PHÂN LẬP TUYỂN CHỌN MỘT SỐ CHỦNG VI KHUẨN CỐ ĐỊNH ĐẠM TRÊN ĐẤT TRỒNG LÚA BỊ NHIỄM MẶN

    BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NƠNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP PHÂN LẬP TUYỂN CHỌN MỘT SỐ CHỦNG VI KHUẨN CỐ ĐỊNH ĐẠM TRÊN ĐẤT TRỒNG LÚA BỊ NHIỄM MẶN Ngành học: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Sinh viên thực hiện: PHAN VĂN TUẤN Niên khóa: 2011 – 2013 Tháng 12/2013 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP PHÂN LẬP TUYỂN CHỌN MỘT SỐ CHỦNG VI KHUẨN CỐ ĐỊNH ĐẠM TRÊN ĐẤT TRỒNG LÚA BỊ NHIỄM MẶN Hướng dẫn khoa học: Sinh viên thực hiện: ThS TRƯƠNG PHƯỚC THIÊN HOÀNG PHAN VĂN TUẤN Tháng 12/2013   LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên, xin chân thành cảm ơn Ba Mẹ, người nuôi dạy suốt 12 năm để bước vào giảng đường đại học ngày hôm chuẩn bị bước vào đời Chân thành cảm ơn ThS Trương Phước Thiên Hồng, tận tình hướng dẫn cho em suốt thời gian làm đề tài tốt nghiệp Chân thành cảm ơn Ban giám hiệu trường Đại học Nông Lâm TP Hồ Chí Minh tạo điều kiện cho em học tập trường Chân thành cảm ơn thầy cô thuộc Bộ môn Công nghệ sinh học thầy cô trực tiếp giảng dạy em năm qua Chân thành cảm ơn TS.Lê Đình Đơn, thầy người hướng dẫn Bộ môn Công nghệ sinh học tạo điều kiện cho chúng em học tập nghiên cứu Chân thành cảm ơn thầy cô thuộc Bộ môn Công nghệ sinh học thầy cô trực tiếp giảng dạy em năm qua Mình chân thành cảm ơn bạn sinh viên làm đề tài tốt nghiệp sinh viên phòng Kiểm nghiệm vi sinh thực phẩm, Viện công nghệ sinh học môi trường, trường Đại học Nơng Lâm TP Hồ Chí Minh Chân thành cảm ơn tập thể lớp LT11SH, chia sẻ khó khăn bước vào giảng đường đại học suốt thời gian học tập trường Sinh viên thực Phan Văn Tuấn vii    TÓM TẮT Trong tự nhiên nitơ tồn chủ yếu dạng nitơ phân tử (N2), trồng hấp thụ dạng nitơ Vi sinh vật cố định nitơ nhóm bao gồm nhiều lồi vi sinh vật khác nhau, có khả tương tác với thực vật theo hướng có lợi xem vi khuẩn kích thích tăng trưởng thực vật Dưới tác động nitrogenase, vi sinh vật cố định đạm tự từ khí quyển, làm giàu nguồn đạm đất cho trồng sử dụng Trên sở đóđề tài“Phân lập tuyển chọn định danh số chủng vi khuẩn cố định đạm đất trồng lúa bị nhiễm mặn” thực Từ mẫu đất trồng lúa bị nhiễm mặn từ tỉnh Tiền Giang, Kiên Giang, Bến Tre tiến hành phân lập 30 chủng vi khuẩn có khả cố định đạm Chủng TG4, BT4, KG5 có khả có định nitrogen cao Để nghiên cứu ảnh hưởng môi trường tới sinh trưởng cố định nitrogen chủng vi sinh vật phân lập, chủng vi sinh vật tiến hành nuôi cấy ba môi trường Ashby, Fedorov, Jensen để tìm mơi trường tối ưu cho phát triển khả cố định đạm Kết cho thấy rằng, mơi trường Fedorov mơi trường thích hợp cho sinh trưởng cố định nitrogen chủng vi sinh vật phân lập Chủng TG4 BT4 cho mật độ vi khuẩn 25,93 x 108CFU/ml, 25,80 x 108 CFU/ml cho hàm lượngnitơ tổng 26,7 mg/l, 44,5 mg/l Chủng KG5 cho mật độ vi khuẩn 24,77 x 108 CFU/ml, cho hàm lượngnitơ tổng 29,03 mg/l Sử dụng phương pháp hóa sinh, quan sát hình thái, phân tích 16S RNA định danh chủng TG4, BT4, and KG5 có tên khoa học