Phân lập, tuyển chọn một số chủng vi khuẩn cố định đạm cao trong tự nhiên

Hiện nay ở nước ta đã có một số nghiên cứu, phân lập các chủng vi khuẩn nội sinh trong rễ lúa, rễ cây lạc, cây cà phê, rễ cây ngô…Tuy nhiên , những nghiên cứu về vi khuẩn cố định đạm cho

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM -o0o -

TRẦN THỊ NGA

Tên đề tài:

PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN MỘT SỐ CHỦNG VI KHUẨN

CỐ ĐỊNH ĐẠM CAO TRONG TỰ NHIÊN

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Hệ đào tạo : Chính quy Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Khoa : CNSH & CNTP Khóa học : 2012 – 2016

Thái Nguyên, năm 2016

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM -o0o -

TRẦN THỊ NGA

Tên đề tài:

PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN MỘT SỐ CHỦNG VI KHUẨN

CỐ ĐỊNH ĐẠM CAO TRONG TỰ NHIÊN

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Hệ đào tạo :Chính quy Chuyên ngành:Công nghệ sinh học Lớp :K44 - CNSH

Khoa :CNSH & CNTP Khóa học :2012 – 2016 Giảng viên hướng dẫn: TS Trần Văn Chí

Thái Nguyên, năm 2016

LỜI CẢM ƠN

Trong suốt quá trình thực tập tại phòng Công nghệ Lên men, Khoa Công

nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên,

em đã nhận được rất nhiều sự giúp đỡ từ Ban chủ nhiệm Khoa CNSH - CNTP, thầy

cô hướng dẫn, bạn bè và gia đình

Trước hết, em xin chân thành cảm ơn sâu sắc tới TS Trần Văn Chí, giảng

viên Khoa CNSH - CNTP, đã tạo điều kiện, hướng dẫn và tận tình giúp đỡ em hoàn

thành khoá luận này

Em xin gửi lời cảm ơn tới ThS Vi Đại Lâm, giảng viên Khoa CNSH -

CNTP, người đã hướng dẫn em các thao tác thực hành và chỉ ra cho em những sai

lầm giúp em hoàn thành tốt khoá luận

Em xin chân thành cảm ơn đến các thầy cô trong Khoa CNSH - CNTP,

trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên đã tận tình chỉ bảo, giúp đỡ em trong quá

trình học tập và hoàn thành khoá luận này

Cuối cùng em xin gửi lời cảm ơn đến gia đình, bạn bè, những người đã

luôn ở bên cạnh động viên giúp đỡ em trong suốt thời gian thực hiện khoá luận

Em xin chân thành cảm ơn!

Thái nguyên, ngày 20 tháng 05 năm 2016

Sinh viên thực hiện

Trần Thị Nga

DANH MỤC CÁC BẢNG

Trang

Bảng 2.1.Các nhóm vi sinh vật tổng hợp IAA và các chất dẫn xuất 10

Bảng 2.2 Sự hiện diện của vi khuẩn Azosprillum ở một số loại hoa màu 16

Bảng 3.1: Các hóa chất sử dụng trong nghiên cứu 26

Bảng 3.2: Các thiết bị sử dụng trong thí nghiệm 27

Bảng 3.3: Môi trường thạch Burk’ không đạm 27

Bảng 3.4: Môi trường thạch Ashby 27

Bảng 3.5: Môi trường Dobereiner và cộng sự 28

Bảng 3.6: Môi trường nước chiết khoai tây (BMS) 28

Bảng 4.1: Kết quả nghiên cứu đặc điểm hình thái, kích thước các vi khuẩn cố định đạm phân lập được 36

Bảng 4.2:Khả năng cố định nitơ của các chủng vi khuẩn đã phân lập được 38

Bảng 4.3: Hàm lượng đạm của chủng vi khuẩn ĐT1 trong môi trường Dobereiner lỏng 39

Bảng 4.4.Kết quả đo OD của IAA chuẩn ở các nồng độ khác nhau 40

Bảng 4.5 kết quả đo OD của chủng ĐT1 qua thời gian 41

Bảng 4.6 Đặc điểm hình thái, Gram của chủng vi khuẩn ĐT1 43

Bảng 4.7 Đặc điểm sinh lý sinh hóa của chủng vi khuẩn ĐT1 43

Bảng 4.8 Kết quả đo mật độ tế bào của chủng ĐT1 sau 48hở mức sóng 660nm 45

Bảng 4.9 Kết quả định danh sơ bộ chủng vi khuẩn cố định đạm (ĐT1) phân lập 46

Bảng 4.10 Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến mật độ tế bào của chủng ĐT1 sau 0h và 48h nuôi cấy 46

Bảng 4.11 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến sinh khối của chủng ĐT1 48

Bảng 4.12 ảnh hưởng của pH ban đầu đến sinh trưởng của chủng ĐT1 49

Bảng 4.13 Kết quả đo mật độ tế bào trên các môi trường thay thế của chủng ĐT1 50

ứng với thuốc thử Salkowski 42 Hình 4.5 Phản ứng màu IAA với thuốc thử salkowski của chủng ĐT1 nuôi cấy

5 ngày 42 Hình 4.6 Hình dạng khuẩn lạc và tế bào của chủng ĐT1 43 Hình 4.7 Thử nghiệm khả năng quan hệ với oxy và khả năng sinh khí của chủng

ĐT1 44 Hình 4.8 Khả năng sử dụng nguồn carbon trên môi trường dịch thể Dobereiner của

chủng ĐT1 44 Hình 4.9 Biểu đồ ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến chủng ĐT1 47 Hình 4.10 Đồ thị ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến sinh khối của chủng ĐT1 48 Hình 4.11 Biểu đồ ảnh hưởng của pH đến sinh trưởng của chủng vi khuẩn ĐT1 49

DANH MỤC TỪ, CỤM TỪ VIẾT TẮT

ATP: Adenosin Triphosphat

DNA: Deoxyribonucleic acd

IAA: Indole – 3 – acetic acid

OD: Optical Density

RNA: Ribonucleic acid

MỤC LỤC

Trang

LỜI CẢM ƠN i

DANH MỤC CÁC BẢNG ii

DANH MỤC CÁC HÌNH iii

DANH MỤC TỪ, CỤM TỪ VIẾT TẮT iv

MỤC LỤC v

PHẦN 1 : MỞ ĐẦU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Mục đích đề tài 3

1.3 Yêu cầu của đề tài 3

1.4 Ý nghĩa của đề tài 3

1.4.1 Ý nghĩa khoa học 3

1.4.2 Ý nghĩa thực tiễn 3

PHẦN 2 : TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4

2.1.Cơ sở khoa học 4

2.1.1 Đạm 4

2.1.2 Auxin (IAA) 8

2.1.3 Tổng quan về vi khuẩn cố định nitơ 11

2.1.4 Một số vi khuẩn có khả năng cố định đạm và tổng hợp auxin 15

2.2 Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước 20

2.2.1 Tình hình nghiên cứu ngoài nước 20

2.2.2 Nghiên cứ u trong nước 22

PHẦN 3 : ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 26

3.1 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu 26

3.2 Địa điểm và thời gian nghiên cứu 26

3.3 Hóa chất và thiết bị sử dụng 26

3.3.1 Hóa chất 26

3.3.2 Thiết bị sử dụng 27

3.4 Môi truờng sử dụng 27

3.5 Nội dung nghiên cứu 28

3.6 Phương pháp nghiên cứu 29

3.6.1 Phương pháp thu thập mẫu 29

3.6.2 Phương pháp phân lập và tuyển chọn 29

3.6.3 Phương pháp mô tả đă ̣c điểm hình thái , đă ̣c điểm sinh ho ̣c của các chủng vi khuẩn cố đi ̣nh đa ̣m 32

3.6.4 Nghiên cứu sử dụng môi trường thay thế 35

3.6.5 Phương pháp định danh sơ bộ 35

PHẦN 4 : KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 36

4.1 Kết quả nghiên cứu phân lập và tuyển chọn chủng vi khuẩn có khả năng cố định đạm cao trong tự nhiên 36

4.1.1 Kết quả phân lập các chủng vi khuẩn có khả năng cố định đạm cao trong tự nhiên 36

4.1.2 Kết quả tuyển chọn 38

4.2 Kết quả nghiên cứu khả năng sinh IAA của chủng ĐT1 40

4.3 Kết quả nghiên cứu đặc điểm hình thái, đặc điểm sinh lý, sinh hóa của chủng vi khuẩn ĐT1 42

4.4 Kết quả định danh sơ bộ chủng vi khuẩn ĐT1 phân lập được 45

4.5 Kết quả nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến sinh khối của chủng ĐT1 46

4.5.1 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến sinh khối của chủng ĐT1 46

4.5.2 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến sinh khố của chủng ĐT1 48

4.5.3 Nghiên cứu ảnh hưởng của pH ban đầu đến sinh trưởng của chủng vi khuẩn ĐT1 49

4.6 Kết quả nghiên cứu sử dụng môi trường thay thế 50

Phần 5 : KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 51

5.1 Kết luận 51

5.2 Kiến nghị 51

TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

PHẦN 1

MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề

Nitơ có vai trò đặc biệt quan trọng đối với sự sinh trưởng, phát triển của cây trồng và do đó nó quyết định năng suất và chất lượng thu hoạch Nitơ có trong thành phần của hầu hết các chất trong cây: protein, axit nucleic, các sắc tố quang hợp, các hợp chất dự trữ năng lượng: ADP, ATP, các chất điều hoà sinh trưởng ,… Như vậy nitơ vừa có vai trò cấu trúc, vừa tham gia trong các quá trình trao đổi chất và năng lượng Nitơ có vai trò quyết định đến toàn bộ các quá trình sinh

lý của cây trồng

Nitơ trong tự nhiên tồn tại dưới 3 dạng: N hữu cơ, N vô cơ và nitơ ở dạng tự do(N2) trong khí quyển Cây chủ yếu hút N vô cơ, còn dạng N2 trong khí quyển thì cây không đồng hóa trực tiếp mà phải nhờ sự cố định của các vi sinh vật trong đất Dạng nitơ vô cơ mà cây đồng hóa là nitrat (NO3-) và amon (NH4+) [29]

