phân lập, tuyển chọn một số chủng vi khuẩn cố định đạm nội sinh trong rễ cây ngô tại một số địa điểm của tỉnh đăk lăk

Trong đó, việc phân lập và tuyển chọn các chủng vi sinh vật là khâu đầu tiên và quan trọng trong quy trình tạo ra chế phẩm [7].Trong vài chục năm gần đây ngày càng gia tăng các nghiên cứ

MỞ ĐẦU

1 Tính cấp thiết của đề tài

Nitơ (N) là nguyên tố dinh dưỡng quan trọng không chỉ với cây trồng mà ngay cả đối với vi sinh vật Nguồn dự trữ N trong tự nhiên rất lớn chỉ tính riêng trong không khí

N chiếm khoảng 78,16% thể tích Người ta ước tính trong bầu không khí bao trùm lên 1ha đất đai chứa khoảng 8 triệu tấn N, lượng N này có thể cung cấp dinh dưỡng cho cây trồng hàng chục triệu năm nếu như cây trồng đồng hóa được chúng Trong cơ thể các loại vi sinh vật chứa khoảng 4,1015 tỷ tấn N Cây trồng cũng như các loại động vật và người không có khả năng đồng hóa trực tiếp nguồn N2 tự do từ không khí (Nester et al.,2004) Nhưng tất cả nguồn N trên cây trồng đều không tự đồng hóa được mà phải nhờ vi sinh vật Hàng năm cây trồng lấy đi từ đất hàng trăm triệu tấn N Bằng cách bón phân con người đã trả lại cho đất khoảng hơn 40%, lượng thiếu hụt còn lại cơ bản được

bổ xung bằng Nitơ do hoạt động sống của vi sinh vật Vì vậy việc nghiên cứu sử dụng loại đạm sinh học này được xem là một giải pháp quan trọng trong nông nghiệp, đặc biệt trong sự phát triển để hướng tới một nền nông nghiệp sinh thái bền vững Tuy nhiên tồn tại một số vi sinh vật có khả năng biến N2 trong khí quyển thành NH3 cung cấp đạm cho cây mà chỉ cần một lượng năng lượng rất ít (3-5kcal/M) Chúng được gọi chung là các vi sinh vật cố định đạm.

Phân bón vi sinh (Nitragin) ra đời tại Đức năm 1896 do Noble Hiltner sản xuất là công trình ứng dụng cơ chế cố định đạm sinh học đầu tiên và sau đó đã phát triển mạnh

mẽ ra các nước khác Phân vi sinh có nhiều ưu điểm so với phân hóa học, ngoài tác dụng nâng cao năng suất và chất lượng cây trồng, tiết kiệm phân vô cơ, giảm chi phí sản suất thì phân vi sinh còn góp phần quan trọng trong việc bảo vệ môi trường và phát triển nông nghiệp bền vững Ở Việt Nam phân vi sinh đã được nghiên cứu từ những năm

1960 Tuy nhiên tình hình sản xuất phân vi sinh ở nước ta vẫn chưa đáp ứng đủ nhu cầu thực tiễn sản xuất của nền nông nghiệp, do quy mô sản xuất nhỏ, chất lượng sản phẩm chưa hoàn thiện và ổn định Do đó, nghiên cứu để hoàn thiện và nâng cao chất lượng

phân vi sinh là việc làm hết sức cần thiết Trong đó, việc phân lập và tuyển chọn các chủng vi sinh vật là khâu đầu tiên và quan trọng trong quy trình tạo ra chế phẩm [7].

Trong vài chục năm gần đây ngày càng gia tăng các nghiên cứu vi khuẩn có ích chúng có thể nội sinh hay ngoại sinh có khả năng cố định N tự do hoặc phân giải các phosphate khó tan làm tăng năng xuất cây trồng đồng thời hạn chế được những độc tính của đất khi sử dụng phân bón hoá học…Đặc biệt là các nhóm vi khuẩn khu trú trong vùng rễ của cây trồng Nhóm vi sinh vật này gọi là PGPR “Plant Growth Promoting

Rhizobacteria” và có những dòng thể hiện ưu điểm mạnh như: Pseudomonas,

Azospirillum, Burkhoderia, Bacillus, Enterobacter, Rhizobium, Erwinia, Serratia, Alcaligenes, Arthobacter, Acinetobacter và Flavobacterium Nhóm vi khuẩn này có khả

năng cố định N, tổng hợp nhiều chất kích thích sinh trưởng thực vật IAA, GA3… góp phần nâng cao độ phì nhiêu của đất, kích thích tăng trưởng, tăng năng suất cây trồng, hạn chế bón phân hóa học và phát triển nền nông nghiệp sinh thái bền vững [38]

Ở Việt Nam đã có một số nghiên cứu, phân lập các chủng vi khuẩn nội sinh trong

rễ lúa, rễ cây lạc, cây cà phê Tuy nhiên, những nghiên cứu về vi khuẩn cố định đạm nội sinh trong rễ cây ngô còn rất ít Đặc biệt, hiện nay chưa có một nghiên cứu nào về

thành phần loài của vi khuẩn cố định đạm nội sinh trong rễ cây ngô trên địa bàn tỉnh Đăk

Lăk.

Xuất phát từ thực tế đó, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: “Phân lập, tuyển

chọn một số chủng vi khuẩn cố định đạm nội sinh trong rễ cây ngô tại một số địa điểm của tỉnh Đăk Lăk”

2 Mục tiêu của đề tài

- Phân lập và tuyển chọn được một số chủng vi khuẩn cố định đạm trong rễ cây ngô ở Đăk Lăk.

- Xây dựng qui trình nhân sinh khối một số chủnng vi khuẩn có hoạt tính cố định

đạm cao làm phân sinh học chuyên dụng cho cây ngô.

3 Ý nghĩa của đề tài

Ý nghĩa khoa học

Xác định được một số chủng vi khuẩn có khả năng cố định đạm, sống nội sinh

trong rễ cây ngô.

Ý nghĩa thực tiễn

Kết quả của đề tài là cơ sở cho việc lựa chọn các chủng vi khuẩn sống nội sinh trong rễ cây ngô có hoạt tính cố định đạm cao để sản xuất phân vi sinh có hiệu quả, nâng cao độ phì nhiêu của đất, hạn chế bón phân hóa học, tăng năng suất cây ngô và góp phần phát triển một nền nông nghiệp sinh thái bền vững

PHẦN I TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Giới thiệu về cây ngô

1.1.1 Nguồn gốc và phân loại thực vật

Ngô có tên khoa học là Zea mays L (Zea: Từ Hi Lạp để chỉ cây ngũ cốc và từ

Mays là từ “Mahix” tên gọi cây ngô của người bản địa da đỏ [9] Cũng có thể Mays là từ

“Maya” tên một bộ tộc da đỏ ở vùng Trung Mỹ - xuất xứ của cây ngô) [17].

Cây ngô thuộc: Ngành : Maopholiophyta

Có rất nhiều giả thuyết về nguồn gốc của ngô tại châu Mỹ như ngô là sản phẩm thuần

dưỡng trực tiếp từ cỏ ngô (Zea mays ssp parviglumis) một năm ở Trung Mỹ, có nguồn

gốc từ khu vực thung lũng sông Balsas ở miền nam Mexico Cũng có giả thuyết khác cho rằng ngô sinh ra từ quá trình lai ghép giữa ngô đã thuần hóa nhỏ (dạng thay đổi

không đáng kể của ngô dại) với cỏ ngô thuộc đoạn Luxuriantes Song điều quan trọng

nhất nó đã hình thành vô số loài phụ, các thứ và nguồn dị hợp thể của cây ngô, các dạng cây và biến dạng của chúng đã tạo cho nhân loại một loài ngũ cốc có giá trị đứng cạnh lúa mì và lúa nước

1.1.2 Đặc điểm hình thái cây ngô [9].

Cơ quan sinh dưỡng của ngô gồm rễ, thân và lá làm nhiệm vụ duy trì đời sống cá thể

Hình 1.1 Các bộ phận của cây ngô

Rễ ngô: Trong quá trình sinh trưởng phát triển, cây ngô có 3 loại rễ Đó là: rễ

mầm, rễ đốt và rễ chân kiềng.

Thân ngô: Thân đặc, đường kính thân khoảng 2 – 4cm tùy thuộc vào giống, mùa vụ và trình độ thâm canh, thân có nhiều lóng Trong điều kiện bình thường ngô cao từ 1,8 – 2m, từ khi mọc đến khi cây có 6 – 7 lá thân phát triển chậm, từ lúc 8 – 9

lá đến nhú cờ, nở hoa cây phát triển nhanh và đến khi hoa đực phơi màu, bắp phun râu cây vẫn tiếp tục lớn Sau khi thụ phấn thì thân ngừng phát triển.

Lá ngô: Gồm có lá mầm, lá thân, lá ngọn và lá bẹ Lá được chia thành các bộ phận như: bẹ lá, phiến lá và thìa lá Phiến lá rộng và dài, mép lá gợn sóng, có nhiều lông tơ Gân lá song song Lá mang bắp có chiều dài dài nhất.

Hoa ngô: Gồm hoa đực (bông cờ) và hoa cái Bông cờ có nhiều nhánh, mỗi nhánh có nhiều hoa xếp thành từng chùm, mỗi chùm có hai hoa, mỗi hoa có 3 nhị đực, mỗi nhị đực có 1 bao phấn, một bao phấn có hai ô, một ô chứa từ 1000 – 2500 hạt phấn Hoa cái sinh ra từ nách lá gồm có lõi bắp có nhiều đốt ngắn có lá bao bi, mỗi hoa cái có một râu Hoa cái mọc từng đôi trên hoa tự Mỗi chùm hoa có hai hàng hoa nhưng hoa thứ hai bị thoái hóa chỉ một hoa hình thành hạt, một đôi chùm hoa cho hai hàng hạt nên hàng hạt ở trên bắp luôn luôn chẵn.

Bắp ngô: Phát sinh từ mầm nách lá trên thân, số mầm nách lá trên cây

ngô nhiều, nhưng chỉ 1-3 mầm nách trên cùng phát triển thành bắp Tuỳ thuộc vào giống, điều kiện sinh thái, chăm bón, mật độ, mùa vụ… mà tỷ lệ cây 2-3 bắp, số hạt trên bắp, vị trí đóng bắp, thời gian phun râu, trỗ cờ…có khác nhau.