sau: TG4 Azotobacter vinelandii, BT4 Azotobacter vinelandii, KG5 có tên khoa học Stenotrophomonas maltophilia Từ khóa: Azotobacter vinelandii, Stenotrophomonas maltophilia, vi sinh vật cố định đạm viii    SUMMARY According to estimates, the Earth's atmosphere contains 78% of the nitrogen Nitrogen is animportance basic component of all living organisms in the world It are considered presently instructure of organic compounds, such as nucleic acids, proteins, ATP However,nitrogen is often presented in the form of molecular nitrogen (N2) which plants can not absorb Nitrogen fixing microorganisms (NFM) includes many various species These microorganisms areable to interact with plants in the beneficial pathways, and thereby it stimulates the growth of plants Under the impact of the nitrogenase, microorganisms is able to fix free nitrogen source from the atmosphere, then enriched nitrogen source in soils, and plants can use easily Besides, there are a larger number of nitrogen fixing microorganismsare also able to solubility of insoluble phosphate source, to producethe growth stimulants in plant as indole 3-acetic acid, giberrellins, and cytokinin So, we conduct the subject: "Isolation, selection, and identification nitrogenfixing bacteria on soil salinity in the paddy fields" Thirty strains of nitrogen-fixing bacteria were isolated and selected from 30 of soil salinity samplescollected from Tien Giang, Kien Giang, and Ben Tre province TG4, BT4, and KG5 strains were capable of nitrogen fixation highest in among the isolated strains To study the effect of medium to the growth and nitrogen fixation of the isolates, we cultured bacterial strains on Ashby, Fedorov, and Jensen medium The result shown that, Fedorov medium is the best medium for the growth and nitrogen fixation TG4 and BT4 strainshad the total number of bacteria were 25.93×108 CFU/ml, and 25.80×108CFU/ml, respectively The total content of nitrogen of TG4 and BT4 strainswere 26.7 mg/l, and 44.5 mg/l, respectively KG5 strain had 24.77x108CFU/ml, and 29.03 mg/l of the total content of nitrogen.Using morphological, biochemistry, and 16S RNA analysis methods, TG4, BT4, and KG5 strain were identified Azotobacter vinelandii, Azotobacter vinelandii, and Stenotrophomonas maltophilia, respectively Key words: Azotobacter vinelandii, Stenotrophomonas maltophilia,nitrogenfixing bacteria ix    MỤC LỤC Trang LỜI CẢM ƠN vii TÓM TẮT viii SUMMARY ix MỤC LỤC x DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT xiii DANH SÁCH CÁC BẢNG xiv DANH SÁCH CÁC HÌNH xv Chương 1MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Yêu cầu đề tài 1.3 Nội dung thực Chương 2TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Tổng quan nitơ 2.1.1 Nguồn nitơ tự nhiên 2.1.2 Chu trình nitơ tự nhiên 2.1.3 Vai trò nitơ thực vật .5 2.2 Tổng quan vi sinh vật cố định nitơ 2.2.1 Quá trình cố định nitơ sinh học 2.2.2 Vi khuẩn cố định nitơ (NFB – Nitrogen fixing bacteria) .6 2.2.2.1 Vi khuẩn sống cộng sinh .8 2.2.2.2 Vi khuẩn sống tự 2.3 Quá trình cố định đạm vi khuẩn 17 2.3.1 Cấu trúc enzyme nitrogenase 18 2.3.2 Cơ chế hoạt động nitrogenase 18 2.3.