Nitơ là nguyên tố dinh dưỡng quan trọng không thể thiếu được không chỉ đối với cây trồng, mà ngay cả đối với vi sinh vật (VSV) Nguồn dự trữ nitơ trong tự nhiên rất lớn Người ta ước tính rằng trong bầu không khí bao trùm lên 1ha đất đai chứa khoảng 8 triệu tấn nitơ, lượng nitơ này có thể cung cấp dinh dưỡng cho cây trồng hàng chục triệu năm (nếu như cây đồng hóa được chúng)

Trong cơ thể các loại sinh vật trên trái đất chứa khoảng 10 – 25.109 tấn nitơ Trong các vật trầm tích chứa khoảng 4.1015 tỷ tấn nitơ Nhưng tất cả nguồn nitơ trên cây trồng không thể tự đồng hóa được mà phải nhờ VSV Thông qua hoạt động của các loài VSV nitơ nằm trong các dạng khác nhau được chuyển hóa thành các dạng

dễ tiêu cho cây trồng sử dụng

Hàng năm cây trồng lấy đi từ đất hàng trăm triệu tấn nitơ Bằng cách bón phân,con người trả lại cho đất được khoảng > 40%, lượng thiếu hụt còn lại cơ bản được bổ sung bằng nitơ do hoạt động sống của VSV cố định nitơ [31]

Người ta nhận thấy rằng muốn có thu hoạch 12 tạ hạt trên mỗi hecta, cây trồng cần lấy đi khỏi đất khoảng 30kg nitơ Hiệu suất sử dụng phân hóa học của cây trồng

là vào khoảng 75% Như vậy có nghĩa là nếu chỉ dựa vào nguồn nitơ của phân hoá học thì muốn có 5 tấn hạt chúng ta phải bón vào mỗi hecta khoảng 116,6kg nitơ (tương đương với 833kg amôn sunphát) Số lượng nitơ này thật khó có thể thỏa mãn ngay cả ở nước có công nghiệp phân nitơ hóa học phát triển [10]

Vậy làm thế nào để trả lại độ phì nhiêu cho đất mà vẫn đảm bảo tiêu chuẩn về năng suất và chất lượng cho cây trồng?

Đó là sử dụng sản phẩm phân bón vi sinh vật cố định nitơ đa chủng từ các nguồn khác nhau, đây chính là giải pháp hay nhất hiện nay có thể giải quyết được các vấn đề trên Tại Ấn Độ, sử dụng phân vi sinh vật cố định nitơ cho lúa, cao lương, bông làm tăng năng suất trung bình 11,4%, 18,2% và 6,8% hay mang lại lợi nhuận 1015 rupi, 1149 rupi và 343 rupi/ ha Tại Liên Bang Nga, bón chế phẩm VSV

cố định nitơ cho tăng năng suất khoai tây 12,8 tạ/ha, tăng năng suất cà chua 28,0 tạ/ha, tăng năng suất ngô hạt 22,4 tạ/ha, tăng năng suất cây bắp cải 72,5 tạ/ha

Ở Việt Nam các thử nghiệm sử dụng phân vi sinh vật cố định nitơ hội sinh ở

15 tỉnh miền Bắc, miền Trung, và miền Nam trên diện tích hàng chục ngàn ha cho thấy trong cùng điều kiện sản xuất, ruộng lúa được bón phân VSV cố định nitơ đề tốt hơn so với đối chứng, biểu hiện ở bộ lá phát triển tốt hơn, tỉ lệ nhánh hữu hiệu,

số bông/khóm nhiều hơn đối chứng Năng suất hạt tăng so với đối chứng 6 – 12%, nhiều nơi đạt 15 – 20% Những ruộng bón phân VSV cố định nitơ giảm bớt 1kg đạm ure cho mỗi sào, năng suất vẫn tăng so vớ đối chứng Đối với rau (xà lách, rau diếp, khoai tây…) bón phân VSV cố định nitơ cũng làm tăng sản lượng thu hoạch 20- 30% Việc bón phân VSV cố định nitơ còn làm tăng khả năng chống chịu cho cây và giảm lượng nitơ tồn dư trong rau Hiệu quả kinh tế do sử dụng phân VSV cố định nitơ là rõ rệt

Ngoài tác dụng trên phân VSV thông qua các hoạt chất sinh học của chúng còn có tác dụng điều hòa, kích thích quá trình sinh tổng hợp của cây trồng, đồng thời nâng cao sức đề kháng của cây trồng đối với một số sâu, bệnh hại.( đã được nghiên cứu trên cây khoai tây) [31]

Do đó việc nghiên cứu phân lập các vi sinh vật cố định nitơ là rất cần thiết

Hiện nay ở nước ta đã có một số nghiên cứu, phân lập các chủng vi khuẩn nội sinh trong rễ lúa, rễ cây lạc, cây cà phê, rễ cây ngô…Tuy nhiên , những nghiên cứu về

vi khuẩn cố định đạm cho các cây lúa, lạc, đậu , chè là rất ít Đặc biệt là chưa có nghiên cứu nào về thành phần loài vi khuẩn có khả năng cố định đạm trong rễ và trong đất cây chè, lúa, đâu,lạc tại tỉnh Thái Nguyên

Xuất phát từ thực tế đó em tiến hành nghiên cứu đề tài: “Phân lập, tuyển chọn một số chủng vi khuẩn cố định đạm cao trong tự nhiên”

1.2 Mục đích đề tài

- Phân lập và tuyển chọn được một số chủng vi khuẩn cố định đạm cao trong tự nhiên

1.3 Yêu cầu của đề tài

- Phân lập và tuyển chọn các chủng vi khuẩn có khả năng cố định đạm cao, khảo sát khả năng sinh chất kích thích sinh trưởng IAA của các chủng vi khuẩn cố định đạm trong tự nhiên

- Nghiên cứu các đặc điểm sinh lý, sinh hóa của các chủng vi khuẩn đã tuyển chọn được ở trên

- Nghiên cứu sử dụng môi trường thay thế

- Định danh các vi khuẩn trên

1.4 Ý nghĩa của đề tài

1.4.1 Ý nghĩa khoa học

- Giúp sinh viên củng cố và hệ thống hóa lại kiến thức đã học vào nghiên cứu khoa học

- Củng cố cho sinh viên tác phong cũng như kỹ năng làm việc sau này

- Biết được phương pháp nghiên cứu một vấn đề khoa học, xử lý, phân tích số liệu, trình bày một bài báo cáo khoa học

1.4.2 Ý nghĩa thực tiễn

- Kết quả nghiên cứu sẽ xác định được chủng vi khuẩn có khả năng cố định đạm cao và có khả năng sinh chất kích thích sinh trưởng, ứng dụng trong ngành công nghiệp sản xuất phân đạm vi sinh Đem lại năng suất, chất lượng cao cho ngành nông nghiệp, đồng thời tạo ra sản phẩm thân thiện với môi trường

- Là nguồn tài liệu tham khảo cho các nghiên cứu thuộc cùng lĩnh vực

PHẦN 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1.Cơ sở khoa học

2.1.1 Đạm

2.1.1.1 Nhu cầu đạm của cây

 Vai trò của đạm đối với cây trồng

Đạm (Nitơ) là nguyên tố không thể thiếu đối với các cơ thể sinh vật nói chung , do đạm là thành phần cơ bản và thường chiếm 15 -17% của chất protein, mà protein là chất biểu hiện của sự sống “Sự sống là phương thức tồn tại của protein”, không có N thì không có protein và cũng không có sự sống, vì vậy cây không có đạm thì cây sẽ chết

Đạm có nhiều trong các hợp chất hữu cơ, rất cơ bản và rất cần thiết cho sự sinh trưởng và phát triển của cây: Diệp lục, các acid nucleic (DNA và RNA), các loại men, bazơ có đạm, một số hợp chất có hoạt tính sinh học cao Các hợp chất hữu

cơ nêu trên không thể thiếu đạm trong thành phần và mỗi chất đều có những vai trò quan trọng trong đời sóng của cây Diệp lục là cơ quan không thể thiếu của quá trình quang hợp, tổng hợp các chất hữu cơ cho toàn thể giới sinh vật Các acid nucleic (DNA và RNA) là các chất mang thông tin di truyền chỉ huy việc tổng hợp protein của cây, khi thiếu các chất này dù trong cây có đủ các nguyên liệu thì cũng không tỏng hợp được protein Các loại men là các chất xúc tác sinh học rất quan trọng làm cho quá trình chuyển hóa vật chất có thể thực hiện được với tốc độ lớn ngay trong điều kiện bình thường

Đạm là yếu tố cơ bản của quá trình đồng hóa carbon vì nằm trong thành phần của diệp lục, đạm có tác dụng kích thích sự phát triển của bộ rễ và việc hút các yêu

tố dinh dưỡng khác của cây Trong cây luôn tồn tại mối quan hệ chặt chẽ giữ lượng

N cây hút được và việc hút các yếu tố dinh dưỡng khác của cây [17]

