliClorua(Theo qui trình của khuyến nông tỉnh Đak Lak)

+ Với nghiệm thức 8, 9, 10 thì bón lượng đạm là 22,5%.

+ Với nghiệm thức 11 thì bón lượng đạm 30%

- Lần 2: khi cây ngô có 7 – 9 lá ( sau gieo 30 – 35 ngày) Bón cách gốc 10 –15cm

+ Với nghiệm thức 5, 6, 7 thì bón lượng đạm 20%, kali là 50%

+ Với nghiệm thức 8, 9, 10 thì bón lượng đạm 30%, kali là 50%

+ Với nghiệm thức 11 thì bón lượng đạm 40%, kali là 50%

- Lần 3: khi cây ngô xoáy nõn ( sau gieo 40 – 45 ngày) Bón cách gốc 15cm + Với nghiệm thức 5, 6, 7 thì bón lượng đạm là 15%, kali là 50%

+ Với nghiệm thức 8, 9, 10 thì bón lượng đạm là 22,5%, kali là 50% + Với nghiệm thức 11 thì bón lượng đạm 30%, kali là 50%

* Các chỉ tiêu và phương pháp theo dõi

Cây theo dõi được xác định sau khi ngô mọc được 2 tuần Cây theo dõilấy ngẫu nhiên trong ô thí nghiệm, mỗi nghiệm thức đo 6 cây Đánh dấu cây theodõi để tiếp tục đo các lần sau Các chỉ tiêu theo dõi bao gồm: Chiều cao cây(cm), số lá trên cây, chiều dài lá (cm), 14 ngày đo 1 lần Đường kính gốc (mm)

đo vào tuần thứ 6 và thứ 8 sau khi ngô mọc, hàm lượng diệp lục trong lá Các chỉtiêu năng suất gồm: Chiều dài trái bắp, số hạt/hàng, số hàng hạt/trái, đường kínhtrái bắp, khối lượng khô 100 hạt

2.3.9 Phương pháp xử lý số liệu thống kê

Các số liệu được xử lý trên phần mềm MSTATC version 2.10 của Đại họcMichigan, Mỹ

Đồ thị tương quan và phương trình tương quan giữa chỉ số mật độ quang

OD với sinh khối tế bào, nồng độ IAA được xử lý trên phần mềm EXCELL

2003 của Microsoft Các biểu đồ khác cũng được xử lý trên phần mềm này

PHẦN III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1 Phân lập các chủng vi khuẩn Azospirillum trong rễ cây ngô tại một số

địa điểm của tỉnh Đăk Nông

Hình 3.1 Phân lập vi khuẩn từ môi trường bán đặc Nfb

Sau khi phân lập và làm thuần, chúng tôi thu được 43 chủng vi khuẩn cố

định đạm Azospirillum Trong đó, huyện Krông Nô phân lập được 22 chủng ký

hiệu K01, K03, K12, K15, K16, K17, K18, K19, K21, K22, K23, K25, K26,K33, K36, K37, K38, K39, K40, K51, K54, K55; huyện Cư Jut phân lập được 10chủng ký hiệu C01, C03, C05, C22, C23, C24, C31, C32, C33, C40; huyện ĐăkMil phân lập được 11 chủng ký hiệu D02, D04, D06, D07, D08, D09, D10, D15,D17, D46, D47 Điều này cho thấy những mẫu rễ ngô được lấy trên nền đấthuyện Krông Nô phân lập được vi khuẩn thuận lợi hơn so với mẫu rễ ngô đượclấy trên nền đất ở hai huyện còn lại

Các chủng vi khuẩn này đều có các đặc điểm hoàn toàn phù hợp với

những nghiên cứu trước đây về vi khuẩn Azospirillum, như nghiên cứu của

Nguyễn Khắc Minh Loan và Đào Thanh Hoàng (2005) [11], Nguyễn Hữu Hiệp,Ngô Ngọc Hưng và Nguyễn Thị Phương Tâm ( 2006) [10] Các chủng vi khuẩn

Vòng pellicle

phân lập được đều sinh trưởng và phát triển trong điều kiện vi hiếu khí, tạo thànhmột vòng pellicle trắng đục bên dưới môi trường Nfb bán đặc 2-5mm và làmbiến đổi màu môi trường từ màu xanh lá sang màu xanh dương.