Hạt ngô: Hạt được coi là cơ quan khởi đầu của cây Thuộc loại quả dĩnh, gồm các

bộ phận chính là vỏ hạt, lớp alơron, phôi và nội nhũ, phía dưới của hạt có gốc hạt là phần dính liền hạt với lõi ngô Hạt ngô được hình thành gồm các giai đoạn: từ thụ phấn đến chín sữa là 10 – 15 ngày, từ chín sữa đến chín sáp là 15 – 20 ngày và từ chín sáp đến chín hoàn toàn là 10 – 15 ngày.

1.1.3 Yêu cầu sinh thái của cây ngô [17],[21]

1.1.3.1 Yêu cầu nhiệt độ

Ngô là cây trồng ưa khí hậu ẩm, nhiệt độ thích hợp vào khoảng 200C - 28 0C Nhiệt độ có thể ảnh hưởng đến thời gian sinh trưởng của cây ngô Trong cả chu kỳ sống cũng như trong từng thời kỳ sinh trưởng phát triển của cây ngô cần một lượng tích nhiệt nhất định Đủ lượng nhiệt cây mới sinh trưởng phát triển bình thường Tùy vào từng giống khác nhau mà cần một lượng nhiệt khác nhau Giống càng chín muộn thì cần lượng tích nhiệt càng cao.

1.1.3.2 Yêu cầu về ánh sáng

Ngô là cây có nguồn gốc nhiệt đới thuộc nhóm cây ngày ngắn Ánh sáng là yếu

tố quan trọng cho sinh trưởng và phát triển của cây ngô, tạo điều kiện thuận lợi cho quá

trình tích luỹ chất dinh dưỡng và ảnh hưởng đến độ dài của quá trình sinh trưởng Trung

bình cần 12 giờ chiếu sáng/ngày.

Nghiên cứu phản ứng của cây ngô với độ dài ngày cho thấy cây ngô hình thành các kiểu hình thái khác nhau D.Azit đã chỉ ra rằng: Các giống ngô ở châu Âu

do kết quả chọn lọc đã hoàn thành được chu kỳ ánh sáng trong điều kiện ngày dài, loại trừ được yêu cầu ngày ngắn Cuperman và Razumov cho rằng rút ngắn thời gian chiếu sáng ban ngày đến 12 giời sẽ thúc đẩy sự trổ cờ và hình thành bắp.

Ánh sáng ảnh hưởng đến sinh trưởng của cây ngô ở hai mặt là số giờ chiếu sáng và chất lượng ánh sáng Những tia sáng dài đã kìm hãm sự sinh trưởng của cây ngô, các tia sáng ngắn lại thúc đẩy sự phát triển Nghiên cứu của Cuperman đã xác

định thời gian chiếu sáng và chất lượng ánh sáng đã gây ảnh hưởng rất lớn đến sự phát triển của bắp và bông cờ của cây ngô Trong điều kiện chiếu sáng bằng ánh sáng trắng và xanh lam thì sự phát triển của cây diễn ra nhanh nhất Trong điều kiện chiếu sáng bằng ánh sáng đỏ thì sự phát triển của bông cờ hầu như không bị ảnh hưởng nhưng sự hình thành của bắp chậm lại Ánh sáng lục kìm chế sự sinh trưởng

và phát dục của bắp

1.1.3.3 Yêu cầu về nước

Ngô là cây trồng cạn, bộ rễ ngô phát triển rất mạnh, hút nước khỏe và sử dụng tiết kiệm nước Cây ngô sinh trưởng nhanh tạo ra sinh khối lớn Do vậy cây cần một lượng nước rất lớn Trung bình cây ngô trong một chu kỳ sống cần khoảng 200 lít nước để sinh trưởng và phát triển Ở các thời kì sinh trưởng khác nhau cây ngô yêu cầu lượng mưa và lượng nước tưới khác nhau Cây ngô không chịu được úng,

độ ẩm của đất quá cao, lớn hơn 80% có ảnh hưởng xấu đến sinh trưởng phát triển của cây ngô, đặc biệt là từ lúc cây mọc đến khi cây được 8 lá Vào giai đoạn này chỉ

cần ngập nước 1 – 2 ngày cây ngô cũng có thể bị chết úng Ẩm độ thích hợp khoảng

70%.

1.1.3.4 Yêu cầu về đất

Đất rất quan trọng trong sản xuất ngô, đất trồng ngô phải tơi xốp, nhiều mùn, hàm lượng dinh dưỡng cao, dễ thoát nước, tầng canh tác dày, pH từ 6 – 7, thuận lợi cho việc tưới nước vào mùa khô và tiêu nước vào mùa mưa Hầu hết, ngô được trồng

ở trên đất cạn, không ngập nước, đất có thành phần cơ giới nhẹ, đất cát pha, trên các loại đất vụ trước trồng các cây họ đậu, hoặc các cây phân xanh cải tạo đất.

1.1.3.5 Yêu cầu chế độ không khí trong đất

Để thu hoạch sản lượng ngô cao, ngoài việc cung cấp nước và dinh dưỡng còn phải chú ý đến chế độ không khí ở trong đất Chế độ không khí ảnh hưởng gián tiếp thông qua nhiều khâu khác nhau như là vi sinh vật, quá trình biến đổi hóa học trong đất Cây ngô đặc biệt là rễ ngô phát triển tốt trong điều kiện háo khí, nếu đất chặt bí thiếu tơi xốp thì rễ ngô phát triển kém, ăn nông, rễ ngắn ít lông hút, khả năng hút dinh dưỡng

khoáng và nước kém Dẫn đến tình trạng cây ngô thiếu dinh dưỡng sẽ sinh trưởng, phát triển kém

1.1.4 Vai trò các chất dinh dưỡng với cây ngô [17],[21]

1.1.4.1 Vai trò của đạm

Đạm là yếu tố dinh dưỡng quan trọng nhất, đóng vai trò tạo năng suất và chất lượng của ngô, 66% đạm được tích luỹ trong hạt Cây ngô hút đạm tăng dần từ khi cây có 3 – 4 lá tới trước trổ cờ Ở nước ta, một số kết quả nghiên cứu cho thấy thời kỳ hút đạm mạnh nhất là 6 – 12 lá và trước khi trổ cờ, nếu các giai đoạn này mà thiếu đạm thì năng suất giảm rõ rệt.

Triệu chứng thiếu đạm ở ngô: cây thấp, lá nhỏ có màu vàng, các lá già có vệt xém đỏ, cây sinh trưởng chậm, cằn cỗi, cờ ít, bắp nhỏ, năng suất thấp.

1.1.4.2 Vai trò của lân

Lân có vai trò quan trọng với cây ngô tuy nhiên khả năng hút lân ở giai đoạn cây non lại rất yếu Thời kỳ 3 – 4 lá, cây ngô hút không được nhiều lân, đó là thời kỳ khủng hoảng lân của ngô, nếu thiếu lân trong giai đoạn này sẽ làm giảm năng suất nghiêm trọng Cây ngô hút nhiều lân nhất ( khoảng 62% tổng lượng lân yêu cầu) ở thời kỳ 6 – 12 lá sau đó giảm đi ở các thời kỳ sau

Triệu chứng thiếu lân của ngô biểu hiện bằng màu huyết dụ trên bẹ lá và gốc cây, trái cong queo Trường hợp thiếu nặng lá sẽ chuyển vàng và chết Hiện tượng này xảy ra ở lá già trước, sau đó chuyển sang lá non và phổ biến ở ngô vụ đông trong điều kiện thời tiết khắc nghiệt.

1.1.4.3.Vai trò của kali

Kali có vai trò rất quan trọng tới sự sinh trưởng, phát triển và năng suất của ngô Kali tích luỹ nhiều ở thân, lá (khoảng 80%) và tích luỹ trong hạt ít hơn Cây ngô hút kali mạnh ngay từ giai đoạn sinh trưởng ban đầu Từ khi cây mọc tới trổ cờ ngô

đã hút khoảng 70% lượng kali cây cần

Thiếu kali, protein và sắt sẽ tích tụ gây cản trở quá trình vận chuyển chất hữu

cơ Thiếu kali là nguyên nhân rễ ngang phát triển mạnh, rễ ăn sâu kém phát triển, do

đó cây dễ đổ Thiếu kali thể hiện ở các triệu chứng như chuyển nâu và khô dọc theo mép và chóp lá, bắp nhỏ, nhiều hạt lép ở đầu bắp (bắp đuôi chuột) và năng suất thấp 1.1.4.4.Vai trò các nguyên tố vi lượng

Đối với cây ngô, các chất vi lượng thường thiếu là kẽm và molypđen Thiếu kẽm lá có màu trắng (bệnh bạch tạng), giữa các gân lá có những dải màu vàng sáng, các lóng ngắn lại Hiện tượng thiếu kẽm thường xảy ra trên đất kiềm, nghèo mùn, đất giàu lân dễ tiêu hay bón quá nhiều lân Thiếu molypđen lá chuyển xanh nhạt, lá non teo lại và héo, nặng hơn lá ngọn không bung ra được, có nhiều vết xém vàng.