Đối với cây trồng đạm là yếu tố chính, yếu tố quyết định sự sinh trưởng phát triển và năng suốt của cây Điều này được thể hiện rất rõ ở cây trồng bằng các biểu hiện về hình thái và năng suất không chỉ khi cây thiếu và đủ đạm mà cả khi cây thừa đạm Khi cây trồng được cung cấp đủ đạm lá có màu xanh lục tươi, sinh trưởng phát triển nhanh, khỏe mạnh, có nhiều chồi, búp, lá, cành (nhánh), kết quả tích lũy được nhiều chất khô và năng suất cao Theo A.Gross (1977) tính trung bình 1 kg N cho:

15 kg hạt ngũ cốc và 25 kg rơm rạ, 10 kg đường, 70 kg khoai tây, 12 -15 lít sữa, 2 – 2,5 kg thịt hơi [17]

2.1.1.2 Phân đạm

Phân đạm là từ chung , dùng để chỉ các loại phân có chứa nitơ

Phân đạm có vai trò quan trong trong việc phát triển bộ rễ, thân, lá, chiều cao

và đặc biệt quan trọng trong giai đoạn tăng trưởng mạnh của các loại rau

Hầu hết đạm hóa học được sản xuất theo quy trình Haber – Bosch, đòi hỏi một lượng lớn khí tự nhiên, than đá, hoặc dầu mỏ Một số nghiên cứu đã chỉ ra rằng

để sản xuất 1 tấn phân đạm hóa học cần 1,3 tấn dầu, để sản xuất 80 triệu tấn phân đạm hóa học cần 100 triệu tấn dầu, bằng 1,4% số dầu sử dụng trên toàn cầu Dầu cần cho sản xuất công nghiệp, nông nghiệp, giao thông vận tải Khai thác quá mức thì nguồn tài nguyên này cũng sẽ cạn kiệt, không còn cho các thế hệ sau [32] Thêm vào đó việc sản xuất đạm sẽ sinh ra một lượng lớn CO2 – một trong những nguyên nhân gây ra hiệu ứng nhà kính mà cả thế giới đang tìm cách khắc phục Hơn nữa, chỉ có khoảng 1/3 lượng phân bón vào đất mà cây trồng có thể sử dụng, lượng đạm còn thừa sẽ thất thoát ra môi trường bên ngoài gây ô nhiễm nguồn nước mặt và ảnh hưởng đến sức khỏe con người Việc sử dụng quá mức lượng đạm hóa học sẽ dẫn đến sự sản sinh N2O cũng gây ra hiện tượng nóng lên toàn cầu [82]

2.1.1.3 Tầm quan trọng của quá trình cố định đạm

 Cố định đạm hóa học

Trong không khí, phân tử nitơ thường tồn tại ở trạng thái liên kết hai nguyên

tử nitơ lại với nhau nhờ nối bà bền vững (N N) Năng lượng cần cho sự phá vỡ liên kết này khoảng 225kcal nên cây trồng ( cũng như các loài động vật) không có khả

năng đồng hóa nguồn nitơ này Vì vậy việc nghiên cứu phá vỡ các liên kết này để tạo ra dạng nitơ dễ hấp thu đối với cây xanh là hết sức cần thiết [7]

Năm 1905 lần đầu tiên con người tìm được phương pháp phá vỡ và liên kết với CaC2 để tạo ra một dạng phân đạm hóa học đầu tiên là CaCN2

Muốn thực hiện phản ứng người ta duy trì một nhiệt độ cao từ 1000 – 1100oC:

Ít lâu sau các nhà khoa học Nauy lại tìm được cách liên kết N2 với O2 để tạo thành một dạng phân đạm hóa học khác (nitrate) phản ứng này cũng đòi hỏi nhiệt

độ cao đến 40000

C :

Năm 1980 nhà khoa học Đức Ga – be đã tìm được phương pháp liên kết N2với H2 để tạo thành NH3 Phản ứng này không những đòi hỏi nhiệt độ cao (6000C),

áp suất cao (1000atm) mà còn đòi hỏi có mặt một số chất xúc tác đắt tiền

Từ đó đến nay ngành công nghiệp hóa học đã có những tiến bộ rất lớn Người ta sản xuất rộng rãi nhiều loại phân đạm hóa học khác nhau với sản lượng ngày càng tăng Nếu như năm 1913 toàn thế giới sản xuất được 0,51 triệu tấn phân đạm thì đến năm 1964 con số này đã tăng lên 29 lần (14,5 triệu tấn) trong khi đó phân kali chỉ tăng 8,4 lần, phân photpho tăng có 5,8 lần [7]

Dù sao thì phân đạm trên thế giới cũng bù đắp được một phần nhỏ số lượng đạm trong đất bị lấy đi hàng năm Có một số thống kê cho biết hàng năm các sản phẩm nông nghiệp trên thế giới lấy đi khỏi đất khoảng 100 – 110 triệu tấn đạm, con

số này vượt đến bảy lần so với phân đạm hóa học sản xuất ra ở các nước gộp lại hàng năm Phân đạm có tác dụng rất lớn đến mùa màng, ví dụ: bón 1 kg đạm thu hoạch thêm được khoảng 10 – 20 kg thóc, 15 – 20 kg ngô hoặc 15 – 40 kg cỏ khô

Khó khăn chủ yếu làm cản trở việc mở rộng nhanh chóng hơn nữa việc sản xuất phân hóa học là vì điều kiện để phá vỡ các liên kết trong phân tử nitơ khong phải là đơn giản (cần nhiệt độ cao, áp suất cao, chất xúc tác đắt tiền)

 Cố định đạm sinh học

Tương tự như quá trình cố định đạm hóa học, quá trình cố định đạm sinh học cũng là quá trình phá vỡ các liên kết trong phân tử nitơ không khí để tạo thành các dạng nitơ dễ hấp thụ cho cây trồng Nhưng ở quá trình này việc phá vỡ các liên kết của phân tử nitơ xảy ra ở điều kiện nhiệt độ và áp suất bình thường Chính vì vậy

mà vai trò của quá trình cố định đạm sinh học có ý nghĩa hết sức lớn lao đối với nông nghiệp, nhất là đối với các nước có nền công nghiệp phân đạm chưa phát triển

Các quá trình cố định đạm sinh học trong tự nhiên xảy ra nhờ vi khuẩn cố định đạm Hàng năm, trên thế giới có khoảng 160 – 170 triệu tấn nitơ khí quyển đã được cố định và chuyển hóa thành nguồn phân đạm dưới các dạng khác nhau

Trong tự nhiên, nitơ ở dạng khí (N2) và chiếm 80% trong khí quyển Tuy nhiên, thực vật và động vật không thể sử dụng được dưới dạng này cho sự biến dưỡng của chúng [51] Chỉ có một số rất ít nhóm sinh vật sơ hạch và các vi khuẩn

tự dưỡng đạm có khả năng sử dụng đạm ở thể khí này nhờ các hệ thống sinh hóa rất chuyên biệt Đó chính là sự cố định đạm sinh học

2.1.1.4 Phân đạm vi sinh

Phân đạm vi sinh (phân bón vi sinh vật cố định nitơ) là sản phẩm chứa một hay nhiều dòng vi sinh vật sống, đã được tuyển chọn với mật độ đạt theo tiêu chuẩn hiện hành, có khả năng cố định nitơ từ không khí cung cấp các hợp chất chứa nitơ cho đất và cây trồng, tạo điều kiện nâng cao năng suất và chất lượng nông sản, tăng

độ màu mỡ của đất Phân đạm vi sinh không gây ảnh hưởng xấu đến người, động thực vật, môi trường sinh thái và chất lượng nông sản [11]

Vi sinh vật cố định nitơ là vi sinh vật sống cộng sinh hay hội sinh với cây trồng, hoặc vi sinh vật sống tự do trong đất, nước, không khí, có khả năng tạo khuẩn lạc đặc trưng trên môi trường nuôi cấy không chứa hợp chất nitơ (môi trường LGIP, NFb, Ashby, burk’, Dobereiner ) [14]

Phân đạm vi sinh đã được sử dụng nhiều nơi trên thế giới với nhiều tên gọi khác nhau như: Rizonit (Hungary), Nitrobacterin (Anh), Estrasol (Nga), Mana (Nhật, Philipin), Tian-li-bao (Trung Quốc, Hồng Kong) [35]

2.1.2 Auxin (IAA)

2.1.2.1 Giới thiệu về Auxin

Indole-3-acetic acid (IAA) hay còn gọi là auxin, là hoocmon sinh trưởng kích thích sự phát triển của thực vật IAA chi phối sự phân chia tế bào, sự dãn dài tế bào, sự phân sinh mô, sự phát triển trái và hạt, chi phối sự phát triển đầu sự phát triển của cây trồng [85]

Auxin là chất thuộc nhóm điều hòa sinh trưởng thực vật đã được phát hiện sớm nhất Vào năm 1954, các nhóm auxin đã được hội đồng các nhà sinh lý thực vật định danh Thuật ngữ auxin có nguồn gốc từ Hy Lạp, “Auxein” nghĩa là “Grow” (mọc, sinh trưởng)

Auxin phổ biến và quan trọng nhất trong thực vật là Indole-3-acetic acid (IAA) được phát hiện vào thế kỷ XIX Ngoài ra, con người đã tự tổng hợp rất nhiều các chất có bản chất hóa học khác nhau nhưng chúng có hoạt tính sinh lý tương tự như IAA gọi là auxin tổng hợp Các auxin tổng hợp được sử dụng rộng rãi trong sản xuất là IBA, α – NAA, 2,4D [29]

Công thức hóa học của một số auxin

2.1.2.2 Lịch sử phát triển

Năm 1980 Darwin đã phát hiện ra rằng bao lá mầm của cây họ lúa rất nhạy cảm với ánh sáng Ông cho rằng đỉnh ngọn bao lá mầm là nơi tiếp nhận kích thích của ánh sáng