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt động enzyme nitrogenase 20 2.4 Vai trò vi khuẩn cố định nitơ 21 2.4.1 Khả hòa tan phosphate 21 2.4.2 Sinh tổng hợp chất điều hòa tăng trưởng thực vật 22 x    2.4.3 Các ứng dụng khác .25 2.5 Một số nghiên cứu nướcvề vi khuẩn cố định đạm 25 2.5.1 Một số nghiên cứu nước 25 2.5.2 Một số nghiên cứu giới 27 Chương 3VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 29 3.1 Thời gian địa điểm 29 3.2 Vật liệu, dụng cụ, thiết bị thí nghiệm 29 3.2.1 Vật liệu 29 3.2.2 Dụng cụ thiết bị 30 3.2.3 Hóa chất .30 3.2.3.1 Thành phần số môi trường 32 3.3 Phương pháp thực thí nghiệm nghiên cứu 33 3.3.1 Thí nghiệm 1: phân lập quan sát hình thái vi khuẩn cố định đạm 33 3.3.1.1 Lấy mẫu 34 3.3.1.2 Phân lập chọn lọc làm 34 3.3.1.3 Phương pháp quan sát hình thái khuẩn lạc tế bào .35 3.3.2 Thí nghiệm 2: Định lượng Nitơ tổng số phương pháp Kjeldahl 35 3.3.3 Thí nghiệm 3: Khảo sát đặc điểm sinh hóa vi khuẩn phân lập 37 3.3.4 Thí nghiệm 4: 38 3.3.4.1 Định danh loài 38 3.3.4.2 Khảo sát môi trường tối ưu ba chủng vi khuẩn cố định đạm cao 38 CHƯƠNG 4KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 39 4.1 Kết phân lập làm .39 4.1.1 Mật độ vi khuẩn giá trị pH mẫu .39 4.1.2 Đặc điểm, hình dạng khuẩn lạc 42 4.2 Kết khảo sát đặc điểm sinh hóa vi khuẩn phân lập .45 4.3 Kết định lượng Nitơ tổng số phương pháp Kjeldahl .47 4.4 Kết định danh lồi chủng có khả cố định đạm cao khảo sát môi trường tối ưu chúng 48 4.4.1 Kết định danh loài chủng có khả cố định đạm cao 48 4.4.2 Khảo sát môi trường tối cho chủng có khả cố định đạm cao 49 xi    Chương 5KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 51 5.1 Kết luận 51 5.2 Đề nghị 51 TÀI LIỆU THAM KHẢO 53 PHỤ LỤC xii    DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT CFU: Colony Forming Unit OXI: Oxidase GLU: Glucose NIT: Nitrate ONPG: Thủy giải ONPG URE: Urease PAD: Phenyl Alanine Deaminase CIT: Citrate ESC: Esculin H2S: Hydrosulfite IND: Indol VP: Voges- Proskauer MLO: Malonate LDC: Lysin decarboxylase MOB: Motility xiii    DANH SÁCH CÁC BẢNG Trang Bảng 2.1 Các nhóm vi sinh vật cố định nitơ chủ yếu tự nhiên Bảng 3.1 Kí hiệu mẫu, địa thu thập mẫu 29 Bảng 3.2 Các phản ứng sinh hóa bảng nhựa Kit IDS 14 GNR .31 Bảng 3.3Thành phần môi trường Fedorov 32 Bảng 3.4Thành phần môi trường Jensen 32 Bảng 3.5Thành phần môi trường Ashby .33 Bảng 4.1 Mật độ vi khuẩn giá trị pH đất tỉnh Bến Tre 39 Bảng 4.2Mật độ vi khuẩn giá trị pH mẫu đất tỉnh Kiên Giang .40 Bảng 4.3 Mật độ vi khuẩn pH đất tỉnh Tiền Giang .41 Bảng 4.4 Đặc điểm, hình dạng khuẩn lạc chủng vi khuẩn phân lập môi trường thạch đậu 42 Bảng 4.5Kết phản ứng sinh hóa .45 Bảng 4.6 Kết nhuộm gram, quan sát hình thái kích thước tế bào vi khuẩn 46 Bảng 4.7 Hàm lượng nitơ tổng số 30 chủng vi khuẩn phân lập .47 Bảng 4.8Mật độ tế bào (CFU/ml) ba chủng BT4, TG4 KG5 môi trường Ashby, Fedorov, Jensen 49 Bảng 4.9Hàm lượng nitơ cố định (mg/ml) ba chủng BT4, TG4 