1.1.5.Vai trò cây ngô trong nền kinh tế

Ngô làm lương thực cho con người: Ngô là cây lương thực nuôi sống gần 1/3 dân

số trên toàn thế giới, tất cả các nước trồng ngô nói chung đều ăn ngô ở mức độ khác nhau Toàn thế giới sử dụng 21% sản lượng ngô làm lương thực cho người Các nước ở Trung Mỹ, Nam Á và Châu Phi sử dụng ngô làm lương thực chính Các nước Đông Nam Phi sử dụng 85% sản lượng ngô làm lương thực cho người, Tây Trung Phi 80%, Bắc Phi 42%, Tây Á 27%, Nam Á 75%, Đông Nam Á và Thái Bình Dương 39%, Đông

Á 30%, Trung Mỹ và các vùng Caribe 61% Nếu như ở Châu Âu khẩu phần ăn cơ bản là: bánh mỳ, khoai tây, sữa; Châu Á: cơm (gạo), cá, rau xanh (canh) thì châu Mỹ La Tinh

là bánh ngô, đậu đỗ và ớt Vì vậy, trên phạm vi thế giới, ngô vẫn còn là cây lương thực rất quan trọng, vì ngô rất phong

phú các chất dinh dưỡng hơn lúa mỳ và gạo Ngô làm thức ăn gia súc: Ngô là thức ăn gia súc quan trọng nhất hiện nay Hầu như 70% chất tinh trong thức ăn tổng hợp là từ ngô, điều đó phổ biến trên toàn thế giới Ngoài việc cung cấp chất tinh, cây ngô còn là thức ăn xanh và ủ chua lí tưởng cho đại gia súc Những năm gần đây cây ngô còn là cây thực phẩm, người ta dùng bắp ngô bao tử làm rau cao cấp Sở dĩ, ngô rau được dùng vì nó sạch và có hàm lượng dinh dưỡng cao Các thể loại ngô nếp, ngô đường (ngô ngọt) được dùng làm thức ăn tươi (luộc, nướng) hoặc đóng hộp làm thực phẩm xuất khẩu Ngô là nguyên liệu chính cho các nhà máy thức ăn gia súc tổng hợp, ngô còn là nguyên liệu cho các nhà máy sản xuất rượu, tinh bột, bánh kẹo… Người ta đã sản xuất ra các mặt hàng khác nhau cho các ngành công nghiệp lương thực - thực phẩm, công nghiệp dược và

công nghiệp nhẹ Ngô cũng là hàng hoá xuất khẩu Hàng năm lượng ngô xuất khẩu khoảng 70 triệu tấn Đó là nguồn lợi lớn của các nước xuất khẩu Các nước

xuất khẩu chính là Mỹ, Pháp, Argentina, Trung Quốc, Thái Lan Các nước nhập chính là Nhật Bản, Hàn Quốc, Liên Xô cũ, Châu Phi, Mexico… [9] Ngô vừa là cây lương thực, vừa là cây thức ăn cho gia súc Chính vì vậy diện tích trồng ngô trên thế giới tăng không ngừng Năm 1979 diện tích trồng ngô chỉ đạt khoảng 127 triệu ha với tổng sản lượng là 475,4 triệu tấn, đến năm 2007 diện tích trồng ngô đạt 145,1 triệu ha với sản lượng 705,3 triệu tấn (theo số liệu thống kê của FAO, 2008) Ở Việt Nam, cây ngô đã được trồng cách đây khoảng 300 năm và được trồng trên những điều kiện sinh thái khác nhau của cả nước ĐăkLak là vùng có sản lượng bắp cao nhất nước đạt 622 nghìn tấn, kế đến là Sơn

La, Đồng Nai với sản lượng lần lượt là 506 và 305,3 nghìn tấn mỗi năm.

Nguồn: www.asiacreative.vn

Biểu đồ: 1.1 Sản lượng bắp của Việt Nam 2013

Hàm lượng chất dinh dưỡng của ngô tùy thuộc vào từng giống, đặc biệt là các giống ngô nếp địa phương tuy năng suất không cao nhưng chất lượng của hạt ngô tốt phù hợp với thị hiếu của người tiêu dùng.

1.2 Tổng quan về vi khuẩn cố định Nitơ (N )

1.2.1 Nitơ và quá trình cố định nitơ

Nitơ phân tử được cấu tạo từ 2 nguyên tử nitơ liên kết với nhau bằng liên kết III bền vững N ≡ N Nitơ trong khí quyển tồn tại dưới dạng khí N2 và chiếm khoảng 79% thể tích không khí Mặc dù sống trong "đại dương nitơ" nhưng thực vật nói chung không

có khả năng đồng hóa trực tiếp được N2 là phân tử rất khó phản ứng với các phân tử

khác để tạo thành hợp chất Liên kết N ≡ N có năng lượng liên kết rất lớn nên muốn xảy

ra phản ứng giữa N2 với các nguyên tố khác thành các hợp chất vô cơ, trong kỹ thuật người ta phải dùng lượng năng lượng rất cao Trong khi đó nhóm vi khuẩn cố định nitơ

có thể biến khí nitơ thành hợp chất đạm ở các điều kiện bình thường về nhiệt độ và áp suất Vậy cơ chế cố định của nó là như thế nào Đó là điều các nhà khoa học nghiên cứu trong lĩnh vực này hết sức quan tâm Từ trước tới nay có rất nhiều giả thiết về cơ chế của quá trình cố định đạm sinh học.

Đa số nhà nghiên cứu đều thống nhất cho rằng: Quá trình cố định nitơ sinh học là một quá trình khử N2 thành NH3 dưới tác dụng của enzyme Nitrogenaza sinh ra bởi vi sinh vật bằng phương trình:

Năm 1961 - 1962, người ta đã tách từ Clostridium pasteurrianum hai tiểu

phần hoạt hóa H2 và N2 Sau này người ta tìm thấy ở Azotobacter có các tiểu phần, 1

phần gồm protein và Fe, 1 thành phần gồm protein, Fe, Mo.

Nguồn H2 để khử N2 có thể là hydro phân tử (H2) Trong trường hợp này thì dưới tác dụng của enzyme hydrogenase, điện tử được chuyền theo hệ thống.

Nguồn cho điện tử và hydro là acid pyruvic Đáng chú ý là trong quá trình chuyền điện tử có sự tham gia tích cực của feredocine (Fd) Fd là cầu nối giữa 2 hệ enzyme hydrogenase và nitrogenase để cố định N2.

Sự cố định N2 của vi khuẩn nốt sần có thể xảy ra theo sơ đồ phức tạp hơn Trong các nốt sần có một chất có bản chất hem rất giống với hemoglobin trong máu gọi là leghemoglobin Nó dễ liên kết với O2 để biến thành oxyhemoglobin Leghemoglobin chỉ được tạo nên khi vi khuẩn sống cộng sinh với cây bộ đậu, còn khi nuôi cấy tinh khiết các Rhizobium sẽ không tạo leghemoglobin và không cố định được N2.

Mối quan hệ giữa thực vật và vi khuẩn trong quá trình cố định nitơ cộng sinh có thể biểu diễn bởi sơ đồ sau:

1.2.2 Vi khuẩn cố định N

Vi sinh vật cố định N có một vai trò quan trọng trong chu trình tuần hoàn N2 và cung cấp một lượng N đáng kể cho cây trồng Theo tính toán của các nhà khoa học, các nhóm vi sinh vật cố định đạm BNF (Biological nitrogen fixation) có thể cung cấp tới 240

x 106 tấn N/năm trên cả hành tinh, gấp 6 lần lượng N mà cả thế giới sản xuất bằng con đường hóa học.

Vi sinh vật cố định N là các nhóm vi sinh vật có khả năng chuyển hóa khí N2 dồi dào trong không khí (79%) thành dạng NH4+ cung cấp cho cây Vi khuẩn cố định N gồm

có hai nhóm lớn:[7].

- Vi khuẩn cố định N tự do gồm:

+ Vi khuẩn cố định N tự do hiếu khí: Azotobacter và Beijerinskia sp.

+ Vi khuẩn cố định N kỵ khí: Vi khuẩn thuộc nhóm Clostridium.

- Vi khuẩn cố định N cộng sinh như cộng sinh với rễ cây họ đậu Rhizobium, cộng sinh với rễ lúa Azoarcus,

- Azotobacter sp

Là vi khuẩn gram âm, không sinh bào tử có khả năng cố định N tự do Khi chưa trưởng thành tế bào thường có hình que, sinh sản bằng cách phân cắt, di chuyển nhờ tiêm mao Khi trưởng thành mất khả năng di chuyển, kích thước thu nhỏ thành dạng cầu được bao bọc bởi một lớp nhầy.

Khuẩn lạc của Azotobacter có dạng cầu lồi, nhẵn bóng, có khi nhăn nheo Các

nòi phân lập từ tự nhiên có khả năng cố định 10 - 15mg N khi tiêu thụ hết 1g dinh dưỡng Carbon Một số nòi tuyển chọn có khả năng cố định tới 30mg/1g dinh dưỡng Carbon.

Trong đất, Azotobacter tập trung ở vùng đất xung quanh rễ cây Ngoài khả năng

cung cấp dinh dưỡng N cho cây nó còn có khả năng kích thích nảy mầm, kích thích sinh

trưởng Trong đất, Azotobacter thường phổ biến các nòi sau:

+ Azotobacter chrococum: Kích thước tế bào 2,0 x 3,1 micromet, có khả năng di

động khi còn non Khi già hình thành nang xác Khuẩn lạc có màu nâu

hoặc đen khi về già, không khuếch tán ra môi trường.

+ Azotobacter beijerinckii: Có kích thước 2,4 x 4,6 micromet Không có khả

năng di động và hình thành nang xác Khuẩn lạc khi già có màu nâu sáng, sắc tố không khuếch tán ra môi trưòng nuôi cấy.

+ Azotobacter vinelandii: Tế bào có kích thước 1,5 x 3,4 micromet, có khả năng

di động và hình thành nang xác Khuẩn lạc màu lục huỳnh quang, sắc tố khuếch tán vào môi trường.

+ Azotobacter agilis: Tế bào có kích thước 2,8 x 3,3 micromet, có khả năng di

động, không hình thành nang xác, khuẩn lạc màu vàng lục huỳnh quang, sắc tố khuếch tán vào môi trường [7].

1.2.2.3 Vi khuẩn cố định N tự do kỵ khí Clostridium

Clostridium được phát hiện lần đầu tiên bởi Vinogradxki (1893) Vi khuẩn Clostridium có kích thước 2,5 – 7,5 x 0,7 – 1,3 micromet, có thể đứng riêng rẽ hoặc kẹp

đôi thành chuỗi ngắn Bào tử hình bầu dục, có khả năng chịu được nhiệt độ cao và khô

hạn Clostridium có khả năng tích lũy được 10 - 15mg N phân tử khi đồng hóa hết 1g

đường Carbon [7].