Năm 1919 Paal đã cắt đỉnh bao lá mầm và đặt trở lại trên chỗ cắt nhưng lệch sang một bên và để trong tối Hiện tượng uốn cong xảy ra như chiếu sáng một chiều Ông kết luận rằng đỉnh ngọn đã hình thành một chất sinh trưởng nào đấycòn ánh sáng xác định sự phân bố của chất đó về hai phía của bao lá mầm

Năm 1928 Went đã đặt đỉnh ngọn tách rời của bao lá mầm đó lên các bản agar để cho các chất sinh trưởng nào đấy khuếch tán xuống agar Sau đó ông đặt các bản agar đó lên mặt cắt của bao lá mầm thì cũng gây nên hiện tượng sinh trưởng uốn cong như thí nghiệm của Paal với đỉnh sinh trưởng cắt rời Rõ ràng một chất sinh trưởng nào đấy được tổng hợp trong đỉnh bao lá mầm đã khuếch tán xuống agar và gây nên sự sinh trưởng hướng động đó Went gọi chất đó là chất sinh trưởng

và hiện nay chính là auxin

Năm 1934 giáo sư hóa học Kogl (Hà Lan) và các cộng sự đã tách ra một chất

từ dịch chiết nấm men có hoạt tính tương tự chất sinh trưởng và năm 1935 Thimann

cũng tách được chất này từ nấm Rhysopus Nhười ta xác định bản chất hóa học của

nó, đó là β – acid – indol axetic (IAA) Sau đó người ta lần lượt tách chiết được

IAA từ các thực vật bậc cao khác và đã khẳng định rằng IAA là dạng auxin chủ yếu, quan trọng nhất của tất cả các thực vật, kể cả thực vật bậc thấp và thực vật bậc cao [29],[95]

Một số loài của các giống Azospirillum, Pseudomonas và Glucoacetobacter

là những vi khuẩn cố định đạm nhưng nhờ khả năng tổng hợp auxin của chúng nên cũng được xem là vi khuẩn vùng rễ kích thích sinh trưởng thực vật ( PGPR), góp phần làm tăng sản lượng cây trồng [63]

2.1.2.3 Vai trò của Auxin do vi sinh vật sinh ra đối với cây trồng

Auxin có tác dụng điều chỉnh rất nhiều quá trình sinh trưởng của tế bào, cơ quan và toàn cây

Với nhiều thí nghiệm khác nhau của nhiều nhà khoa học đã chứng minh được vai trò của IAA do vi sinh vật tạo ra đối với cây trồng như kích thích sự kéo dài rễ, tăng số lượng rễ phụ, làm tăng khả năng nẩy mầm của hạt

Bảng 2.1.Các nhóm vi sinh vật tổng hợp IAA và các chất dẫn xuất

(Nguồn: Phytohormone in soils (1995), W.T.Frankenberger và Muhannad Arshad)

Sử dụng các vi khuẩn Azotobacter, Azospirillum, Acetobacter, Bacillus và

Pseudomonas để giúp cây lúa nước phát triển tốt và gia tăng năng suất so với đối chứng

và sự tổng hợp IAA của những vi khuẩn này giúp rễ lúa phát triển nhiều hơn để hấp thu nhiều nước và chất dinh dưỡng hơn [68]

Bên cạnh đó, Abbas (2007) [37] đã chứng minh rằng khi ủ rễ lúa mì trong dịch

vi khuẩn Azospirillum sp Trong 14 ngày thì rễ lúa của các cây này dài hơn, có nhiều rễ

phụ hơn so với chỉ ủ trong nước cất, và trọng lượng khô của các cây lúa mì ủ với dịch

vi khuẩn Azospirillum sp là 10,63 mg trong khi các hạt chỉ xử lý với nước cất chỉ là

3,47mg

KoIb và Martin (1985) đã phun IAA có nồng độ 10-9 g/l vào rễ của cây lúa

mì kết quả là rễ cây dài hơn Một thí nghiệm khác của họ khi phun dịch vi khuẩn

Azospirillum brasilense FT-326 trên rễ của củ cải đường (Beta vulgaris) làm cho rễ

mọc dài hơn và phát triển cả luôn các rễ thứ cấp

Có nhiều công ty phân bón sử dụng vi khuẩn rễ kích thích tăng trưởng thực vật để xử lý cây trồng phát triển tốt Ở Việt Nam, công ty hóa hữu cơ đã đưa một vài dòng vi sinh vật có khả năng tổng hợp kích tố tăng trưởng thực vật từ nước ngoài vào Việt Nam để sản xuất phân bón hữu cơ [35] và trong hội chợ Khoa Học Công Nghệ năm 2003 (Tech-mart 2003) tổ chức vào tháng 10/2003 tại Hà Nội

2.1.3 Tổng quan về vi khuẩn cố định nitơ

Người ta nhận thấy muốn thu hoạch 12 tạ hạt trên mỗi hecta, cây trồng lấy đi khỏi đất khoảng 30 kg nitơ [9] Theo thống kê hàng năm các sản phẩm nông nghiệp trên thế giới lấy đi khỏi đất khoảng 100 – 110 triệu tấn nitơ [9] Trong khi đó lượng phân nitơ hóa học hiện nay chỉ bù đắp được một phần lượng nitơ mà cây lấy đi khỏi đất, những tổn thất về nitơ được bù đắp bởi một quá trình sinh học đặc biệt gọi là quá trình cố định nitơ do vi sinh vật thực hiện, chúng có khả năng chuyển hóa nitơ phân tử trong không khí thành các hợp chất chứa nitơ và làm giàu thêm nguồn đạm trong đất, có thể xếp chúng thành ba nhóm lớn:

+ Nhóm vi sinh vật sống cộng sinh với thực vật

+ Nhóm vi khuẩn sống tự do

+ Nhóm vi khuẩn lam

2.1.3.1 Nhóm Vi sinh vật sống cộng sinh với thực vật

 Vi khuẩn nốt sần cộng sinh với cây bộ đậu

Nhà khoa học Hà Lan M.W Beijrinck đã phân lập được loài vi khuẩn sống

cộng sinh trong nốt sần ở rễ một cây thuộc bộ đậu và ông đặt tên là Bacillus

radicicola, vi khuẩn này được xếp vào chi riêng Rhizodium

Trên môi trường đặc, vi khuẩn nốt sần thường có khuẩn lạc trơn bóng, nhầy,

vô màu Khi còn non tế bào của chúng có dạng hình que hoặc cầu 0,5 – 0,9 x 1,2 – 3,0µm, có khả năng di động nhờ tiêu mao; khi già tế bào trở nên bất động kích thước lớn phân nhánh gọi là thể giả khuẩn [9], [24]

Đây là các loài hiếu khí, tuy nhiên vi khuẩn nốt sần vẫn có thể sử dụng được ngay cả ở trong trường hợp chỉ có một áp lực oxy rất thấp khoảng 0.01atm đa số

chúng thích hợp ở pH = 6,5 – 7,5, bị cản trở khi pH= 4,5 – 5,0 hoặc lớn hơn 8.0 nhiệt độ thích hợp 24 – 26o C, ở 37o C sự phát triển của chúng bị cản trở [22];[25]

Vi khuẩn nốt sần xâm nhiễm vào rễ cây bộ đậu thông qua lông hút, đôi khi thông qua vết thương ở vỏ rễ Người ta nhận thấy muốn xâm nhiễm tốt thì vi khuẩn nốt sần cần đạt tới 104 tế bào/gam đất Dưới ảnh hưởng của vi khuẩn, rễ tiết ra enzyme polylacturonase phân hủy thành lông hút, tạo điều kiện cho vi khuẩn xâm nhập vào rễ Hàng năm, vi khuẩn nốt sần cộng sinh trong rễ cây bộ đậu có thể làm giàu cho đất khoảng 50 – 600 kg nitơ/ha [9]

 Vi sinh vật cố định đạm cộng sinh trong một số cây không thuộc bộ đậu

Ngoài những loại cây thuộc bộ đậu thì những loài cây không thuộc bộ đậu

cũng có khả năng tạo nốt sần như: một số thực vật thuộc ngành hạt trần: Bowenia,

Cycas một số thực vật hai lá mầm: Coffee, Coriaria, Ngoài ra một số thực vật

còn có khả năng tạo nốt sần trên lá

Qua nghiên cứu cho thấy, ngoài vi khuẩn nốt sần một số loài xạ khuẩn thuộc

chi Frankia (cộng sinh trong rễ loài Casuarina) nhiều loài nấm rễ (khuẩn căn hay

mycorhiza ) cũng có khả năng cố định nitơ phân tử, tạo nốt sần Có nhiều nghiên

cứu cho thấy, nhờ tác dụng của nấm rễ mà đất thông Pinus radiala ở Mỹ hàng năm

làm giàu thêm khoảng 50 kg nitơ/ha [9]

Ngày nay, các nhà khoa học có thể phân lập, nuôi cấy vi khuẩn cố định nitơ

cộng sinh Rhizobium để sản xuất chế phẩm Nitragin để xử lý hạt giống đậu trước

khi gieo Vi khuẩn sẽ được nuôi cấy trên môi trường thích hợp sau đó hấp phụ vào chất mang là đất, than bùn để bảo quản và sử dụng

2.1.3.2 Nhóm Vi khuẩn cố định nitơ tự do

 Vi khuẩn cố định nitơ tự do kỵ khí Clostridium

Clostridium được phát hiện lần đầu tiên bởi Vinogradxki (1893) Tế bào Clostridium hình que có kích thước 2,5 – 7,5 x 0,7 – 1,3 µm, có thể đứng riêng rẽ

hoặc kẹp đôi thành chuỗi ngắn Khi còn non có khả năng di động, khi già mất khả năng di động, bào tử nằm ở trung tâm, khuẩn lạc nhẵn và trắng có khả năng chịu được nhiệt độ cao và khô hạn [21]