KG5 môi trường Ashby, Fedorov, Jensen 50 xiv    20 Glick, B.R., (1995), "The enhancement of plant growth by free living bacteria", Canadian Journal of Microbiology, 41:109-117 21 Guixiang, P., Wu, Z., Luo, H., Xie, H., Lai, W., Tan, Z., (2009), "Enterobacter oryzae sp nov., a nitrogen-fixing bacterium isolated from wild rice Oryza latifolia", Internationa journal of systematic and evolutionary microbiology 22 Grimon, F., and Grimont, A.D., (2006), "The Genus Enterobacter", Prokaryote, 6:197-214 23 Hartmann, and Baldani, (2006), "The GenusAzospirillum", Prokayote, 5: 115-140 24 Hwangbo, H., Park, R.D., Kim, Y.W., Rim, Y.S., Park, K.H., Kim, T.H., Suh, I.S., Kim, K.Y., (2003), "2-ketogluconic acid production and phosphate solubilization by Entterobacter intermedium", Curr Microbiology, 2: 87-92 25 Iwata, K., Yu, S.S., Azlan, N.N.A., and Omori, T., (2012), "Ammonia Acumulation of Novel Nitrogen-Fixing Bacteria", Biotechnology - Molecular Studies and Novel Applications for Improved Quality of Human Life 26 Kaymak, H.C., (2010), "Potential of PGPR in Agricultural Innovations Plant Growth and Health Promoting Bacteria", Springer 27 Laane, C., Krone, W., Konings, W., Haaker, H., Veeger, C., (1980), "Short-Term Effect of Ammonium Chloride on Nitrogen Fixation by Azotobacter vinelandii and by Bacteroids of Rhizobium leguminosarum", European Journal of Biochemistry, 103: 39-46 28 Mali, G.V., and Bodhankar, M.G, (2009), "Antifungal and Phytohormone Production Potential of Azotobacter chroococcum Isolates from Groundnut (Aragiốngs hypogea L.) Rhizosphere", Asian Journal of Experiment Sciences, 23:293-297 29 Mechaz.S., (2011),"Plant Growth-Promoting Bacteria Associated with Sugarcane", Bacteria in Agrobiology: Crop Ecosystems, Springer 30 Mishustin, E.N., Shilnikova, V.K., (1969), "The biological fixation of atmospheric nitrogen by free living bacteria", In: Soil Biology, Reviews of Research, Unesco, Paris,: 72-174 31 Pedrosa Elmerich, "Associative and Endophytic Nitrogen-fixing Bacteria and Cyanobacterial Asscociations", Springer, The Netherlands,: 44 55    32 Sahasrabudhe, M.M., (2011), "Screening of rhizobia for indole acetic acid production", Annals of Biological Research, : 460-468 33 Saxena, A.K,, Tilak K., (1998), "Free-living nitrogen fixers: Its role in crop production: In Microbes for Health, Wealth and Sustainable Environment",Malhotra Publishing Company, : 25–64 34 Schwintzer, R., Tjepkema, J.D., (1990).,"The Biology of Frankia and Actinorhizal Plants", Academic Press, Inc San Diego, USA 35 Spaepen, S., and Vanderleyden, J., (2010), "Auxin and Plant-Microbe Interactions", Cold Spring Harb Perspect Biology, 4: 185-190 36 Sylvia, D M., Fuhrman, J.J., Hartel, P.G., Zuberer, D.A (1999),"Principles and Applications of Soil Microbiology", Prentice Hall, : 259-321 37 Thakuria, D., Talukdar, N.C., Goswami, C., Hazarika, S., Boro, R.C., and Khan M.R., (2004), "Characterization and screening of bacteria from rhizosphere of rice grown in acidic soils of Assam", Current Science,: 