1.2.3 Vi khuẩn cố định N cộng sinh

1.2.3.1 Các vi khuẩn sống cộng sinh với cây họ Đậu

Vi khuẩn cố định N cộng sinh với cây họ đậu còn gọi là vi khuẩn nốt sần Chúng hình thành các nốt sần với rễ cây họ đậu như cây đậu tương, lạc, điền thanh, muồng, cốt khí, trinh nữ, chúng sử dụng dinh dưỡng carbon của cây và cố định N không khí để sử dụng và cung cấp một phần cho cây chủ

Gồm có: Rhizobium, Bradyrhizobium, Azorhizobium và Sinorhizobium[11].

- Rhizobium

Năm 1868, nhà khoa học Hà Lan M.W.Beijrinck đã phân lập được loài vi khuẩn sống cộng sinh trong nốt sần ở rễ một cây thuộc bộ đậu, ông đã đặt tên là

Basilusradicicola.

Năm 1889, vi khuẩn này được xếp vào chi Rhizobium ( B.Frank, 1989) Trên

môi trường đặc, chúng có khuẩn lạc trơn bóng, nhầy, khi còn non có khả năng di động nhờ tiêm mao, khi tế bào già trở nên bất động.

Rhizobium thuộc loại hảo khí ưa pH trung tính hoặc kiềm ( pH từ 6,5 - 7,5), nhiệt

độ thích hợp 24 – 260C Chúng xâm nhiễm vào rễ cây bộ đậu thông qua lông hút, đôi khi qua vết thương ở vỏ rễ Dưới ảnh hưởng của vi khuẩn, rễ tiết ra enzyme polyalacturonase phân huỷ thành lông hút tạo điều kiện cho vi khuẩn xâm nhập vào rễ Theo tính toán của các nhà khoa học nhóm vi khuẩn này có khả năng cung cấp cho cây 80 -120kg N/ ha.

- Bradyrhizobium

Vi khuẩn hình que, kích thước trung bình 0,5 - 0,9 x 1,2 - 3,0 µm, thường chứa chất dự trữ PHB Trên môi trường đặc, khuẩn lạc của chúng có dạng trơn, bóng, nhầy, không màu.

Bradyrhizobium là vi khuẩn hiếu khí, tuy nhiên chúng có thể phát triển được

ngay trong trường hợp chỉ có một áp lực oxy rất thấp khoảng 0,001atm Chúng phát triển thích hợp ở pH= 6,5 - 7,5 Nhiệt độ phát triển thích hợp là 24 – 260C, nhiệt độ 370C sự phát triển của chúng bị cản trở một cách rõ rệt.

- Azorhizobium

Azorhizobium Là một giống mới được đề nghị với một loài là Azorhizobium caulinodans chính là các vi khuẩn cộng sinh ở rễ và thân của Sesbania rostrata

- Sinorhizobium

Gồm các vi khuẩn phát triển nhanh, cộng sinh ở nốt rễ cây đậu nành được phân

lập từ Trung Quốc Giống Sinorhizobium gồm có 2 loài là Sinorhizobium fredii và

Sinorhizobium xinjiangensis

1.2.3.2 Các vi khuẩn sống cộng sinh với cây không thuộc họ đậu

- Vi khuẩn lam (Cyanobacteria): Một số vi khuẩn lam tự dưỡng đạm hay thanh

tảo sống chung với nhiều vi sinh vật chân hạch, từ các loại nấm cho đến các thực vật hạt kín [7].

- Azospirillum

Phát hiện năm 1974, là vi khuẩn Gram âm có dạng xoắn, sống tự do, đường kính 1µm, dài 2,1 - 3,8µm chuyển động trong môi trường lỏng bởi một tiêm mao dài ở đầu ( polan flagellum), trong môi trường đặc ở 300C nhiều tiêm mao bên (lateral flagellum) ngắn hơn cũng được thành lập

Trong những năm gần đây người ta phát hiện nhiều nhóm vi khuẩn này sống ở trong vùng rễ, trong rễ cây, thân cây và lá các cây không thuộc họ đậu như lúa, bắp, mía, sorghum, và một số loại cỏ.

Azospirillum giúp tăng năng suất lúa từ 32 - 81% ở điều kiện nhà lưới (Mirza và

ctv, 2000; Malik và ctv, 2002) Nhưng ở điều kiện ngoài đồng vi khuẩn nầy chỉ làm tăng năng suất lúa được 10 - 30% [11].

Azospirillum tăng sinh ở cả trong điều kiện hiếu khí và kỵ khí với sự hiện diện

hoặc không có hợp chất nitơ trong môi trường, nhưng thích hợp là vi hiếu khí Nhiệt độ tối hảo từ 35 - 370C Một số dòng Azospirillum là những vi sinh vật tự dưỡng không bắt buộc Vi khuẩn Azospirillum phát triển tốt trên muối của những acid hữu cơ như malate,

succinate, hay pyruvate Fructore và những đường đôi khác cũng có thể được vi khuẩn

sử dụng như là nguồn carbon Một số dòng Azospirillum cần biotin cho sự phát triển của

chúng [7], [11].

Ngoài khả năng cố định nitơ chúng còn có khả năng khử nitrat, chống lại vi

khuẩn gây bệnh thối lá ở cây dâu tằm Theo Eckert (2001) chi Azospirillum có 7 loài là:

A brasilense; A lipoferum ; A amazonense; A irakense; A halopraeferens; A largimobile và A doebereineae [35].

Một số báo cáo gần đây cho thấy vi khuẩn này có thể tiết ra những kích thích tố tăng trưởng như: IAA (Indole - 3 - acetic acid), IBA (Indole - 3 - butyric acid), ABA (abscisic acid) và cytokynins Những kích thích tố đó làm tăng chiều dài rễ, tăng thể tích

rễ và số lượng rễ Từ đó, chúng làm tăng khả năng hấp thu khoáng chất và nước, tăng khả năng sinh trưởng và phát triển cũng như tăng năng suất của cây Ngoài ra, chúng còn giúp cho cây chống chịu được điều kiện khô hạn

- Gluconacetobacter diazotrophicus [11].

Năm 1988, được Cavalcante V A và Dobereiner J phân lập lần đầu tiên từ rễ và thân cây mía trồng ở nhiều khu vực khác nhau trên khắp Brazil.

G diazotrophicus là vi khuẩn Gram âm; ưa acid; vi hiếu khí bắt buộc; tế bào

dạng que thẳng tròn đầu ( 0,7 - 0,9µm đến khoảng 1 - 2µm) tồn tại ở dạng đơn, đôi hoặc chuỗi mà không có nội bào tử; sử dụng đường (glucose, fructose, sucrose…) ở nồng độ khác nhau làm nguồn C nhưng tăng trưởng tốt nhất là ở nồng độ sucrose 10% và pH = 5,5

G diazotrophicus có khả năng cố định đạm và sản xuất ra hormone thực vật

( auxin, gibberellin), có thể hoà tan Zn và phosphorus nên G diazotrophicus được xem

là một loài vi khuẩn đầy hứa hẹn, với khả năng cung cấp gần một nửa nitơ cố định được

ở dạng hữu ích cho cây [11]

- Herbaspirillum [11].

Herbaspirillum là các vi khuẩn hình que, Gram âm, rộng khoảng 0,5 - 0,6µm.

Chúng sinh trưởng tốt trong môi trường có dicarboxylic và tổng hợp nitơ trong một

khoảng pH biến thiên từ 5,3 - 8 Trong môi trường bán đặc vi khuẩn Herbaspirillum tạo

thành một lớp màng mỏng, trắng, mịn ( pellicle) Khi cấy chuyển lên môi trường đặc Nfb thì lớp màng này phát triển thành khuẩn lạc nhỏ, ẩm, ánh xanh và trên môi trường đặc BMS thu được khuẩn lạc màu trắng sữa.

Herbaspirillum có khả năng cố định đạm cộng sinh trong mô của những cây thân

cỏ như: Lúa, bắp, mía, sorghum, chuối và khóm Ngoài ra chúng còn tạo ra những sản phẩm của phytohormones như auxins và gibberillins rất tốt cho sự tăng trưởng của cây.

- Burkholderia [11].

Vi khuẩn Burkholderia thuộc vi khuẩn Gram âm, có hình dạng hình que, đường

kính khoảng 1µm, chúng có thể di chuyển nhờ các chiên mao ở đầu (Jesús et al, 2004).

Burkholderia sinh trưởng và phát triển trong điều kiện kỵ khí hoặc hiếu khí, nhưng trong

môi trường ít khí oxy thì phát triển tốt nhất, chúng phát triển sâu trong môi trường nuôi cấy từ 1 - 4mm (Paulina et al, 2001) Trong môi trường nuôi cấy chúng tạo thành các khuẩn lạc màu trắng hoặc hơi vàng, đường kính khoảng 2 - 4mm, tròn, phẳng hoặc dài

(Jesús et al, 2004) Burkholderia sống cộng sinh với cây trồng và có khả năng cố định

đạm.Ví dụ như khi các vi khuẩn Burkholderia sống cộng sinh với cây luá sẽ cố định

đạm khoảng 19% tổng lượng đạm cần thiết cho nhu cầu của cây lúa Năng suất của cây

lúa có chủng loài Burkholderia vietnamiensis tương đương với năng suất của cây lúa không chủng loài Burkholderia vietnamiensis nhưng có bón phân đạm 25 - 30kg/ha

(Van et al, 2000).

Burkholderia vietnamiensis, Burkholderia kuruiensis

Vi khuẩn Burkholderia vietnamiensis và Burkholderia kuruiensis có dạng que

ngắn, một số có dạng que dài và tất cả đều có khả năng chuyển động nhờ chiêm mao (Lương Thị Phương Thảo, 2010) Những đặc điểm trên cũng là những đặc điểm nổi bật

của hình dạng Pseudomonas cố định đạm Đa số các dòng Burkholderia có khuẩn lạc

màu trắng đục, dạng tròn, có độ nổi mô, bìa nguyên, một số khuẩn lạc có màu vàng, bìa răng cưa, kích thước khuẩn lạc từ 0.5–1.5 mm (Nguyển Thị Minh Thư, 2010)

Burkholderia vietnamiensis được tìm thấy ở rễ bắp, lúa và cà phê (Estrada et al., 2001).