Vi khuẩn Clostridium có nhiều loài có khả năng cố định nitơ phân tử như:

Cl pasteurianum, Cl butylicum nhưng loài có khả năng cố định đạm cao nhất là Clostridium pasteurianum Chúng có khả năng cố định được 5 – 10 mg nitơ khi tiêu

thụ hết 1g carbon Phạm vi hoạt động cố định nitơ của Clostridium trong khoảng pH

khá rộng 4,7 – 8,5, tối thích là 6,9 – 7,3

 Vi khuẩn cố định nitơ tự do hiếu khí

Nhóm này gồm hai chi chính là Beijerinskia sp và Azotobacter sp

 Nhóm vi khuẩn thuộc chi Beijerinskia sp

Beijerinskia sp là loài vi khuẩn hiếu khí cố định nitơ rất giống với Azotobacter sp Chúng được phân lập bởi R J Starkey (1939), tế bào có hình

dạng thay đổi như hình cầu, hình que, hình bầu dục Beijerinski là vi khuẩn gram

âm, không sinh bào tử và bào xác, đặc điểm chung của vi khuẩn thuộc chi này là chịu chua cao Có khả năng sống tốt trong môi trường acid (pH=3), và nhiệt độ

từ 16 – 370C

Trên môi trường vô đạm, sau 3 ngày nuôi cấy xuất hiện khuẩn lạc nhầy Lồi

Vi khuẩn có khả năng cố định được 16 – 20 mg nitơ khi đồng hóa hết 1g dinh dưỡng carbon Ngoài khả năng cố định nitơ chúng còn có khả năng tổng hợp các chất kích thích sinh trưởng cho cây trồng

 Nhóm vi khuẩn thuộc chi Azotobacter sp

Azotobacter sp đuợc phân lập lần đầu tiên vào năm 1901 (M Beijerinck)

Chúng thuộc vi khuẩn hiếu khí nhưng chúng có thể phát triển trong điều kiện kỵ

khí Hầu hết các loài Azotobacter sp đều sống dị dưỡng

Azotobacter sp là vi khuẩn gram âm, không sinh bào tử có khả năng cố định

nitơ tự do Khi chưa trưởng thành tế bào thường có hình que, kích thước 2,0 – 7.0 x 1,0 – 2,5 µm, sinh sản bằng cách phân cắt, di chuyển nhờ tiêm mao Khi trưởng thành mất khả năng di chuyển, kích thước thu nhỏ thành dạng cầu được bao bọc bởi một lớp nhầy

Trong môi trường không chứa nitơ, Khuẩn lạc của Azotobacter sp có dạng

cầu lồi, nhẵn bóng, có khi nhăn nheo Khi nuôi cấy trong môi trường đặc Khuẩn lạc

có màu hồng hoặc nâu đen, sinh sắc tố hình quang màu vàng lục hoặc lam lục, sắc

tố khuếch tán vào môi trường [21], [38]

Azotbacter sp rất nhạy cảm với độ ẩm của đất và hàm lượng của các nguyên

tố khoáng có trong đất (P, K, MO, B, Cu )

Nhiều nghiên cứu cho biết Azotobacter sp có thể phát triển đươc trên môi

trường có pH trong khoảng 4,5 – 9 quá trình cố định nitơ chỉ được thực hiện trong khoảng pH 5,5 – 7,2 Nhiệt độ thích hợp nhất từ 26 – 30oC [22], [25]

Các chủng phân lập từ tự nhiên có khả năng cố định 10 – 15 mg nitơ khi tiêu thụ hết 1g dinh dưỡng Carbon Một số nòi tuyển chọn có khả năng cố định tới 30 mg/1g dinh dưỡng Carbon

Trong đất, Azotobacter sp tập trung ở vùng đất xung quanh rễ cây Ngoài

khả năng cung cấp dinh dưỡng nitơ cho cây nó còn có khả năng kích thích nảy

mầm, kích thích sinh trưởng Trong đất, Azotobacter sp thường phổ biến các

chủng sau:

+ Azotobacter chrococum: Kích thước tế bào 2,0 x 3,1 micromet, có khả

năng di động khi còn non Khi già hình thành nang xác, khuẩn lạc có màu nâu hoặc đen khi về già, không khuếch tán ra môi trường [80], [89]

+ Azotobacter beijerinckii: Có kích thước 2,4 x 4,6 µm Không có khả năng

di động và hình thành nang xác Khuẩn lạc khi già có màu nâu sáng, sắc tố không khuếch tán ra môi trưòng nuôi cấy

+ Azotobacter vinelandii: Tế bào có kích thước 1,5 x 3,4 µm, có khả năng di

động và hình thành nang xác Khuẩn lạc màu lục huỳnh quang, sắc tố khuếch tán vào môi trường [61], [89]

+ Azotobacter agilis: Tế bào có kích thước 2,8 x 3,3 µm, có khả năng di

động, không hình thành nang xác, khuẩn lạc màu vàng lục huỳnh quang, sắc tố khuếch tán vào môi trường [5]

2.1.3.3 Nhóm vi khuẩn lam

Năm 1928, Drewes (Đức) lần đầu tiên chứng minh một cách xác đáng khả năng cố định nitơ của ba loại khuẩn lam và đã phân lập chúng một cách thuần khiết

Đa số các loài khuẩn lam có khả năng cố định nitơ sống tự do trong đất, trong nước nhưng cũng có một số sống cộng sinh trong thực vật

Đây là vi sinh vật hiếu khí, chúng thích hợp phát triển trong môi trường trung tính hoặc kiềm Nhiệt độ thích hợp từ 28 – 30oC Chúng có khả năng cung cấp cho đất khoảng 50 kg nitơ/ha/năm [5]

Ngoài các nhóm vi sinh vật cố định nitơ chủ yếu nói trên người ta còn thấy nhiều vi sinh vật thuộc nhóm khác cũng có khả năng đồng hóa nitơ như: Tảo xanh

Lục, một số đại diện của nấm men và nấm mốc (Saccharomyces apiculatus, Oidium

Lactic )

Có thể nói vi sinh vật đóng vai trò hết sức quan trọng đối với nông nghiệp trong việc cung cấp đạm sinh học cho đất Vấn đề đặt ra cho các nhà khoa học hiện nay là nghiên cứu phương pháp nuôi cấy hiệu quả nhất để tăng sinh khối tế bào Từ

đó ứng dụng vào nông nghiệp, hướng đến một nền sản xuất nông nghiệp sinh thái vững bền trong cả nước nói chung và ở tỉnh Tây Nguyên nói riêng

2.1.4 Một số vi khuẩn có khả năng cố định đạm và tổng hợp auxin

2.1.4.1 Azospirillum lipoferum

Azospirillum là loài vi khuẩn cố định đạm hiện diện trong rễ, vùng đất xung

quang rễ, thân và lá của cây trồng [59] Azospirillum sp thuộc giống

Rhodosprillales, Gram âm, sống tự do Azospirillum sp có khả năng cố định nitơ từ

không khí, tổng hợp IAA, hòa tan lân dạng khó tan và các chất dinh dưỡng khác

[42] Hiện nay có 13 loài Azosprillum sp là A brasilense và A lipoferrum [84], A

amazonense [67], A halopraeferens [75], A irakense [62], A largomobile [50], A doeberinerae [52], A oryae [91], A melinis [72], A canadenis và A zeae [70], A rugosum [92], và gần đây nhất là A picis [65]

Sự hiện diện của vi khuẩn Azospirillum ở một số loại hoa màu

Bảng 2.2 Sự hiện diện của vi khuẩn Azosprillum ở một số loại hoa màu

Loài Azopirillum Loại rau màu Sự hiện diện/các bộ

Cây cọ dầu Rễ, thân, trái

(Nguồn : Dobereiner et al.,1995)

Azospirillum lipoferum là một trong bảy loài Azospirillum được mô tả

Chúng là những vi khuẩn Gram âm hình quê hay chữ S, chiều rộng 1,0 - 1,5 µm và chiều dài 2,0 – 3,0 µm, tăng trưởng tốt ở 300C và pH từ 6 – 7 [40], chiên mao có vành lông rung với những bước sóng ngắn được dùng khi di chuyển và một chiên mao dùng để bơi lội trong môi trường lỏng Nhiệt độ tối ưu cho sự phát triển của vi khuẩn này là 35 -370C Khuẩn lạc trên môi trường agar – khoai tây có màu hồng nhạt hoặc đậm

Theo Dobereiner và Pedrosa ( 1987) thì Azospirillum lipoferum có thể sinh

trưởng và phát triển trong điều kiện hiếu khí và yếm khí nhưng thích hợp trong điều kiện vi hiếu khí với sự có hoặc không có đạm trong môi trường Trong quá trình

sống Azospirillum lipoferum có thể tiết ra những kích thích tố tăng trưởng như

Indole – 3 acetic acid (IAA), Indole – 3 butyric acid (IBA), Abscisic acid (ABA) và

cytokynine Khi chủng vi khuẩn cố định đạm Azospirillum lipoferum vào cây bắp có

thể tăng năng suất 6,6 lần so với đối chứng và tiết kiệm được 90 kg N/ha [30]