978-985 38 Verma, J.P., Yadav, J., Tiwari, N.T., Lavakush and Singh, V., (2010), "Impact of Plant Growth Promoting Rhizobacteria on Crop Production", International Journal of Agricultural Research, 5: 954-983 39 Dey, R., Pal, K.K., Bhatt, D.M., Chauhan, S.M., (2004), "Growth promotion and yield enhancement of peanut (Aragiôngs hypogaea L.) by application of plant growthpromoting rhizobacteria", Microbiological Research, 159 : 371-394 Nguồn internet 40.http://www.newworldencyclopedia.org/entry/Nitrogen_fixation 10/08/2013 41.http://www.inst.bact.wisc.edu/inst/index.php?module=book&func=displayarticle& art_id=274 11/09/2013 42 http://www.vietsciences.free.fr/khaocuu/nguyenlandung/chuong18.pdf 05/10/2013 56    PHỤ LỤC Phụ lục Bảng 1Mật độ vi khuẩn cố địnhđạm tỉnh Bến Tre Mẫu Lần lặp lại Mật độ trung bình(x104CFU/g) BT1 8,50 8,50 8,80 8,60 ± 0,17e BT2 10,00 9,60 10,40 BT3 6,50 6,20 6,40 10,00 ± 0.40d 6,37 ± 0,15f BT4 26,00 26,80 26,70 26,50 ± 0,44b BT5 19,30 19,00 18,70 19,00 ± 0,30c BT6 4,00 4,30 5,00 4.43 ± 0,51h BT7 8,10 7,80 7,30 7,73 ± 0,40e BT8 18,90 18,20 18,80 18,63 ± 0,38c BT9 29,00 28,30 28,00 28,43 ± 0,51a BT10 5,50 5,80 5,10 5,46 ± 0,35g Bảng 2Bảng ANOVA mật độ vi khuẩn cố định đạm tỉnh Bến Tre số liệu bảng ANALYSIS OF VARIANCE TABLE Degrees of Sum of Mean Freedom Squares Square F-value Prob Between 2147.222 238.580 1645.382 0.0000 Within 20 2.900 0.145 Total 29 2150.122 Coefficient of Variation = 2.82%     Bảng Bảng trắc nghiệm phân hạng mật độ vi khuẩn cố định đạm tỉnh Bến Tre Duncan's Multiple Range Test LSD value = 0.8847 s_ = 0.2198 at alpha = 0.010 x Original Order Mean = Mean = Mean = Mean = Mean = Mean = Mean = Mean = Mean = Mean 10 = Ranked Order 8.600 E 10.00 D 6.370 F 26.50 B 19.00 C 4.430 H 7.730 E 18.63 C 28.43 A 5.460 G Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean 9= 4= 5= 8= 2= 1= 7= 3= 10 = 6= 28.43 A 26.50 B 19.00 C 18.63 C 10.00 D 8.600 E 7.730 E 6.370 F 5.460 G 4.430 H Bảng Mật độ vi khuẩn cố định đạm tỉnh Kiên Giang Lần lặp lại Mẫu KG1 25,70 25,50 25,00 25,40 ± 0,20bc 6,40 7,50 KG2   Mật độ trung bình(x104CFU/g) 7,00 KG3 28,00 27,50 25,00 6,79 ± 0.40fg 26,83 ± 0,15b KG4 8,90 8,20 8,50 8,53 ± 0,44f KG5 29,50 29,90 29,30 29,57 ± 0,30a KG6 23,80 23,60 23,00 23,47 ± 0,51c KG7 5,50 4,80 5,20 5,17 ± 0,40g KG8 14,00 14,30 14,50 14,27± 0,38e KG9 18,90 17,50 18,00 18,13 ± 0,51d KG10 29,00 25,90 25,20 26,70 ± 0,35b   Bảng Bảng ANOVA mật độ vi khuẩn cố định đạm tỉnh Bến Tre số liệu bảng ANALYSIS OF VARIANCE TABLE Degrees of Sum of Mean Freedom Squares Square F-value Prob Between 2278.323 253.147 309.491 0.0000 Within 20 16.359 0.818 Total 29 2294.682 Coefficient of Variation = 4.89% Bảng Bảng trắc nghiệm phân hạng mật độ vi khuẩn cố định đạm tỉnh Kiên Giang Duncan's Multiple Range Test LSD value = 2.101 s_ = 0.5222 at alpha = 0.010 x Original Order Mean = Mean = Mean = Mean = Mean = Mean = Mean = Mean = Mean = Mean 10 = Ranked Order 25.40 BC 6.970 FG 26.83 B 8.530 F 29.57 A 23.46 C 5.170 G 14.27 E 18.13 D 26.70 B Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean 5= 3= 10 = 1= 6= 9= 8= 4= 2= 7= 29.57 A 26.83 B 26.70 B 25.40 BC 23.46 C 18.13 D 14.27 E 8.530 F 6.970 FG 5.170 G Bảng Mật độ vi khuẩn cố định đạm tỉnh Tiền Giang   Mẫu TG1 5,00 Lần lặp lại 4,60 TG2 9,40 9,00 9,50 TG3 TG4 4,80 20,00 5,00 19,80 4,50 20,50 TG5 6,50 7,20 6,80 20,10 ± 0,44a 6,84 ± 0,30e TG6 9,20 9,00 8,90 9,03± 0,51c TG7 18,90 18,20 18,00 18,37 ± 0,40b TG8 8,10 7,80 7,30 7,74 ± 0,38d TG9 10,00 9,60 8,80 TG10 6,50 6,20 6,40 9,48 ± 0,51c 6,37± 0,35e 4,80 Mật độ trung bình(x104CFU/g) 4,8 ± 0,20f 9,31± 0.40c 4,77± 0,15f   Bảng Bảng ANOVA mật độ vi khuẩn cố định đạm tỉnh Bến Tre số liệu bảng ANALYSIS OF VARIANCE TABLE Degrees of Sum of Mean Freedom Squares Square F-value Prob Between 766.117 85.124 687.631 0.0000 Within 20 2.476 0.124 Total 29 768.593 Coefficient of Variation = 3.63% Bảng Bảng trắc nghiệm phân hạng mật độ vi khuẩn cố định đạm tỉnh Tiền Giang Duncan's Multiple Range Test LSD value = 0.8181 s_ = 0.2033 at alpha = 0.010 x Original Order Mean = Mean = Mean = Mean = Mean = Mean = Mean = Mean = Mean = Mean 10 = Ranked Order 4.800 F Mean = 9.310 C Mean = 4.770 F Mean = 20.10 A Mean = 6.840 E Mean = 9.030 C Mean = 18.37 B Mean = 7.740 D Mean 10 = 9.480 C Mean = 6.370 E Mean = 20.10 A 18.37 B 9.480 C 9.310 C 9.030 C 7.740 D 6.840 E 6.370 E 4.800 F 4.770 F Bảng 10Bảng ANOVA hàm lượng nitơ tổng số 30 chủng phân lập ANALYSIS OF VARIANCE TABLE Degrees of Sum of Mean Freedom Squares Square F-value Prob Between 29 8428.839 290.650 297.458 0.0000 Within 60 58.627 0.977 Total 89 8487.466 Coefficient of Variation = 4.22%     Bảng 10Bảng trắc nghiệm phân hạng hàm lượng nitơ tổng số 30 chủng phân lập Least Significant Difference Test LSD value = 2.147 at alpha = 0.010 Original Order Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean 1= 2= 3= 4= 5= 6= 7= 8= 9= 10 = 11 = 12 = 13 = 14 = 15 = 16 = 17 = 18 = 19 = 20 = 21 = 22 = 23 = 24 = 25 = 26 = 27 = 28 = 29 = 30 = 5.100 12.20 19.17 38.73 22.40 14.93 10.43 28.23 13.33 11.03 37.70 35.30 18.07 16.13 44.17 32.37 20.80 22.30 24.50 15.80 22.63 18.97 25.90 39.40 28.77 18.13 37.70 22.30 26.97 19.60 Ranked Order Q Mean 15 = 44.17 A OP Mean 24 = 39.40 B JK Mean = 38.73 B B Mean 27 = 37.70 B HI Mean 11 = 37.70 B MN Mean 12 = 35.30 C P Mean 16 = 32.37 D E Mean 25 = 28.77 E NO Mean = 28.23 E P Mean 29 = 26.97 EF B Mean 23 = 25.90 FG C Mean 19 = 24.50 GH KL Mean 21 = 22.63 HI LM Mean = 22.40 HI A Mean 28 = 22.30 I D Mean 18 = 22.30 I IJ Mean 17 = 20.80 IJ I Mean 30 = 19.60 JK GH Mean = 19.17 JK M Mean 22 = 18.97 JK HI Mean 26 = 18.13 KL JK Mean 13 = 18.07 KL FG Mean 14 = 16.13 LM B Mean 20 = 15.80 M E Mean = 14.93 MN KL Mean = 13.33 NO B Mean = 12.20 OP I Mean 10 = 11.03 P EF Mean = 10.43 P JK Mean = 5.100 Q Bảng 11Mật độ tế bào (CFU/ml) chủngBT4, TG4 KG5 môi trường Ashby   Chủng Lần lặp lại BT1 20,7 19,40 23,10 Mật độ tế bào x 108 (CFU/ml) môi trường Ashby 21,07 ± 1,88 ab TG4 21,50 23,70 24,10 23,10 ± 1,40a KG5 18,70 17,20 19,40 18,43 ± 1,12b   Bảng 12 Bảng ANOVA mật độ tế bào (CFU/ml) chủngBT4, TG4 