Loài Burkholderia vietnamiensis được tìm thấy ở rễ cây lúa trồng ở miền nam Việt Nam, thí nghiệm ở cây lúa chủng Burkholderia vietnamiensis sau 14 ngày chúng giúp

tăng khả năng đâm chồi 33%, rễ tăng 57% diện tích lá tăng 30% năng xuất lúa tăng

13-22% (La Nguyễn Tường Vi, 2010) Tiến hành chủng vi khuẩn Herpaspirillum

seropedicae và giống vi khuẩn Burkholderia vào cây lúa, kết quả cho thấy vi khuẩn có

khả năng cố định đạm khoảng 19% tổng số đạm cần thiết cho cây (Vera et al., 2000)

Burkholderia cenocepacia

Burkholderia cenocepacia là một trong 9 loài của các phức Burkholderia cepacia đã được đánh và khẳng định là một trong số những vi sinh vật đa năng trao đổi

chất được biết đến nhiều nhất, đang phát triển trên hơn 200 hợp chất hữu cơ, sửa chữa N2

và mang nhiều kháng sinh Những ngiên cứu khảo sát khả năng cố định đạm của

Burkholderia cho thấy khi chúng sống cộng sinh trong cây bắp trồng ở Mexico cố định

đạm tốt như ở cây mía trồng ở Brazil và Nam Phi (Reis et al., 2004).

Pseudomonas[11],[22],[34],[35],[36]

Pseudomonas là một chi lớn có nhiều ứng dụng trong thực tiễn sản xuất nông

nghiệp Trong vô số các ứng dụng đó thì khả năng cố định đạm của giống Pseudomonas

đã được khẳng định từ năm 1994 (Chan et al.,1994) Cố định đạm sinh học trên làm tăng đạm tổng số lên 20 - 25% (Dobereiner, 1992).[32]

Theo nghiên cứu của Kapoor khi phối hợp chủng Azotobacter sp với các chủng

phân giải phosphat như Bacillus sp, Pseudomonas sp Thí nghiệm làm tăng năng suất

lúa, bông vải lên 10-20% [32]

Sandhya V và cộng sự đã phân lập được Pseudomonas entomophila trên các loại

cây trồng tại các vùng đất khô cằn ở Ấn Độ qua nghiên cứu khảo nghiệm thì chủng này

có khả năng sản xuất các phytohormon (IAA, GA, cytokinin), phân giải Phosphat khó tan ngoài ra chúng còn có tiềm năng lớn trong việc nghiên cứu kiểm soát sinh học để tạo

ra thuốc trừ sâu sinh học hiệu quả mà không gây ảnh hưởng đến môi trường [40].

1.3 Tình hình nghiên cứu ngoài nuớc.

Năm 1986 phân bón vi sinh do Noble Hiltner sản xuất đầu tiên tại Đức được đặt

tên là Nitragen, đây là loại phân được chế tạo bởi vi khuẩn Rhizolium do Bijerink phân

lập năm 1988 Từ đó đến nay đã có rất nhiều công trình nghiên cứu nhằm ứng dụng và

mở rộng việc sản xuất các loại phân bón vi sinh vật cố định N2 mà thành phần còn được

bổ sung phối hợp thêm một số chủng vi sinh vật có ích khác ví dụ như xạ khuẩn cố định

N sống tự do Frankia spp, các vi khuẩn cố định N sống tự do Clostridium, Pasterium,

Beijerinkiaindica

Hiệu quả của việc nhiễm chế phẩm Azotobacter sp cho đất và hạt giống, cây con

đã được chứng minh trên các thí nghiệm đồng ruộng Theo nghiên cứu của Puneet

(1998) cho thấy việc nhiễm Azotobacter sp kích thích nẩy mầm của hạt, kích thích ra rễ

và sinh trưởng, năng suất lúa mì, ngô tăng 10-15% so với đối chứng [30].

Tổng kết các kết quả nghiên cứu của Nhật Bản, Hoa Kỳ, Trung Quốc, Ấn Độ cho

thấy sử dụng chế phẩm Azotobacter có thể cung cấp cho cây trồng từ 30-60 kg

N/ha/năm và tổng lượng N do vi sinh vật tổng hợp trên hành tinh có thể đạt đến 240 triệu

tấn/năm Vi khuẩn cố định N tự do Azotobacter còn có khả năng tổng hợp B1,

giberellin, cytokinin kích thích tăng trưởng cây trồng [33].

Fulchieri (1993) nghiên cứu sử dụng 3 chủng Azospirillum để xử lý hạt cho ngô.

Kết quả cho thấy đã làm tăng chiều cao cây, tăng sinh khối và tăng năng suất ngô lên 59% so với đối chứng, các chủng này có thể cung cấp khoảng 60 kg N/ha [35].

Nghiên cứu của Puneet (1998) cũng cho thấy nếu bón phối hợp Azotobacter sp với các chủng phân giải P như Aspergillus niger sẽ làm tăng năng suất lúa mì tăng 17,7%, trong khi Azotobacter chỉ tăng 9% Kapoor cũng cho kết quả tương tự khi phối hợp chủng Azotobacter sp với các chủng phân giải phosphat như Bacillus sp,

Pseudomonas sp Thí nghiệm làm tăng năng suất lúa, bông vải lên 10-20% [35]

El-Komy (2005) nghiên cứu phối hợp hai chủng cố định N Azospirillum và phân giải lân Bacillus megaterium xử lý cho lúa mì Kết quả cho thấy hàm lượng N trong thân

lúa mì của các thí nghiệm có xử lý hai chủng này tăng 37-53%; hàm lượng P trong thân tăng 48,6%; hàm lượng K tăng 10-14,3% so với đối chứng không xử lý Kết quả nghiên cứu cũng cho thấy xử lý phối hợp hai chủng có tác dụng cộng hưởng, tốt hơn xử lý đơn chủng [34].

Zemrany (2006) nghiên cứu sử dụng chủng A lipoferum cho ngô Kết quả cho

thấy khi sử dụng chủng này đã làm giảm 50% lượng N cho cây mà năng suất ngô vẫn đảm bảo [33].

Abbas Akbari và cộng sự (2007) đã phân lập và tuyển chọn được một số chủng

Azospirillum sp có khả năng sinh tổng hợp IAA kích thích sinh trưởng của cây lúa mì.

Kết quả là sự nhiễm các chủng Azospirillum ssp đã làm tăng đường kính gốc lúa, chiều

dài rễ, trọng lượng khô và số lượng lông rễ so với đối chứng [27].

Elazar Fallik and Yaacov Okon ( 1996) nghiên cứu sử dụng Azospirillum

brasilense kết hợp với than bùn cho Setaria italica và ngô Kết quả cho thấy chiều dài

thân, trọng lượng khô, năng suất tăng đáng kể Sinh khối vi khuẩn là 108 CFU/1g than bùn có hiệu quả gây nhiễm hạt giống cao nhất [24].

Fabricio Cassa´n và cộng sự ( 2009) đã nghiên cứu phối hợp hai chủng

Azospirillum brasilense Az39 và Bradyrhizobium japonicum E109 xử lí cho ngô và đậu

tương Kết quả cho thấy xử lí phối hợp hai chủng cho hiệu quả cao hơn so với xử lí đơn chủng Tỉ lệ nảy mầm, chiều cao cây, chiều dài rễ, trong lượng khô đều tăng so với đối chứng [25].

Andres D Naiman và cộng sự ( 2009) đã nghiên cứu xử lý gây nhiễm vi khuẩn

Azospirillum brasilense và Pseudomonas fluorescens cho lúa mì Kết quả cho thấy chiều

cao cây tăng 12%, đường kính gốc thân tăng 40%, năng suất tăng 16% [23 ].

1.4 Nghiên cứu trong nước

Ở Việt Nam, phân vi sinh vật cố định đạm ở cây họ đậu và phân vi sinh vật phân giải lân đã được nghiên cứu từ năm 1960 Đến năm 1987, phân Nitragin trên nền đất mang than bùn mới được hoàn thiện Đến 1991 đã có hơn 10 đơn vị trong cả nước tập trung nghiên cứu phân vi sinh vật Các nhà khoa học đã phân lập được nhiều chủng vi sinh vật cố định đạm và một số vi sinh vật phân giải lân.

Nhằm mục tiêu phát triển nông nghiệp sinh thái bền vững và ứng dụng CNSH vào nông nghiệp, trong những năm gần đây Việt Nam có khá nhiều nghiên cứu về

Azotobacter và Azospirillum và các vi khuẩn nội sinh có khả năng cố định đạm khác

làm phân sinh học

Phạm Bích Hiên và cộng sự ( 2003) đã nghiên cứu 10 chủng Azotobacter của

Việt Nam và nhận thấy rằng ngoài khả năng cố định N chúng còn có khả năng sinh tổng hợp chất kích thích sinh trưởng IAA Nhiệt độ thích hợp của các chủng này là 25-300C,

pH thích nghi rộng từ 5,5- 8,0 [10]

Nguyễn Hữu Hiệp, Renato đã phân lập các dòng vi khuẩn nội sinh để sản xuất phân vi sinh ở quy mô phòng thí nghiệm cho cây mía trồng tại tỉnh Sóc Trăng” Cao Ngọc Điệp, Nguyễn Văn Mít cũng nghiên cứu hiệu quả phân vi khuẩn

Gluconacetorbacter diazotrophycus và vi khuẩn Pseudomonas stusderi trên năng suất

và trữ lượng đường trên cây mía (Saccharum officinarumL.) trồng trên đất phù sa tỉnh

Hậu Giang” Trần Thanh Phong (2012) cũng nghiên cứu đánh giá khả năng cố định đạm của vi khuẩn nội sinh đến năng suất và chất lượng của trái khóm trồng tại Huyện Tân Phước, Tỉnh Tiền Giang” [12].