2.1.4.2 Gluconacetobacter diazotrophicus

Vi khuẩn gluconacetobacter thuộc họ Acetobacteraceae, gram âm, hiếu khí

bắt buộc, có khả năng chống chịu với acid, nồng độ muối và đường cao [43] Hiện

nay có 4 loại Gluconacetobacter đã được phân lập: Gluconacetobacter

diazotrophicus trên cây mía, Gluconacetobacter johannae và Gluconacetobacter azotocaptans trên cây cà phê và Gluconacetobacter liquefaciens có trong vùng rễ

của những cánh đồng lúa có mưa acid xuất hiện

Năm 1988, Cavancante và Dobereiner phân lập được vi khuẩn cố định đạm

trong rễ, thân mía đường trồng tại Brazil và sau này đặt tên là Gluconacetobacter

diazotropphicus Loài vi khuẩn này có khả năng cố định đạm sinh học, tổng hợp

kích thích tố tăng trưởng, tổng hợp auxin và gibberellin, hòa tan lân khó tan

Gluconacetobacter diazotropphicus là một vi khuẩn gram âm hiếu khí, chịu

được môi trường acid phù hợp cho các loại đất phèn, tế bào có dạng que ngắn thẳng Dưới kính hiển vi điện tử vi khuẩn này ở dạng tế bào đơn, đôi hoặc dầy dài do các

tế bào nối lại mà không có nội bào tử Vi khuẩn này phát triển ở nồng độ sucrose cao (10%) và pH thấp, đặc biệt có khả năng cố định đạm dưới điều kiện ít oxy Nguồn carbon thích hợp cho sự phát triển của vi khuẩn là sucrose 10% nhưng ở nồng độ cao hơn 30% nó vẫn phát triển được Bởi vì sucrose không được vận

chuyển hoặc hấp thu bởi Gluconacetobacter diazotropphicus nên vi khuẩn sẽ tự tạo

ra enzyme ngoại bào, có thể thủy phân sucrose thành fructose và glucose Những nguồn carbon và nitơ khác giúp cho sự phát triển của vi khuẩn như glucose, gluconate, fructose, mannitol, galactose, sodium gluconate, các acid amin như glutamate, serine, phospho và histidine Tuy nhiên những chất như : cellulose, tinh bột, meso – erythritol và methanol 1% là những chất không tốt cho sự phát triển của chúng dù ở nồng độ thấp Acid hữu cơ như succinate, acid dicarboxylic, đặc biệt là acid 2 – keto gluconic có trong cây mía giúp cho sự phát triển của vi khuẩn này Vi khuẩn có thể dùng acid hữu cơ làm nguồn carbon và có khả năng

cố định đạm cao với pH tối ưu là 5,5 tuy nhiên pH vẫn có thể thay đổi tùy theo nguồn carbon

Gần đây, Luna và ctv (2000) [66] cho biết sinh khối của Gluconacetobacter

diazotropphicus trong điều kiện cố định đạm sẽ thấp hơn 30% so với trong điều

kiện không cố định đạm Vi khuẩn không có ảnh hưởng ức chế của nitrate trong môi trường cố định đạm thậm chí có thể dùng kết hợp với phospho Hiện tượng này là

do sự có mặt của enzyme nitrate reductase trong Gluconacetobacter

diazotropphicus Reis và Dobereiner (1998) [51] cho biết nitrogenase của loài vi

sinh vật này được bảo vệ chống lại sự ức chế của O2 ở nồng độ sucrose cao, nhưng lại dễ bị ức chế khi nồng độ sucrose là 1% Vừa qua người ta đã phân lập được dòng

vi khuẩn Gluconacetobacter mới từ lúa mà có thể chịu đựng đến 15mM nitrate

trong môi trường nuôi cấy, điều này rất hữu ích cho những thí nghiệm về phân vi

sinh trong điều kiện nitơ không kiểm soát được Ngoài ra Gluconacetobacter

diazotropphicus có thể chịu đựng được các loại kháng sinh khác như : ampiciline,

sự kích thích phát triển ở cây của vi khuản Gluconacetobacter diazotropphicus sống

trong bộ rễ Các chất như phospho, kẽm, mặc dù chỉ cần một lượng nhỏ cho cây nhưng nó rất cần thiết cho sự phát triển của cây Ở trong đất chúng tồn tại dưới dạng bất hoạt động, mà ở thể này cây không thể sử dụng được Vì vậy nhiệm vụ của những dòng vi khuẩn hòa tan lân là chuyển phospho và kẽm thành những dạng hoạt động mà cây có thể hấp thụ dễ dàng, đây là một khả năng đặc biệt quan trọng, mang

lại lợi ích cho nền nông nghiệp đã được tìm thấy ở Gluconacetobacter

diazotropphicus [18]

2.1.4.3 Pseudomonas stutzeri

Pseudomonas stutzeri thuộc giới Bacteria; Ngành: Proteobacteria; Lớp: Gamma proteobacteria; Bộ: Pseudomonadaceae; Giống: Pseudomonas; Loài: Pseudomonas stutzeri [93]

Pseudomonas là vi khuẩn sống tự do, chúng hiện diện khắp nơi (trong đất,

trong nước, thực vật, một số làm hư hỏng thực phẩm) và đa dạng nhiều chủng loại [74] Một số nghiên cứu đã chứng minh những loài thuộc giống vi khuẩn

Pseudomonas sp có khả năng cố định đạm như Pseudomonas stutzeri, P diminuta,

P fluorescens, P paucimonilis, P pseudoflava, P putida, P saccharophila, P vesicularis [48] một số dòng vi khuẩn Pseudomonas cũng có khả năng hòa tan lân

như Pseudomonas fluorescens, P putida, P chlororaphis [47]

Pseudomonas stutzeri thuộc vi khuẩn gram âm, hình que, dài 1 - 3µm, rộng

0,5µm [60] là loài có khả năng chuyển động, di chuyển bằng chiên mao đỉnh

Chúng được phân lập lần đầu tiên bởi Buri và Stutzer, có tên gọi Bacillus

denitrificans II sau đó đổi tên thành Pseudomonas stutzeri bởi Niel và Allen [88]

Pseudomonas stutzeri có môi trường phân bố rộng, là loài có tính đa dạng

sinh học cao, sống được trong những điều kiện sinh thái khác nhau [64], sống trong đất, ao nuôi, đầm lầy, biển [77],[76],[81], các hóa chất làm giấy và trong các mẫu

bệnh lý [77] Gần đây, vi khuẩn Pseudomonas stutzeri còn được phân lập từ nước

thải chăn nuôi heo [83]

Bennasar et al.,(1998) [41] đã chứng minh dòng vi khuẩn Pseudomonas

stutzeri có khả năng khử nitrate thành khí nitơ nhờ các gene nirS, nosZ, norB

Ngoài khả năng khử đạm, một số dòng Pseudomonas stutzeri còn mang gene nifH

có khả năng cố định đạm [64]

Các khuẩn lạc Pseudomonas stutzeri được mô tả là không đồng nhất và có

tính kiên định Các dòng được phân lập có khuẩn lạc nhăn nheo, hơi đỏ, nâu, không vàng Đặc tính điển hình là cứng, khô, gắn kết chặt [76]

2.1.4.4 Burkholderia vietnamiensis

Vi khuẩn Burkholderia là vi khuẩn cố định đạm, Gram âm, dạng hình que

ngắn, đường kính khoảng 1µm, chúng có thể di chuyển nhờ các chiên mao ở đầu [44] Chúng sinh trưởng và phát triển trong điều kiện kỵ khí hoặc hiếu khí, trong

môi trường ít khí oxy thì phát triển tốt nhất [44] Trong môi trường nuôi cấy tạo thành các khuẩn lạc màu trắng hoặc hơi vàng, đường kính 2-4mm, tròn, phẳng hoặc

dài [44],[45] Vi khuẩn Burkholderia sống cộng sinh với cây rồng và có khả năng

cố định đạm, kích thích sự tăng trưởng của cây, hiện diện trong nhiều vùng rễ và rễ của nhiều loại cây như bắp, mía, cà phê, lúa [78] Vi khuẩn này cũng được tìm thấy

ở khóm, chuối [90].Hiện nay người ta tìm được khoảng hơn 40 loài Burkholderia

[69] bao gồm vi khuẩn cố định đạm trong đất, rễ cây, kích thích các giai đoạn phát triển của cây [49], [71]

Loài Burkholderia vietnamiensis được tìm thấy trong rễ lúa trồng ở miền nam Việt Nam [86] Thí nghiệm ở lúa cho thấy loài Burkholderia vietnamiensis

Sau 14 ngày chủng giúp tăng khả năng đâm chồi 33%, số lượng rễ tăng 57%,

bề mặt lá tăng 30%, năng suất lúa tăng 13 – 22% [87] Thí nghiệm cũng cho thấy

lúa được chủng vi khuẩn Burkholderia vietnamiensis cho năng suất tương đương

với lúa trồng ngoài đồng bón phân đạm 25 – 30kg N/ha [87]

2.1.4.5 Klebsiella pneumoniae

Các dòng vi khuẩn Klebsiella được nghiên cứu nhiều ở Ấn Độ, Trung Quốc

Vi khuẩn Klebsiella thuộc nhóm γ – Proteobacteria, là vi khuẩn Gram âm, hình que, ít di chuyển, sống kỵ khí không bắt buộc Có 2 loài quan trọng là Klebsiella

pneumoniae và Klebsiella oxytoca Vi khuẩn Klebsiella thường xuất hiện tự nhiên

trong đất, một số sống nội sinh trong cây trồng [94]

Klebsiella pneumoniae là vi khuẩn Gram âm, hình que Sinh trưởng và phát

triển trong điều kiện vi hiếu khí trên môi trường bán đặc, chúng phát triển thành lớp màng mỏng cách mặt môi trường nuôi cấy khoảng 0,5 – 1cm Đối với những dòng

vi khuẩn phân lập trên môi trường Nfb, khi tăng trưởng chúng làm biến đổi màu của bromothymol blue trên môi trường từ màu xanh lá cây ( trung tính, pH = 6,8) sang màu xanh dương đậm của môi trường kiềm