3.2 Mô tả đặc điểm hình thái, đặc điểm sinh học của các chủng Azospirillum

Chúng tôi quan sát các đặc điểm khuẩn lạc của các chủng vi khuẩn và làmtiêu bản tế bào để xem trên kính hiển vi Các khuẩn lạc được quan sát bằng mắtthường và trên vật kính 4x và 10x Tiêu bản tế bào nhuộm gram được quan sát ởvật kính 40x, 100x Các khuẩn lạc sẽ được phân loại sơ bộ dựa vào hình thái củakhuẩn lạc và hình thái tế bào của vi khuẩn Kết quả cho bởi bảng sau

Bảng 3.1 Đặc điểm hình thái khuẩn lạc của các chủng Azospirillum

5 K16 Trònđều Bóng,nhẵn Trắngsữa phẳngBằng Lồi thấp

8 K19 Trònđều Bóng,nhẵn Trắngtrong phẳngBằng Lồi cao

9 K21 Trònđều Bóng,nhẵn Trắngsữa phẳngBằng Lồi cao

10 K22 Tròn Bóng Trắngđục phẳngBằng Lồi thấp

11 K23 Tròn Bóng Trắngđục phẳngBằng Lồi thấp

12 K25 Trònđều Bóng,nhẵn Trắngsữa phẳngBằng Lồi cao

13 K26 Trònđều Bóng,nhẵn Trắngtrong phẳngBằng Lồi cao

14 K33 Tròn Bóng Trắngsữa phẳngBằng Lồi cao

15 K36 Tròn Bóng Trắngsữa phẳngBằng Lồi cao

16 K37 Tròn Bóng Trắngsữa phẳngBằng Lồi cao

17 K38 Trònđều Bóng,nhẵn Trắngsữa phẳngBằng Lồi cao

18 K39 Tròn Bóng Trắngsữa phẳngBằng Lồi cao

19 K40 Tròn Bóng Trắngtrong phẳngBằng Lồi thấp

20 K51 Tròn Bóng Trắngtrong phẳngBằng Lồi cao

21 K54 Trònđều Bóng,nhẵn Trắngtrong phẳngBằng Lồi cao

22 K55 Tròn Bóng Trắngsữa phẳngBằng Lồi cao

23 C01 Tròn Nhẵn Trắngđục phẳngBằng Lồi cao

24 C03 khôngTròn

đều

Bóng,nhẵn Trắngtrong phẳngBằng Lồi cao

25 C05 Trònđều Bóng,nhẵn Trắngtrong phẳngBằng Lồi cao

26 C22 Tròn Bóng Trắngđục phẳngBằng Lồi cao

27 C23 Tròn Nhẵn Trắngđục phẳngBằng Lồi cao

Trònkhôngđều

Bóng Trắng

trong phẳngBằng Lồi cao

29 C31 Trònđều Bóng,nhẵn Trắngtrong phẳngBằng Lồi cao

30 C32 Tròn Bóng Trắngđục phẳngBằng Lồi cao

Tròn,khôngđều

Nhẵn Trắng

đục phẳngBằng Lồi cao

Trònkhôngđều

Bóng Trắng

trong phẳngBằng Lồi cao

33 D02 Trònđều Bóng,nhẵn Trắngtrong phẳngBằng Lồi cao

trong phẳngBằng Lồi cao

37 D08 Trònđều Bóng,nhẵn Trắngtrong phẳngBằng Lồi cao

Bóng Trắng

trong phẳngBằng Lồi cao

41 D17 Trònđều Bóng,nhẵn Trắngtrong phẳngBằng Lồi cao

42 D46 Tròn Bóng Trắngđục phẳngBằng Lồi cao

Tròn,khôngđều

Nhẵn Trắng

đục phẳngBằng Lồi cao

Bảng 3.2 Kết quả nhuộm gram của các chủng Azospirillum

STT Chủng Gram Hình dạng tế bào (kích thước ?)

hoàn toàn phù hợp với những nghiên cứu trước đây về vi khuẩn Azospirillum.