Phạm Ngọc Lan (1999) đã phân lập được 37 chủng Azotobacter trên đất gò đồi

vùng Thừa Thiên - Huế Nhóm nghiên cứu cũng tuyển chọn được hai chủng có khả năng kháng kháng sinh, tồn tại được ở pH kiềm ( pH = 8) Kết quả thử nghiệm gây nhiễm cây giống keo tai tượng trong vườn ươm đã làm tăng tỷ lệ sống, sinh khối, chiều cao cây và hàm lượng N trong lá cũng cao hơn so với đối chứng [14]

Nguyễn Thị Phương Chi (1999) nghiên cứu bón thử nghiệm chủng cố định N tự

do Azotobacter và chủng phân giải phosphate Archomobacter, Pseudomonas

aeruginosa Kết quả cho thấy chế phẩm sinh học làm tăng sinh trưởng chiều cao mạ 7,47

- 16,93% và năng suất lúa tăng từ 13,39 – 55,85% [3]

Lâm Minh Tú, Trần Văn Tuân (2003) nghiên cứu sản xuất một số phân bón đơn

chủng, đa chủng cho cây trồng Các chủng sử dụng trong nghiên cứu là Azotobacter

bejerinski, Azotobacter vinelandii, Bacillus subtilis, Bacillus polymyxa Thử nghiệm trên

khoai tây làm tăng năng suất từ 100 - 300% so với đối chứng [19]

Phạm Văn Toản (2003) sử dụng phân bón sinh học giảm được 20% phân bón vô

cơ N, P, K nhưng năng suất khoai tây vẫn tăng so với đối chứng 15-50%, cà chua tăng 12-34%, lạc tăng 30% và giảm đáng kể bệnh héo xanh [18].

Nguyễn Ngọc Dũng, Hồ Thị Kim Anh (1999) nghiên cứu ảnh hưởng của các chủng cố định N trong rễ lúa đến sinh trưởng của mầm lúa CR 203 Nhóm tác giả đã phân lập được 78 chủng cộng sinh với rễ lúa Các chủng này có đặc điểm của chi

Azospirillum Các chủng này kích thích sự nảy mầm và rễ của lúa CR 203 [1].

Lăng Ngọc Dậu (2004) đã nghiên cứu khả năng tạo IAA của vi khuẩn

Azospirillum lipoferum, tiến hành nuôi cấy chủng vi khuẩn này trên môi trường Nfb có

bổ sung Tryptophan, theo dõi tại những thời điểm khác nhau Kết quả cho thấy tại thời điểm 10 ngày sau khi cấy ủ khả năng tao IAA cao nhất [4].

Ngô Thanh Phong, Cao Ngọc Diệp (2012) đã nghiên cứu xác định mức độ cố

định đạm sinh học của Burkholderia sp KG1 và Pseudomonas sp BT1 trên cây lúa cao

sản OM2517 trồng ngoài đồng Kết quả 2 chủng này có thể thay thế 25 - 50% N cho năng xuất cao hơn đối chứng khi bón 100%N mà không nhiễm vi khuẩn.

Nguyễn Anh Dũng và cộng sự (2010), đã phân và xác định mức độ cố định đạm sinh học của Azospirillum trên cây ngô trong bầu đất tại Đăk Nông Kết quả chủng này

có thể thay thế 25 – 50% N cho năng xuất cao hơn đối chứng khi bón 100%N mà không nhiễm vi khuẩn [6]

PHẦN II NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Nội dung nghiên cứu

Để đạt được mục tiêu của đề tài chúng tôi tiến hành nghiên cứu các nội dung sau: Phân lập, mô tả đặc điểm sinh học và định danh bằng sinh học phân tử một số

chủng vi khuẩn cố định đạm cộng sinh trong rễ cây ngô.

Tuyển chọn các chủng vi khuẩn nội sinh có khả năng cố định đạm bằng nghiên cứu thử nghiệm trên cây ngô.

Nghiên cứu xây dựng quy trình nhân sinh khối của các chủng vi khuẩn nội sinh được tuyển chọn.

2.2 Vật liệu và địa điểm nghiên cứu

2.2.1 Vật liệu và thiết bị nghiên cứu

* Vật liệu:

- Các chủng vi khuẩn cố định đạm nội sinh được phân lập từ rễ cây ngô trong giai đoạn trổ cờ tại huyện Ea Súp, Buôn Ma Thuột, Krông Năng thuộc tỉnh Đăk Lăk.

Giống ngô lai Giống DK888 là một giống lai đơn do tập đoàn Charoen

-Pokphand của Thái Lan sản xuất.

* Hóa chất: Acid Malic, KH2PO4, Na2MoO4, CuSO4, ZnSO4, Saccarose, Agar, Biotin, Pyridoxine

* Thiết bị nghiên cứu: Đĩa petri, micropipette, que cấy, box cấy vô trùng, máy quang phổ spectrophotometer Plus 100 (Nhật Bản), máy ủ nhiệt, nồi hấp khử trùng, PCR C1000 (Biorad, Mỹ); GelDoc (Biorad, Mỹ); Điện di Biorad (Mỹ).

2.2.2 Địa điểm nghiên cứu.

- Địa điểm thu mẫu: Được thực hiện tại các huyện Ea Súp, Krông Năng, Krông Păk thuộc tỉnh Đăk Lăk

- Địa điểm thí nghiệm: Được thực hiện tại viện CNSH & MT, Trường Đại học Tây Nguyên.

- Địa điểm thực nghiệm: Tại xã Ea Rôk – Huyện Ea Súp – Tỉnh Đăk Lăk

2.2.3 Thời gian nghiên cứu.

Đề tài thực hiện từ tháng 08/2012 tới tháng 08/2013.

2.3 Phương pháp nghiên cứu.

2.3.1 Phương pháp thu mẫu.

Thu thập một cách ngẫu nhiên rễ cây ngô trong giai đoạn trổ cờ thuộc các giống khác nhau, trên các nền đất khác nhau, mỗi ruộng lấy 5 cây (4 cây ở 4 góc và 1 cây ở giữa ruộng) tại các huyện Ea Súp, Krông Năng, thành phố BMT tỉnh Đăk Lăk

Toàn bộ bộ rễ được đựng trong túi nilon đã khử trùng Các mẫu sau khi lấy được ghi nhãn nơi lấy, ngày lấy và người thu mẫu Mẫu rễ cây ngô sau khi thu được đem tới phòng thí nghiệm, rửa thật sạch đất bám ở rễ dưới vòi nước chảy, để ráo tự nhiên, để riêng từng mẫu rồi tiến hành phân lập hoặc bọc riêng từng mẫu trong túi nilon đã khử trùng buộc chặt và bảo quản trong tủ lạnh (50C) nếu chưa phân lập ngay [7], [20].

2.3.2 Phương pháp phân lập

Cắt rễ thành những khúc nhỏ 2 - 3cm Các mẫu rễ được để riêng trong các bình tam giác tiến hành khử trùng bề mặt Rễ được khử trùng bằng dung dịch chloromine 1% trong 30 phút, tiếp tục khử trùng bằng cồn 700 5 phút, H2O2 3 phút rồi rửa thật sạch bằng nước cất vô trùng (6 lần) Sau đó lấy khoảng 2g mẫu cho vào cối giã nhuyễn rồi thêm 0,5 - 2ml nước cất vô trùng vào cối, để yên 10 phút và hút lấy phần trong cho vào eppendorf, để yên 10 phút cho dịch mẫu lắng xuống và lấy phần nước trong để tiến hành phân lập Lấy 0,5ml dịch nghiền rễ cho vào ống nghiệm chứa 5ml môi trường NFb bán đặc (không đạm) Ủ ở nhiệt độ 320C trong vòng 4 - 5 ngày, mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần.

Quan sát những ống nghiệm có vòng đậm (vòng pellicle), cách bề mặt môi trường 2 – 5 mm chỉ thị có sự hiện diện của vi khuẩn cố định đạm nội sinh Chuyển vi khuẩn từ môi trường bán đặc sang môi trường đặc tiến hành làm thuần giống [20].

Làm thuần giống: Cấy ria các khuẩn lạc được lựa chọn lên các đĩa petri chứa môi trường Nfb đặc để thu khuẩn lạc đơn Quá trình làm thuần được tiến hành 2 - 3 lần.

Chọn khuẩn lạc đơn đã được làm thuần cấy chuyền vào ống thạch nghiêng để giữ giống [6],[7],[20].

* Môi trường Nfb không đạm: [6], [32].

- 2ml dung dịch vi lượng (200mg Na2MoO4 .2H2O, 235mg MnSO4.H2O, 280 mg

H3BO3, 8 mg CuSO4.5H2O, 24 mg ZnSO4.7H2O hòa tan trong 200 ml nước cất).

- Agar: 1,75 g/ lít

- 2ml Bromthymol blue 0,5%

- Thêm nước cất vừa đủ 1 lít.

- pH điều chỉnh đến 6,8.

* Môi trường đặc có chứa 15g/lít agar (Dobreigner, 1995)

2.3.3 Phương pháp mô tả đặc điểm hình thái, đặc điểm sinh học của các chủng vi khuẩn cố định đạm nội sinh.

Mô tả các đặc điểm hình thái của các chủng dưới kính hiển vi, xác định đặc điểm sinh học và định danh theo khoá phân loại của Bergey 1994

2.3.3.1 Phương pháp nhuộm gram.

Nhuộm gram bằng bộ kit nhuộm: Crystol Violet, Lugol, ethanol 95%, dung dịch safanin 0,5%, nước cất.

2.3.3.2 Phương pháp đo kích thước tế bào vi khuẩn.

Kích thước vi khuẩn được đo trên kính hiển vi điện tử có thị kính 10, vật kính 40.

Quan sát vào kính hiển vi ta thấy có 5 khoảng chia của thước đo vật kính (tức 50 m) nằm gọn vào 20 khoảng chia của thước đo thị kính, vậy mỗi khoảng chia của thước đo thị kính với độ phóng đại đang dùng là 2,5 m.

Tiến hành đo kích thước theo trình tự sau.

+ Bước 1: Đặt tiêu bản có vi sinh vật cần đo lên bàn kính Điều chỉnh bàn kính sao cho thấy rõ tế bào vi sinh vật và thước đo thị kính.

+ Bước 2: Điều chỉnh bàn kính sao cho tế bào vi sinh vật nằm gọn và dọc theo thước đo thị kính.

+ Bước 3: Đếm số khoảng mà tế bào vi sinh vật choán chỗ.

+ Bước 4: Tính kết quả (Ví dụ: Chiều dài tế bào vi khuẩn nằm đúng vào 1 khoảng của thước đo thị kính, tức là (2,5  1 = 2,5 m).