2.2 Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước

2.2.1 Tình hình nghiên cứu ngoài nước

Năm 1986 phân bón vi sinh do Noble Hiltner sản xuất đầu tiên tại Đức được

đặt tên là Nitmgen, đây là loại phân được chế tạo bởi vi khuẩn Rhizolium do

Bijerink phân lập năm 1988 Từ đó đến nay đã có rất nhiều công trình nghiên cứu

nhằm ứng du ̣ng và mở rô ̣ng viê ̣c sản xuất các loa ̣i phân bón vi sinh vâ ̣t cố đi ̣nh N 2

mà thành phần còn được bổ sung phân phối them một số chủng vi sinh vật có ích

khác( ví dụ như xạ khuẩn cố định N sống tự do Frankia spp, các vi khuẩn cố định N sống tự do Clostridium, Pasterum, Beijerinkiaindica…

Fulchieri (1993) nghiên cứ u sử du ̣ng 3 chủng Azospirillum để xử lý hạt

cho ngô Kết quả cho thấy đã làm tăng chiều cao cây , tăng sinh khối và tăng năng suất ngô lên 59% so với đối ch ứng, các chủng này có thể cung cấp khoảng 60kg N/ha [57]

Elazar Fallik and Yaacov Okon (1996) nghiên cứ u sử du ̣ng Azospirillum

brasilense kết hợp với than bùn cho Setaria italic và ngô Kết quả cho thấy chiều dài thân, trọng lượng kh ô, năng suất tăng đáng kể Sinh khối vi khuẩn là 108 CFU/1g than bùn có hiê ̣u quả gây nhiễm ha ̣t giống cao nhất [55]

Hiê ̣u quả của viê ̣c nhiễm chế phẩm Azotobacter sp cho đất và ha ̣t giống, cây con

đã được chứng minh trên các thí nghiê ̣m đồng ruô ̣ng Theo nghiên cứu của Puneet(1998) cho thấy việc nhiễm Azotobacter sp kích thích nảy mầm của ha ̣t , kích

thích ra rễ và sinh trường, năng suất lúa mì, ngô tăng 10%- 15% so với đối chứng [34]

Tổng kết các kết quả nghiên cứu của Nhâ ̣t Bản , Hoa Kì, Trung Quốc, Ấn Độ

cho thấy sử du ̣ng chế phẩm Azotobacter có thể cung cấp cho cây trồng từ 30-60 kg

N/ha/năm và tổng lươ ̣ng N do vi sinh vâ ̣t tổng hơ ̣p trên hành tinh có thể đa ̣t đến 240

triê ̣u tấn/năm Vi khuẩn cố đi ̣nh N tự do Azotobacter còn có khả năng tổng hợp B 1,

giberellin, cytokinin kích thích tăng trưởng cây trồng [36]

Nghiên cứu của Puneet (1998) cũng cho thấy nếu bón phối hợp Azobacter sp với các chủng phân giải P như Aspergillus niger sẽ là tăng năng suất lúa mì tăng 17.7% trong khi Azobacter chỉ tăng 9% Kapoor cũng cho kết quả tương tự khi phối

hơ ̣p chủng Azotobacter sp với các chủng phân giải phosphate như Bacillus sp, Pseudomonas sp Thí nghiệm làm tăng năng suất lúa bông vải lên 10- 20% [73]

El-Komy (2005) nghiên cứ u phối hơ ̣p hai chủng cố đi ̣nh N Azospirillum và phân giải lân Bacillus megaterium xử lý cho lúa mì Kết quả cho thấy hàm lượng N

trong thân lúa mì của các thí nghiệm có xử lý hai chủng loại này tăng 37-53%; hàm

lươ ̣ng P trong thân tăng 48.6%; hàm lượng K tăng 10- 14.3% so với đối chứng không xử lý Kết quả nghiên cứu cũng cho thấy xử lý phối hợp hai chủng có tác dụng cộng hưởng, tốt hơn xử lý đơn chủng [53]

Zemrany (2006) nghiên cứ u sử du ̣ng chủng A lipoferum cho ngô Kết quả

cho thấy khi sử du ̣ng chủng này đã làm giảm 50% lượng N cho cây mà năng suất ngô vẫn đảm bảo [54]

Abbas Akbari và cô ̣ng sự (2007) đã phân lâ ̣p và tuyển cho ̣n được mô ̣t số

chủng Azospirillum sp có khả năng sinh tổng hợp IAA kích thích sinh trưởng của lúa mì Kết quả là sự nhiễm các chủng Azospirillum đã tăng đường kính gốc lúa ,

chiều dài rễ, trọng lượng khô và số lượng long rễ so với đối chứng [37]

Fabricio Cassan và cô ̣ng sự (2009) đã nghiên cứu phối hợp hai chủng

Azospirillum brasilense Az39 và Bradyhizobium japonicum E109 xử lí cho ngô và

đâ ̣u tương Kết quả cho thấy xử lý phối hợp hai chủng cho hiê ̣u quả cao hơn so với xử lý đơn chủng Tỉ lệ nảy mầm , chiều cao cây , chiều cao rễ , trọng lượng khô đều tăng so với đối chứng [56]

Andres D Naiman và cô ̣ng sự (2009) đã nghiên cứu xử lý gây nhiễm vi khuẩn

Azospirillum brasilense và Pseudomonas fluorescens cho lú a mì Kết quả cho thấy chiều cao cây tăng 12% đường kính gốc thân tăng 40%, năng suất tăng 16% [39]

2.2.2 Nghiên cư ́ u trong nước

Ở Việt Nam, phân vi sinh vâ ̣t cố đi ̣nh đa ̣m ở c ây ho ̣ đâ ̣u và phân vi sinh vâ ̣t phân lân đã được nghiên cứu từ năm 1960 Đến năm 1987, phân Nitragin trên nền đất mang than bùn mới được hoàn thiê ̣n Đến năm 1991 đã có hơn 10 đơn vi ̣ trong

cả nước tập trung nghiên cứu phân vi sinh vậ t Các nhà khoa học đã phân lập được nhiều chủng vi sinh vâ ̣t cố đi ̣nh đa ̣m và mô ̣t số vi sinh vâ ̣t phân giải lân

Nhằm mu ̣c tiêu phát triển nông nghiê ̣p sinh thái bền vững và ứng du ̣ng

CNSH và nông nghiê ̣p Trong những năm gần đây , Viê ̣t Nam có khá nhiều nghiên

cứu về Azotobacter và Azospirillum và các vi khuẩn nội sinh có khả năng cố định

đa ̣m khác làm phân sinh ho ̣c

Nguyễn Thi ̣ Phương Chi (1999) nghiên cứu bón thử nghiê ̣m chủng cố đi ̣nh N

tự do Azotobacter và chủng phân giải phosphate Archomobacter, Pseudomonas aeruginosa Kết quả cho thấy chế phẩm sinh ho ̣c làm tăng sinh trưởng chiều cao ma ̣ 7.47- 16.93% và năng suất lú a tăng từ 13.39- 55.85% [2]

Hồ Thị Kim Anh, Nguyễn Ngo ̣c Dũng (1999) nghiên cứu ảnh hưởng của các chủng cố định N trong rễ lúa đến sinh trưởng của mầm lúa CR 203 Nhóm tác giả đã phân lâ ̣p được 78 chủng cộng sinh với rễ lúa Các chủng này kích thích sự nảy mầm và rễ của lúa CR 203 [1]

Phạm Thị Ngọc Lan(1999) đã phân lâ ̣p đươ ̣c 37 chủng Azotobacter trên đất

gò đồi vùng Thừa Thiên - Huế Nhóm nghiên cứu cũng tuyển chọn được hai chủng

có khả năng kháng sinh , tồn ta ̣i được ở pH kiềm (pH= 8) Kết quả thử n ghiê ̣m gây nhiễm cây giống keo tai tươ ̣ng trong vườn ươm đã làm tăng tỷ lê ̣ sống , sinh khối , chiều cao cây và hàm lượng N trong lá cũng cao hơn so với đối chứng [22]

Phạm Bích Hiên và Phạm Văn Toản (2003) đã nghiên cứu 10 chủng

Azotobacter của Việt Nam và nhận thấy rằng ngoài khả năng cố định N chúng còn

có khả năng sinh tổng hợp chất kích thích sinh trưởng IAA Nhiê ̣t đô ̣ thích hợp của các chủng này là 25- 300C, pH thích nghi rô ̣ng từ 5.5-8.0 [21]

Lâm Minh Tú , Trần Văn Tuân (2003) nghiên cứu sản xuất mô ̣t số phân bón đơn chủng , đa chủng cho cây trồng Các chủng sử dụng trong nghiên cứu là

Azotobacter bejerrinski, Azotobacter vinelandii, Bacillus polymyxa Thử nghiê ̣m trên khoai tây làm tăng năng suất từ 100-300% so với đối chủng [34]

Phạm Văn Toản (2003) sử du ̣ng phân bón sinh ho ̣c giảm được 20% phân bón

vô cơ N , P, K nhưng năng suất khoai tây vẫn tăng so với đối chứng 15-50%, cà chua tăng 12-34%, lạc tăng 30% và giảm đáng kể bê ̣nh héo xanh [33]

Lăng Ngo ̣c Dâ ̣u (2004) đã nghiên cứu khả năng ta ̣o IAA của vi khuẩn

Azospirillium lipoferum, tiến hành nuối cấy chủng vi khuẩn này trên môi trường NFB có bổi sung Trytophan , theo dõi ta ̣i những thời điểm khác nhau Kết quả cho thấy ta ̣i thời điểm 10 ngày sau khi cấy ủ khả năng tạo IAA cao nhất [3]