KG5 môi trường Ashby ANALYSIS OF VARIANCE TABLE Degrees of Sum of Mean Freedom Squares Square F-value Prob Between 32.847 16.423 7.303 0.0247 Within 13.493 2.249 Total 46.340 Coefficient of Variation = 7.19% Bảng 13 Bảng trắc nghiệm phân hạng mật độ tế bào (CFU/ml) chủngBT4, TG4 KG5 môi trường Ashby Duncan's Multiple Range Test LSD value = 2.996 s_ = 0.8658 at alpha = 0.050 x Original Order Mean Mean Mean Ranked Order = 21.07 AB Mean = 23.10 A = 23.10 A Mean = 21.07 AB = 18.43 B Mean = 18.43 B Bảng 14 Mật độ tế bào (CFU/ml) chủng BT4, TG4 KG5 môi trường Fedorov Lần lặp lại BT1 25,80 24,10 27,50 Mật độ tế bào x 108 (CFU/ml) môi trường Fedorov 25,80 ± 1,70 a TG4 25,50 28,10 24,20 25,93 ± 1,99a KG5 26,10 24.50 23,70 24,77 ± 1,22a Chủng Bảng 15 Bảng ANOVA mật độ tế bào (CFU/ml) chủngBT4, TG4 KG5 môi trường Fedorov ANALYSIS OF VARIANCE TABLE Degrees of Sum of Mean Freedom Squares Square F-value Prob Between 2.447 1.223 0.441 Within 16.653 2.776 Total 19.100 Coefficient of Variation = 6.53%     Bảng 16 Bảng trắc nghiệm phân hạng mật độ tế bào (CFU/ml) chủngBT4, TG4 KG5 môi trường Ashby Duncan's Multiple Range Test LSD value = 3.329 s_ = 0.9619 at alpha = 0.050 x Original Order Mean Mean Mean Ranked Order = 25.80 A Mean = 25.93 A Mean = 24.77 A Mean = 25.93 A = 25.80 A = 24.77 A Bảng 17 Mật độ tế bào (CFU/ml) chủng BT4, TG4 KG5 môi trường Jensen Lần lặp lại BT1 25,10 22,40 22,70 Mật độ tế bào x 108 (CFU/ml) môi trường Jensen 23,40 ± 1,48 a TG4 23,70 25,10 26,70 25,17 ± 1,50a KG5 21,50 24,20 25,70 23,80 ± 2,13a Chủng Bảng 18 Bảng ANOVA mật độ tế bào (CFU/ml) chủngBT4, TG4 KG5 môi trường Jensen ANALYSIS OF VARIANCE TABLE Degrees of Sum of Mean Freedom Squares Square F-value Prob Between 5.149 2.574 0.861 Within 17.947 2.991 Total 23.096 Coefficient of Variation = 7.17%     Bảng 19 Bảng trắc nghiệm phân hạng mật độ tế bào (CFU/ml) chủngBT4, TG4 KG5 môi trường Jensen Duncan's Multiple Range Test LSD value = 3.455 s_ = 0.9985 at alpha = 0.050 x Original Order Mean Mean Mean Ranked Order = 23.40 A Mean = 25.17 A Mean = 23.80 A Mean = 25.17 A = 23.80 A = 23.40 A Bảng 20 Hàm lượng nitơ cố định (mg/ml) ba chủngBT4, TG4 KG5 môi trường Ashby Chủng BT1 22,30 Lần lặp lại 24,50 25,70 Nitơ tổng số (mg/l) môi trường Ashby 24 ± 1,48 a TG4 19,20 23,50 21,70 21,77 ± 2,24a KG5 13,20 15,70 16,50 15 ± 1,57b Bảng 21 BảngANOVA hàm lượng nitơ cố định (mg/ml) ba chủngBT4, TG4 KG5 môi trường Ashby ANALYSIS OF VARIANCE TABLE Degrees of Sum of Mean Freedom Squares Square F-value Prob Between 131.776 65.888 20.455 0.0021 Within 19.327 3.221 Total 151.102 Coefficient of Variation = 8.86% Bảng 22 Bảngtrắc nghiệm phân hạng hàm lượng nitơ cố định (mg/ml) ba chủngBT4, TG4 KG5 môi trường Ashby Least Significant Difference Test LSD value = 5.433 at alpha = 0.010 Original Order Mean Mean Mean   Ranked Order = 24.00 A Mean = 24.00 A = 21.77 A Mean = 21.77 A = 15.00 B Mean = 15.00 B   Bảng 23 Hàm lượng nitơ cố định (mg/ml) ba chủngBT4, TG4 KG5 môi trường Jensen Lần lặp lại Nitơ tổng số Chủng (mg/l) môi