2.3.4 Phương pháp xác định khả năng tạo IAA của các chủng vi khuẩn nội sinh trong rễ cây ngô.

Đánh giá khả năng tạo IAA của các chủng vi khuẩn nội sinh dựa trên nồng độ

IAA có trong dich chiết từ dịch nuôi cấy vi khuẩn Nồng độ IAA có trong dịch chiết càng cao chứng tỏ khả năng tạo IAA của chủng vi khuẩn càng mạnh Nồng độ IAA được xác định bằng phương pháp so màu Salkowski ở bước sóng 530 nm.

* Phương pháp xác định phương trình đường chuẩn của mối tương quan giữa chỉ

số OD530nm và nồng độ IAA.

- Chuẩn bị dung dịch đệm phosphat ( 200ml)

A: KH2PO4 0,136g/100ml nước cất;

B: K2HPO4 0,174g/100ml nước cất;

Lấy 39ml A + 61ml B cho thêm nước cất vừa đủ 200ml, điều chỉnh pH 7.

- Chuẩn bị thuốc thử Salkowski

Lấy 553 ml H2SO4 (98%) cho vào nước cất đủ 1 lít, để nguội sau 12 giờ được dung dịch H2SO4 đậm đặc 10,8M.

Cân 4,5g FeCl3 cho vào 1 lít H2SO4 10,8M đã pha ở trên để được thuốc thử Salkowski.

- Chuẩn bị đường chuẩn IAA

Cân 1,6 mg IAA tổng hợp hòa tan với 10 ml dung dịch đệm phosphat được nồng

độ là 160mg/l Sau đó tiến hành pha loãng ra các nồng độ 0, 5, 10, 16, 20, 40, 80 mg/l.

Lấy 4 ml thuốc thử cho vào các ống nghiệm có nồng độ IAA khác nhau có thể tích 2 ml, mỗi nồng độ lặp lại 3 lần.

Để 10 phút trong tối ở nhiệt độ phòng để phản ứng xảy ra hoàn toàn, sau đó tiến hành đo OD ở bước sóng 530 nm

Từ kết quả trên, chúng tôi xác định được phương trình đường chuẩn của dung dịch IAA thông qua chỉ số OD530nm Dựa vào phương trình đường chuẩn để xác định nồng độ IAA ( mg/l) do các vi khuẩn tạo ra có trong môi trường nuôi cấy.

Bảng nồng độ IAA thành lập đồ thị đường chuẩn

Thực hiện nuôi cấy các chủng vi khuẩn phân lập được trên môi trường chiết

khoai tây (BMS) Chuẩn bị môi trường lỏng trong các bình tam giác, mỗi bình chứa

50ml dịch môi trường, hấp khử trùng, để nguội Tiến hành cấy các chủng vi khuẩn vào

các bình tam giác chứa môi trường đã khử trùng Nuôi ở nhiệt độ phòng, trên máy lắc xoay vòng 150 vòng/phút Sau 60h thu dịch nuôi cấy và li tâm 8000 vòng/phút, li tâm 4 phút, lấy dịch trong để đo lượng IAA được vi khuẩn tổng hợp và tiết ra môi trường bằng phương pháp so màu Salkowski ở bước sóng 530 nm, thí nghiệm được lặp lại 3 lần.

2.3.5 Phương pháp xác định khả năng cố định N của các chủng vi khuẩn

Đánh giá hoạt tính cố định đạm của các chủng vi khuẩn nội sinh phân lập được

dựa trên N tổng số có trong lá và các chỉ tiêu sinh trưởng của cây ngô N tổng số có trong lá và các chỉ tiêu sinh trưởng của cây ngô của các lô thực nghiệm càng cao hơn so với lô đối chứng, chứng tỏ hoạt tính cố định đạm của chủng vi khuẩn càng mạnh.

* Phương pháp thí nghiệm: Hạt ngô lai DK - 888 được khử trùng bằng H2 O2

3% trong 3 phút, rửa lại 4 lần với nước cất Sau đó, cho hạt vào đĩa petri có bông đã được khử trùng, với một ít nước và ủ cho tới khi hạt nứt mộng chuẩn bị nảy mầm Rửa sạch

hạt bằng nước cất Vi khuẩn cố định đạm được nuôi trong ống nghiệm sau 48hh lấy

dịch sinh khối tế bào cho hạt ngô vào và ngâm 15 phút Sau đó đem gieo 1 hạt/bầu đất.

Loại đất đóng bầu là đất vàng nhạt trên đá cát trắng chỉ lấy lớp đất mặt, mỗi bầu đóng khoảng 5 kg đất Mỗi chủng vi khuẩn 1 nghiệm thức, mỗi nghiệm thức có 10 bầu đất,

thí nghiệm được lặp lại 3 lần

Nghiệm thức 1: Đối chứng không bón phân, không nhiễm vi khuẩn

Nghiệm thức 2: Không bón phân, nhiễm các chủng vi khuẩn cố định đạm phân lập được.

Các chỉ tiêu theo dõi cây ngô sau khi gieo 45 ngày: Chiều cao cây, số lá trên

cây, chiều dài lá, đường kính gốc, chiều dài rễ, khối lượng tươi, khô.

Các chỉ tiêu theo dõi bao gồm:

- Chiều cao cây (cm), số lá trên cây, chiều dài lá (cm), đo từ gốc sát mặt đất đến đỉnh của lá ngọn

- Đường kính gốc (mm)

- Hàm lượng diệp lục trong lá được xác định sau 45 ngày.

2.3.5.1 Phương pháp xác định hàm lượng diệp lục.

Hàm lượng diệp lục (chlorophyll) và carotenoid được xác định bằng phương pháp so màu[35].

+ Lấy 500mg lá, cắt nhỏ, ngâm trong 50ml aceton 80%, để trong tối.

+ Sau 3 ngày lấy toàn bộ dịch chiết định mức đến 100ml Sau đó lấy dịch chiết đo

2.3.5.2 Xác định hàm lượng đạm tổng số trong lá bằng phương pháp Kjeldahl.

Chất đạm đã được vô cơ hóa nằm dưới dạng (NH4)2SO4 đem cho tác dụng với dung dịch NaOH 30 % sẽ giải phóng NH3.

Sau đó lượng NH3 được hơi nước lôi cuốn trong máy Parnas-Wargner và được dẫn đến một bình tam giác có chứa một lượng dư H2SO4 Từ đây cho phép xác định được lượng NH3 phóng thích ra, có nghĩa là xác định được lượng đạm có trong mẫu nguyên liệu.

Quá trình này gồm 3 giai đoạn:

Giai đoạn 1: Vô cơ hóa mẫu

Nguyên tắc: Tất cả các chất đạm có trong nguyên liệu dù nằm ở dạng nào (hữu

cơ, vô cơ, protein) chuyển thành hợp chất vô cơ (NH4)2SO4 bằng cách đun sôi với H2SO4 đậm đặc và chất xúc tác.

Cách tiến hành:

Cân 100mg lá ngô đã sấy khô tuyệt đối cho vào bình Kjeldahl, cho tiếp 10ml H2SO4 đậm đặc Thêm vào 200mg chất xúc tác (K2SO4 : CuSO4 3:1), lắc nhẹ, đậy kín để khoảng 3 phút Đặt bình Kjeldahl lên bếp đun, đun cho đến khi dung dịch hoàn toàn trong suốt Để nguội bình rồi chuyển toàn bộ dung dịch sang bình định mức100 ml, dùng nước cất vô đạm tráng lại bình Kjeldahl và định mức đến vạch.

Giai đoạn 2: Cất đạm

Chuyển 50ml dung dịch trong bình định mức ở trên vào bình cất đạm có sẵn 50ml nước cất và 3 giọt thuốc thử Tashiro, lúc này trong bình có màu tím hồng Tiếp tục cho vào bình cất 20ml NaOH 40% cho đến khi toàn bộ dung dịch chuyển sang màu xanh lá mạ (thêm 5ml NaOH 40% nếu dung dịch trong bình chưa chuyển hết sang màu xanh lá mạ).

Chất đạm

H2SO4 đậm đặc Xúc tác, t0 (NH4)2SO4(NH4)2SO4 + 2NaOH Na2SO4 + 2 NH3 + 2 H2O

Tiến hành lắp hệ thống cất đạm, cho vào bình hứng 20ml H2SO4 0,1N và 3 giọt thuốc thử Tashiro (dung dịch có màu tím hồng) Đặt bình hứng sao cho ngập đầu ống sinh hàn Bật công tắc cất đạm Kiểm tra xem hơi ra từ đầu ống sinh hàn

có làm xanh giấy quỳ không, nếu không thêm NaOH 40%.

Sau khi cất đạm 20-25 phút để kiểm tra xem NH4OH còn được tạo ra không, dùng giấy quỳ thử ở đầu ống sinh hàn Nếu giấy quỳ không đổi sang màu xanh là được Ngưng cất đạm, đợi hệ thống nguội mới đem đi rửa.

Giai đoạn 3: Chuẩn độ.

Chuẩn độ H2SO4dư trong bình hứng bằng NaOH 0.1N cho đến khi mất màu tím hồng và chuyển sang màu vàng cam (xanh lá mạ) Ghi nhận thể tích NaOH 0.1 N sử dụng.

 a số miligam nguyên liệu

 1,42: hệ số, cứ 1 ml H2SO4 dùng để trung hòa NH4OH thì tương đương với 1,42 mg Nitơ.

2.3.5.3 Xác định hàm lượng phosphat tổng số trong lá bằng phương pháp quang phổ.

2.3.6 Phương pháp tuyển chọn các chủng vi khuẩn cố định đạm nội sinh bằng

phương pháp PCR xác định gen nifH.

Sau khi sàng lọc các chủng vi khuẩn trên môi trường giới hạn Nfb vô đạm, và khảo sát khả năng sinh IAA của các chủng vi khuẩn nội sinh Cũng như những chi tiêu sinh trưởng, tích lũy cholrophyll, N, P chúng tôi sẽ tuyển chọn các chủng cho phản ứng

tốt với các chỉ tiêu trên và tiến hành PCR để xác định sự tồn tại của gen nifH trong các

chủng vi khuẩn nội sinh này

Mồi đặc hiệu cho gen nifH cũng như quy trình cho phản ứng PCR được cung cấp

và thực hiện tại VCNSH &MT, trường Đại học Tây Nguyên.