Nguyễn Thanh Đào (2005), Khảo sát một số đặc tính Azospirillum sp và ảnh hưởng của chúng trên vài dạng cây trồng ngắn ngày, đã chọn được 2 chủng vi khuẩn Azospirillum có khả năng cố định đạm và sinh IAA tốt (A2 và A3), thử nghiệm sản xuất phân vi sinh trên cây lúa kết quả là phát triển chiều cao, tăng sự phân nhánh, số bông không tăng nhưng số lượng và trọng lượng hạt chắc tăng, đồng thời số hạt lép giảm, năng suất láu tăng [13]

Nguyễn Hữu Hiê ̣p, Renato (2007) đã phân lâ ̣p các dòng vi khuẩn nô ̣i sinh để sản xuất phân vi sinh ở quy mô phòng thí nghiệm cho cây mí a trồng ta ̣i tỉnh Sóc Trăng [19]

Cao Ngọc Điê ̣p , Nguyễn Văn Mít (2007) cũng nghiên cứu hiệu quả phân vi

khuẩn Gliconacetorbacter diazotrophycus và vi khuẩn Pseudomonas stusderi trên năng suất và trữ lượng đường trên cây mía ( Saccharum officinarumL) trồng trên đất

phù sa tỉnh Hậu Giang [16]

Lê Quang Dũng (2011) Phân lập và tuyển chọn một số chủng vi khuẩn cố định Nitơ tự do Azotobacter sp trên một số loại đất ở Đăk Lăk, tuyển chọn được 4 chủng Azotobacter có ảnh hưởng tốt làm gia tăng năng suất của rau cải ngọt từ 30-60% so với đối chứng [12]

Ngô Thanh Phong, Cao Ngọc Diê ̣p (2011) đã nghiên cứu xác đi ̣nh mức đô ̣ cố

đi ̣nh đa ̣m sinh ho ̣c của Burkholderia sp KGI và Pseudimonas sp BT1 trên cây lúa

cao sản OM2517 trồng ngoài đồng Kết quả 2 chủng này có thể thay thế 25- 50% N cho năng suất cao hơn đối chủng khi bón 100% N mà không nhiễm vi khuẩn [16]

Nguyễn Anh Dũng và cô ̣ng sự (2012) đã phân và xác đi ̣nh mức đô ̣ cố đi ̣nh

đa ̣m sinh ho ̣c của Azospirillum trên cây ngô trong bầu đất ta ̣i Đăk Nông Kết quả

chủng này có t hể thay thế 25- 50% N cho năng suất cao hơn đối chủng khi bón 100% N mà không nhiễm vi khuẩn [4]

Trần Thanh Phong (2012) cũng nghiên cứu đánh giá khả năng cố định đạm của vi khuẩn nội sinh đến năng suất và chất lượng của trái k hóm trồng tại huyệ n Tân Phước, tỉnh Tiền Giang [27]

Ngô Thanh Phong và Cao Ngọc Điệp (2012) Phân lập và tuyển chọn vi

khuẩn cố định đạm Pseudimonas sp từ đất vùng rễ cây lúa ở Đồng Bằng Sông Cửu

Long và đánh giá hiệu quả trên giống lúa OM2517 đã phân lập và thử nghiệm được dongfvi khuẩn P.tutzeri PS4 và B.vietnamiensis BV3 đều có khả năng cố định đạm cao cung cấp 50% đạm sinh học cho nhu cầu sinh trưởng và phát triển của cây lúa [28]

PHẦN 3 ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu

Đối tượng: Vi khuẩn có khả năng cố định đạm phân lập trong tự nhiên

Vật liệu nghiên cứu:

Mẫu đất được lấy từ các ruộng trồng lúa, đậu tương, ngô, mía, cà chua, rau màu tại các tỉnh Thái Nguyên, Hưng Yên, Vĩnh Phúc, Bắc Ninh, Thanh Hóa

3.2 Địa điểm và thời gian nghiên cứu

- Địa điểm: Phòng thí nghiệm Công nghệ Lên men Trường đại học Nông Lâm Thái Nguyên

CaSO4.2H2O Trung Quốc Safranin Trung Quốc

Na2MoO4 Trung Quốc FeCl3.6H2O Trung Quốc

MgSO4.7H2O Trung Quốc Bromothymol blue Trung Quốc

3.3.2 Thiết bị sử dụng

Bảng 3.2: Các thiết bị sử dụng trong thí nghiệm Tên thiết bị Xuất xứ Tên thiết bị Xuất xứ

Nồi hấp thanh trùng Trung Quốc Cân phân tích Trung Quốc

Các dụng cụ khác được sử dụng trong thí nghiệm bao gồm: micropipette, đầu côn, bình tam giác, que cấy, que trang, đĩa petri, ống nghiệm, ống phancol, đèn cồn, giá đỡ ống nghiệm,…

Môi trường nuôi cấy

Môi trường nghiên cứu thay thế

- Môi trường nước cà chua

- Môi trường giá đỗ

3.5 Nội dung nghiên cứu

- Nội dung 1: Phân lập và tuyển chọn chủng vi khuẩn có khả năng cố định đạm cao trong tự nhiên

- Nội dung 2: Khảo sát khả năng sinh IAA của chủng được tuyển chọn

- Nội dung 3: Nghiên cứu đặc điểm sinh lý, sinh hóa của các vi khuẩn đã tuyển chọn

- Nội dung 4: Định danh sơ bộ vi khuẩn tuyển chọn được ở nội dung trên

- Nội dung 5: Nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường đến khả năng phát triển của chủng

3.6 Phương pháp nghiên cứu

3.6.1 Phương pháp thu thập mẫu

(Phương pháp lấy mẫu đất và chuẩn bị mẫu đất theo TCVN 5960-1995)

Phương pháp lấy mẫu rễ cây:

- Thu mẫu một cách ngẫu nhiên rễ cây (chè, lạc, lúa, đậu) trên các nền đất khác nhau, mỗi ruộng lấy 2 gốc

Toàn bộ rễ được đựng trong túi nilon đã khử trùng Các mẫu sau khi lấy được ghi nhãn nơi lấy, ngày lấy và người thu mẫu Mẫu rễ cây chè sau khi thu được đem đến phòng thí nghiệm, rửa thật sạch đất bám ở rễ dưới vòi nước chảy, để ráo tự nhiên, để riêng từng mẫu rồi tiến hành phân lập hoặc bọc riêng từng mẫu trong túi nilon đã khử trùng buộc chặt và bảo quản trong tủ lạnh (5o

C) nếu chưa phân lập ngay [10],[36]

3.6.2 Phương pháp phân lập và tuyển chọn

3.6.2.1 Phương pháp phân lập

Cách tiến hành:

1 Trước hết các mẫu đất phải được xử lý trước khi phân lập bằng cách phơi khô ở nhiệt độ phòng 2-3 ngày, sau đó dùng rây qua sàng có kích thước 2-3mm

2 Cân 1g đất đã xử lý cho vào 9ml nước cất khử trùng, dùng vortex hoà tan đất

3 Pha loãng mẫu ở các nồng độ pha loãng khác nhau: 10-4, 10-5 là 2 nồng độ thích hợp để phân lập vi sinh vật trong đất ở Việt Nam

4 Hút 0,5 ml dịch pha loãng ở 2 nồng độ trên nhỏ lên đĩa Peptri chứa môi trường thạch Burk’ vô đạm Dùng que gạt trang đều dịch trên bề mặt thạch cho đến khi bề mặt thạch khô thì dừng lại

5 Đặt đĩa thạch trong tủ 300C, phân vi sinh vật từ những khuẩn lạc riêng rẽ trên đĩa thạch sau khoảng thời gian 4- 10 ngày [7]

6 Sau khoảng thời gian từ 4 – 6 ngày , ta quan sát hình thái và khả năng phát triển của khuẩn lạc trên môi trường vô đạm, từ đó tách riêng rẽ những khuẩn lạc nghi ngờ là vi khuẩn cố định đạm, cấy chuyển nhiều lần sang môi trường như trên cho đến khi các khuẩn lạc tách rời và đều so với các khuẩn lạc khác trên môi trường

7 Tiến hành cấy giữ giống sau khi làm thuần, ta cấy giữ giống vào môi trường Burk’ trong ống thạch nghiêng và bảo quản ở 40C Mỗi chủng giữ vào 2 ống thạch nghiêng, 1 để cất giữ và một để thực hiện các thí nghiệm tiếp theo [36]

3.6.2.2.Tuyển chọn các chủng vi khuẩn có khả năng cố định đạm cao trên môi trường Ashby thạch đĩa theo phương pháp Koch [9]

Tiến hành cấy các chủng vi khuẩn phân lập được ở trên vào đĩa petri chứa môi trường Ashby thạch Đưa các đĩa thạch đã được cấy chủng vi khuẩn vào tủ 300

C sau 4 - 5 ngày tiến hành quan sát kích thước khuẩn lạc, đo kích thước và chọn ra những chủng có kích thước lớn để thực hiện các bước tiếp theo

Ngoài ra để xác định khả năng cố định đạm của các chủng vi khuẩn đã tuyển chọn được bằng phương pháp định lượng đạm tổng số - Kjeldnhl

 Nguyên lý

Đẩy muối amoni ra thể tự do bằng một chất kiềm mạnh hơn amoniac nhưng không quá mạnh (như Mg(OH)2 hay Na2CO3) để tránh ảnh hưởng thực phẩm Dùng hơi nước kéo amoniac đã được giải phóng ra thể tự do sang bình chuẩn độ và định lượng bằng H2SO4 0,1N với alizainnatri sunfonat làm chỉ thị màu

 Tiến hành

- Trong phương pháp định lượng amoniac, nước sử dụng nhất thiết không được có amoniac hay muối amoni Do đó trước khi cất kéo amoniac để định lượng phải rửa máy cho thật kỹ để loại amoniac (nếu có)