trường Jensen BT1 11,20 14.50 14,70 13,27 ± 1,83a TG4 9,7 13,80 12,50 11,87 ± 1,88a KG5 11,7 14,50 15,20 13,77 ± 1,89a Bảng 24 BảngANOVA hàm lượng nitơ cố định (mg/ml) ba chủngBT4, TG4 KG5 môi trường Jensen ANALYSIS OF VARIANCE TABLE Degrees of Sum of Mean Freedom Squares Square F-value Prob Between 5.820 2.910 0.834 Within 20.940 3.490 Total 26.760 Coefficient of Variation = 14.41% Bảng 25 Bảngtrắc nghiệm phân hạng hàm lượng nitơ cố định (mg/ml) ba chủngBT4, TG4 KG5 môi trường Jensen Least Significant Difference Test LSD value = 5.655 at alpha = 0.010 Original Order Mean Mean Mean Ranked Order = 13.27 A Mean = 11.87 A Mean = 13.77 A Mean = 13.77 A = 13.27 A = 11.87 A Bảng 26 Hàm lượng nitơ cố định (mg/ml) ba chủngBT4, TG4 KG5 môi trường Fedorov   Lần lặp lại BT1 45,10 43,90 44,50 Nitơ tổng số (mg/l) môi trường Fedorov 44,5 ± 0,74a TG4 24,90 27,50 27,70 26,7 ± 1,40b KG5 27,70 30,50 30,20 29,03 ± 1,35b Chủng   Bảng 27BảngANOVA hàm lượng nitơ cố định (mg/ml) ba chủngBT4, TG4 KG5 môi trường Fedorov ANALYSIS OF VARIANCE TABLE Degrees of Sum of Mean Freedom Squares Square F-value Prob Between 581.576 290.788 201.470 0.0000 Within 8.660 1.443 Total 590.235 Coefficient of Variation = 3.61% Bảng 28 Bảngtrắc nghiệm phân hạng hàm lượng nitơ cố định (mg/ml) ba chủngBT4, TG4 KG5 môi trường Fedorov Least Significant Difference Test LSD value = 3.636 at alpha = 0.010 Original Order Mean Mean Mean   Ranked Order = 44.53 A Mean = 44.53 A = 26.27 B Mean = 29.03 B = 29.03 B Mean = 26.27 B   Phụ lục Thành phần số môi trường Bảng 29Thành phần môi trường Fedorov Hóa chất Nồng độ Mannitol 20g/l K2HPO4 0.3g/l MgSO4.7H2O 0,3g/l CaHPO4 0,2g/l NaCl 0,5g/l K2SO4 0.2g/l FeCl3 6H2O 0.1g/l CaCO3 5.0g/l Khoáng vi lượng 1.0 ml/l Thành phần khoáng vi lượng H3BO3 5.0g (NH4)2MoO4 5.0g KI 0.5g NaBr 0.5g ZnSO4 H2O 0.2g Al2(SO4)3.18H2O 0.3g H2O 1000ml     Bảng 30Thành phần mơi trường Jensen Hóa chất Nồng độ Sucrose 20 g/l K2HPO4 1.0 g/l MgSO4 0.5 g/l FeSO4 0.1 g/l NaCl2 0.5 g/l Sodium molybdate 0.005 g/l Agar Bảng 31Thành phần mơi trường Ashby Hóa chất Nồng độ Mannitol 20 g/l K2HPO4 0,2 g/l NaCl2 0,2 g/l MgSO4.7H2O 0,2 g/l K2SO4 2H2O 0,1 g/l CaCO3 g/l Agar 12g/l     Bảng 32Thành phần môi trường thạch đậu (TCVN, 2002) Hóa chất Nồng độ Sacaroza g/l Glucoza g/l Nước chiết đậu trắng vừa đủ 1000ml Agar 20g/l Nước chiết đậu: 50g đậu trắng cho vào 200 ml nước cất, đun sôi 15 phút, lọc nước bổ sung nước cất cho đủ 1000 ml   ... danh số chủng vi khuẩn cố định đạm đất trồng lúa bị nhiễm mặn thực Từ mẫu đất trồng lúa bị nhiễm mặn từ tỉnh Tiền Giang, Kiên Giang, Bến Tre tiến hành phân lập 30 chủng vi khuẩn có khả cố định đạm. .. trồng 1.3 Nội dung thực Phân lập chủng vi khuẩn cố định đạm Khảo sát khả cố định nitơ môi trường chọn lọc để chọn chủng có khả cố định đạm mạnh Phân nhóm tuyển chọn chủng vi khuẩn có khả cố định. .. phẩm vi sinh cần thiết để mang lại hiệu sản suất nông nghiệp Trên sở đề tài: Phân lập tuyển chọn định danh số chủng vi khuẩn cố định đạm đất trồng lúa bị nhiễm mặn tiến hành 1.2 Yêu cầu đề tài Chọn