Môi xuôi (Pol F) (5' - TGCGAYCCSAARGCBGACTC - 3')

Mồi ngược (Pol R) (5' - ATSGCCATCATYTCRCCGGA - 3')

Sản phẩm sau phản ứng được điện di có kích thước 360bp ghi nhận thông qua thang chuẩn 100bp để kết luận

Nếu xuất hiện vạch có kích thước 360bp thì kết luận vi khuẩn phân lập có mang

gen nifH.

Nếu xuất hiện vạch có kích thước khác 360bp thì kết luận vi khuẩn phân lập

không mang gen nifH.

Quy trình thực hiện phản ứng PCR phát hiện vi khuẩn nội sinh có mang

gen nifH.

Tách chiết tế bào thu nhận DNA

- Thu 1ml sinh khối vi khuẩn, chứng âm vào eppendorf 1.5ml, ly tâm 5.500v/5 phút Thu cặn, loại dịch nổi

- Thêm 900μl dung dịch 1, Vortex 30 giây, để yên 10 phút Thêm 200μl dung dịch 2 (lắc kỹ trước khi hút), trộn đều, ly tâm 13000 vòng/phút trong 10 phút

- Cẩn thận hút 600μl dịch trong nổi có chứa DNA (tránh làm xáo trộn hai lớp) và một eppendorf khác có chứa sẵn 600μl dung dịch 3 (trộn đều trước khi sử dụng) Trộn đều hỗn hợp, để yên 10 phút ở nhiệt độ lạnh, sau đó ly tâm 13000 vòng/phút trong 10 phút.

- Hỗn hợp sau khi ly tâm sẽ có cặn nằm dưới đáy eppendorf Cẩn thận loại bỏ dịch nổi, thu cặn Cho từ từ 900μl dung dịch 4 vào, ly tâm 13000 vòng/phút trong 5 phút.

- Tiếp tục loại bỏ hết dịch nổi và thu cặn Để khô ở nhiệt độ 60°C trong 10 phút Sau đó, thêm vào 50μl dung dịch 5.

Nếu chưa đặt phản ứng PCR, bảo quản mẫu tách chiết ở -20°C.

Phản ứng PCR

Thành phần phản ứng 25µl bao gồm: 5µl DNA khuôn mẫu, chứng âm, 0.5µl mồi xuôi và ngược (PolF 5' - TGCGAYCCSAARGCBGACTC - 3', PolR 5' -

ATSGCCATCATYTCRCCGGA - 3), 12.5µl PCR mastermix, 7.5µl nước.

Chương trình luân nhiệt: 95 – 5 phút 1 chu kỳ

95 – 30 giây

55 – 30 giây 39 chu kỳ

72 – 30 giây

Điện di kiểm tra sản phẩm PCR

Thành phần điện di bao gồm 7µl sản phẩm PCR, chứng âm và 3µl dịch nạp mẫu, 1µl thang 100bp Cho hỗn hợp vào các giếng trên gel agarose 1% Điện di ở điện thế 50V trong 5 phút Sau đó tăng lên 80V trong 30 phút Nhuộm gel trong dung dịch TAE 1X có ethidium bromide trong 15 phút.

Quan sát kết quả điện di thông qua thiết bị chụp hình chuyên dụng GelDoc XR

có kết nối phần mềm chuyên dụng (Biorad)

2.3.7 Phương pháp định danh các chủng vi khuẩn được tuyển chọn.

Gửi mẫu tuyển chọn giải trình tự gen 16S xác định loài tại Công ty TNHH Nam Khoa – TP Hồ Chí Minh.

2.3.8 Phương pháp nghiên cứu xây dựng quy trình nhân sinh khối của các chủng

vi khuẩn được tuyển chọn

2.3.8.1 Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến sinh khối của các chủng vi khuẩn.

Các chủng vi khuẩn sẽ được nuôi trên 3 loại môi trường Nfb, Fallik, môi trường nước chiết khoai tây (BMS), ở nhiệt độ phòng, pH 6,8 Tiến hành đo OD660 sau 24h, 48h, 72h, 96h để xác định sinh khối tế bào Mật độ tế bào được xác định tương quan

OD660 = 1,0 tương đương với mật độ 109 tế bào/ml [27]

* Môi trường Nfb [33].

- MgSO4 .7H2O: 0,2g

- KOH: 4g

- Thành phần khoáng vi lượng, vitamin như môi trường phân lập.

- Thêm nước cất cho đủ 1000ml

* Môi trường nước chiết khoai tây (BMS) [14], [32].

- Nước chiết khoai tây: 500ml ( 200g/l )

- Acid Malic: 2,5g

- KOH: 2,0g

- Đường Sacarose: 2,5 g

- Thành phần khoáng vi lượng, vitamin như môi trường phân lập.

- Thêm nước cất vừa đủ 1 lít.

- pH điều chỉnh đến 6,8.

2.3.8.2 Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến sinh khối của các chủng vi khuẩn.

Tiến hành nuôi cấy các chủng vi khuẩn trên môi trường thuận lợi nhất chọn ra từ thí nghiệm trên, nuôi cấy ở nhiệt độ phòng, pH = 6,8 trên máy lắc 150 vòng/phút Sau

24h, 48 h, 72h, 96h tiến hành đo OD660 để xác định sinh khối tế bào [6], [7].

2.3.8.3 Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của tốc độ lắc đến sinh khối của các chủng vi khuẩn

Tiến hành nuôi cấy các chủng vi khuẩn trên môi trường thuận lợi nhất ( môi trường ở dạng lỏng ) chọn ra từ thí nghiệm trên, nuôi cấy ở nhiệt độ phòng, pH = 6,8 trên máy lắc xoay vòng ở các tốc độ 0, 100, 150, 200, 250 vòng/phút Sau thời gian thuận lợi nhất chọn ra từ các thí nghiệm trên tiến hành đo OD660nm để xác định sinh khối tế bào [7].

2.3.8.4 Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của pH môi trường nuôi cấy đến sinh khối của các chủng vi khuẩn.

Tiến hành nuôi cấy các chủng vi khuẩn trên môi trường tối ưu( môi trường ở dạng lỏng ), ở các pH 4,8; 5,8; 6,3; 6,8 và 7,8 Nuôi cấy ở nhiệt độ phòng, trên máy lắc xoay vòng 150 vòng/phút Sau thời gian thuận lợi nhất chọn ra từ các thí nghiệm trên tiến hành đo OD660 để xác định sinh khối tế bào [7].

2.3.8.5 Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy đến sinh khối của các chủng vi khuẩn.

Tiến hành nuôi cấy các chủng vi khuẩn cố định đạm trên môi trường, pH thuận lợi nhất chọn ra từ các thí nghiệm trên ở các nhiệt độ 270C, 320C, 370C, 420C Sau thời gian thuận lợi nhất chọn ra từ các thí nghiệm trên tiến hành đo OD660 để xác định sinh khối tế bào [7].

2.3.9 Phương pháp xử lý số liệu thống kê

Các số liệu được xử lý trên phần mềm MSTATC version 2.10 của Đại học Michigan, Mỹ.

Đồ thị tương quan và phương trình tương quan giữa chỉ số mật độ quang OD với sinh khối tế bào, nồng độ IAA được xử lý trên phần mềm EXCELL 2003 của Microsoft Các biểu đồ khác cũng được xử lý trên phần mềm này

PHẦN III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1 Kết quả phân lập một số chủng vi khuẩn cố định đạm trong rễ cây ngô ở Đăk Lăk.

Để đảm bảo các chủng vi khuẩn phân lập được đều là nội sinh chúng tôi đã text nước rửa cuối cùng của các mẫu trên môi trường giàu dinh dưỡng BMS có bổ sung thêm cao nấm men Sau 3 ngày trên đĩa petri có cấy dung dịch nước rửa cuối không thấy xuất hiện vi khuẩn chứng tỏ khâu xử lý mẫu đã đạt.

Hình 3.1 Sự hiện diện của vi khuẩn cố định đạm trong môi trường giới hạn Nfb

Hình 3.2 Khuẩn lạc đơn của một số chủng VK cố định đạm trong môi trường đặc Nfb

Các dòng thuần được cấy trong ống thạch nghiêng trong môi trường giữ giống Nfb + 0,2g cao nấm men + 50ml NH4Cl bảo quản trong tủ lạnh 5oC.

Vòng pellicle

Hình 3.3 Dòng thuần được cấy trên môi trường giữ giống

Sau một thời gian phân lập tại 3 địa điểm của tỉnh Đăk Lăk ( Ea Súp, Buôn Ma Thuột, Krông Năng) chúng tôi đã thu được 31 dòng vi khuẩn được đặt tên theo thứ tự từ 1 đến

31 (C1, C2, C3…C31) Trong đó có 9 dòng ở Krông Năng (C1, C2, C3, C4, C5, C6, C7, C8, C9), 10 dòng ở dòng ở thành phố Buôn Ma Thuột (C10, C11, C12, C13, C14, C15, C16, C17, C18, C19) và 12 dòng ở huyện Ea Súp (C20, C21, C22, C23, C24, C25, C26, C27, C28, C29, C30, C31).

3.2 Kết quả mô tả đặc điểm hình thái, đặc điểm sinh học của các chủng vi khuẩn cố định đạm

Quan sát khuẩn lạc đơn dưới kính lúp điện tử, các khuẩn lạc đơn sẽ được phân loại sơ bộ theo hình thái, màu sắc và kích thước Kết quả phân loại khuẩn lạc được ghi nhận trong bảng 3.1 cho thấy hầu hết các chủng có đặc điểm chung là khuẩn lạc tròn, bìa khuẩn lạc nguyên, kích thước từ 1-2 mm, màu trắng sữa đến vàng nhạt khi sinh trưởng trên môi trường Nfb đặc.

Bảng 3.1 Hình thái khuẩn lạc của vi khuẩn cố định N nội sinh trong rễ cây

2 C2 Tròn đều Trơn Trắng sữa Bằng phẳng 1,4

bóng hơi nâu

bóng

Trong như giọt nước Bằng phẳng 1,3

bóng

Trắng trong Bằng phẳng 1,1

Hình thái khuẩn lạc C23 Hình thái khuẩn lạc C31

Chủng C23 – Hình que, gram (-) Hình thái khuẩn lạc C14

Hình 3.4 Hình thái tế bào của một số chủng vi khuẩn khi nhộm gram.