3.3 Kết quả nghiên cứu xác định khả năng tạo IAA của các chủng

Azospirillum

Để xác định hàm lượng IAA được sinh ra bởi các chủng vi khuẩn chúngtôi tiến hành xây dựng phương trình đường chuẩn về mối tương quan giữa chỉ sốOD530 và nồng độ IAA Kết quả đo được theo bảng 3.3

Bảng 3.3 Giá trị OD 530nm đo được ở các nồng độ IAA pha loãng khác nhau

Biểu đồ 3.1 Phương trình đường chuẩn về mối tương quan tuyến tính giữa

chỉ số OD 530nm và nồng độ IAA (mg/l)

y = 0,0207x + 0,0368

R 2 = 0,995

0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 1,4 1,6 1,8

Tiến hành nuôi cấy các chủng vi khuẩn trên môi trường BMS Sau 3 ngàytiến hành ly tâm thu dịch trong cho phản ứng với thuốc thử Salkowski và đoOD530 Từ giá trị OD đo được và phương trình đường chuẩn chúng tôi xác địnhđược hàm lượng IAA do các chủng vi khuẩn sinh ra Kết quả thể hiện ở bảng3.4

Bảng 3.4 Kết quả nghiên cứu khả năng tổng hợp IAA của các chủng

Z** , NS: Khác biệt có ý nghĩa ở mức P ≤ 0,01, khác biệt không có ý nghĩa

Từ kết quả bảng 3.4 chúng tôi nhận thấy rằng tất cả các chủng vi khuẩnđều có khả năng sinh IAA Tuy nhiên, hàm lượng IAA tổng hợp được có sự

chênh lệch khác nhau và có ý nghĩa về thống kê Cụ thể chủng K15 cho hàmlượng IAA thấp nhất ( 1,72mg/l), còn hàm lượng IAA do chủng K12 tổng hợp làcao nhất ( 22,80mg/l) Kết quả nghiên cứu của Fabricio Cassa’na và cộng sự

cũng đã cho biết loài Azospirillum brasilense Az39 có khả năng sản xuất 12,73

-13,49 µg/ml ( ở mật độ 3,4 x 108 tế bào/ml), việc sản suất các phytohormon đượcxem là một yếu tố quan trọng, đặc biệt là IAA [27]

3.4 Kết quả tuyển chọn các chủng Azospirillum có khả năng cố định đạm

bằng nghiên cứu thử nghiệm trên cây ngô

3.4.1 Ảnh hưởng của các chủng Azospirillum đến sinh trưởng của cây ngô

trong bầu đất

Để nghiên cứu ảnh hưởng của các chủng Azospirillum đến sinh trưởng của

cây ngô Chúng tôi tiến hành xử lý nhiễn các chủng vi khuẩn với hạt ngô trướckhi gieo vào bầu đất Thời gian xử lý hạt là 15 phút, hạt được ngâm trong dịchsinh khối tế bào với mật độ 109 tế bào/ml Thí nghiệm gồm nghiệm thức không

bón phân nhiễm với các chủng Azospirillum và đối chứng là không bón phân

không nhiễm vi khuẩn Khi cây ngô được 45 ngày chúng tôi tiến hành lấy kếtquả Kết quả được thể hiện trong bảng 3.5

Bảng 3.5 Các chỉ tiêu sinh trưởng của cây ngô trồng trong bầu đất STT Chủng vi

Chiều dài

lá (cm)

Chiều cao cây (cm)

Đường kính gốc ( mm)

Z** , NS: Khác biệt có ý nghĩa ở mức P ≤ 0,01, khác biệt không có ý nghĩa

Qua bảng kết quả chi thấy đa số nghiệm thức nhiễm vi khuẩn

Azospirillum và không bón phân cho chiều cao cây, số lá trên cây, chiều dài lá và

đường kính gốc thân luôn lớn hơn so với nghiệm thức không chủng vi khuẩn

không bón phân Chứng tỏ các chủng Azospirillum có ảnh hưởng tích cực lên sự