PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN CÁC DÒNG VI KHUẨN Arthrobacter CỐ ĐỊNH NITƠ TỰ DO TRÊN ĐẤT TRỒNG LÚA BỊ NHIỄM PHÈN

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN CÁC DÒNG VI KHUẨN Arthrobacter CỐ ĐỊNH NITƠ TỰ DO TRÊN ĐẤT TRỒNG LÚA BỊ NHIỄM PHÈN Ngành học : CÔNG NGHỆ SINH HỌC Sinh viên thực : NGUYỄN THỊ THU SƯƠNG Niên khóa : 2007 – 2011 Tháng /2011 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NƠNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN CÁC DÒNG VI KHUẨN Arthrobacter CỐ ĐỊNH NITƠ TỰ DO TRÊN ĐẤT TRỒNG LÚA BỊ NHIỄM PHÈN Hướng dẫn khoa học Sinh viên thực ThS TRƯƠNG PHƯỚC THIÊN HOÀNG KS TRẦN THỊ QUỲNH DIỆP Tháng 7/2011 NGUYỄN THỊ THU SƯƠNG LỜI CẢM ƠN Tôi xin chân thành cảm ơn: Ban Giám Hiệu trường Đại học Nơng Lâm Thành phố Hồ Chí Minh, Ban chủ nhiệm môn Công nghệ Sinh học, tất quý Thầy Cô truyền đạt kiến thức cho suốt trình theo học trường ThS Trương Phước Thiên Hồng hướng dẫn, giúp đỡ tơi suốt thời gian làm đề tài tốt nghiệp KS Trần Thị Quỳnh Diệp người theo sát, hướng dẫn tơi tận tình suốt thời gian làm đề tài Các Thầy Cô giáo anh chị Viện Cơng nghệ Sinh học Mơi Trường tận tình giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi cho suốt thời gian làm đề tài tốt nghiệp Toàn thể lớp DH07SH tận tình chia sẻ, động viên tơi suốt trình học tập làm đề tài tốt nghiệp Con cảm ơn ba mẹ nuôi dưỡng tạo điều kiện tốt cho học tập chỗ dựa tinh thần để vững bước đường đời Thành phố Hồ Chí Minh, tháng năm 2011 Nguyễn Thị Thu Sương i   TÓM TẮT Trong khí nitơ nguyên tố dồi nhất, chiếm khoảng 78,16% thể tích khơng khí Tuy nhiên, thiếu hụt nitơ lại vấn đề dinh dưỡng phổ biến ảnh hưởng đến trồng tồn giới nitơ khơng khí phân tử gần trơ (N2) mà trông sử dụng trực tiếp cho trình sinh trưởng, phát triển sinh sản Thực vật đồng hóa nitơ trực tiếp từ dạng muối nitrate Những dạng nitơ diện đất từ lớp trầm tích tự nhiên, phân bón nhân tạo, chất thải động vật, trình phân hủy hữu Vì vậy, việc bón phân đạm cho mang lại suất cao, đáp ứng cho ngành nông nghiệp đại, nhu cầu phân đạm tiếp tục tăng đáng kể dân số nhu cầu lương thực toàn cầu tăng Tuy nhiên, việc sử dụng phân bón có chứa nitơ thường xuyên có tác động tiêu cực mơi trường chẳng hạn góp phần vào ấm lên tồn cầu, gây nên tình trạng nitrat hóa q mức nhiễm nguồn nước Nhằm bắt kịp xu phát triển sinh thái bền vững đáp ứng nhu cầu đạm tiến hành thực đề tài: “Phân lập chọn lọc dòng vi khuẩn Arthrobacter cố định nitơ tự đất trồng lúa bị nhiễm phèn” Để thực đề tài sử dụng phương pháp thu thập mẫu, phương pháp phân lập, làm thuần, phương pháp Kjeldahl, thử sinh hóa nhuộm Gram, nhằm thu nhận chủng vi khuẩn cố định nitơ tốt cho trồng Với phương pháp thu nhận 20 chủng Arthrobacter hai chủng A5, A6 có khả cố định đạm cao với hàm lượng đạm 0,089% 0,072% Thời gian tối ưu cho trình cố định đạm hai chủng A5, A6 ngày Và rỉ đường nguồn cung cấp cacbon thích hợp cho mơi trường tăng sinh khối cố định đạm hai chủng A5, A6 tiến hành sản xuất quy mô lớn với tỉ lệ 2% Hai chủng vi khuẩn có khả chịu pH thấp SUMMARY Nitrogen is one of the most abundant elements on Earth, constituting 78,16% by volume of the atmosphere However, nitrogen deficiency is probably the most common nutritional problem affecting plants worldwide because atmospheric gaseous nitrogen is present as almost inert nitrogen (N2) molecules that is not directly available to the plants that need it to grow, develop and reproduce Plants are just able to assimilate nitrogen directly in the form of nitrates that may be present in soil from natural mineral deposits, artificial fertilizers, animal waste, or organic decay Thus, nitrogen fertilizers enable farmers to achieve the high yields that drive modern agriculture, and the demand for it will continue to increase substantially as global population and food requirements grow However, the use of nitrogen fertilizers also frequently has negative impacts on the environment such as contributing to global warming and resulting in excess nitration and contamination of water supplies The thesis “Isolation and selection of Arthrobacter strains capable of fixing nitrogen in acidizing rice-cultivated soil” was conducted to meet the growing demand for nitrogen in agriculture in sustainable way The Arthrobacter strains possessing highest nitrogen-fixing activity were obtained by using a variety of established methods including sample collection, isolation of pure cultures, Kjeldahl method, biochemistry testing and Gram staining Among twenty strains of Arthrobacter isolated in this study, we selected two strains A5 and A6 that were capable of fixing nitrogen with high nitrogen contents, respectively 0,089% and 0,072% The optimal fixation of these two strains was at five days and molasses was found to be the most appropriate source of carbon for biomass production and nitrogen fixation of these two strains, when conducting large-scale production at a rate of 2% These two strains were able to survive at low pH iii   MỤC LỤC Trang LỜI CẢM ƠN I TÓM TẮT II SUMMARY III MỤC LỤC IV DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT .VII DANH SÁCH CÁC BẢNG VIII DANH SÁCH CÁC HÌNH IX CHƯƠNG MỞ ĐẦU 1.1 ĐẶT VẤN ĐỀ 1.2 YÊU CẦU ĐỀ TÀI 1.3 NỘI DUNG THỰC HIỆN CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU .3 2.1 ĐạI CƯƠNG VỀ VI KHUẨN CỐ ĐỊNH NITƠ TỰ DO 2.1.1 VI KHUẨN CỐ ĐỊNH NITƠ TỰ DO (TRẦN CẨM VÂN, 2001) 2.1.2 ARTHROBACTER .3 2.2 QUÁ TRÌNH CỐ ĐỊNH NITƠ .4 2.2.1 VỊNG TUẦN HỒN NITƠ TRONG TỰ NHIÊN 2.2.2 CỐ ĐỊNH NITƠ TRONG TỰ NHIÊN 2.2.3 SẢN XUẤT NITƠ TRONG CÔNG NGHIỆP 2.2.4 CỐ ĐỊNH NITƠ NHỜ VI SINH VẬT .6 2.3 QUÁ TRÌNH TỔNG HỢP VÀ PHÂN GIẢI CÁC HỢP CHẤT CHỨA NITƠ 2.3.1 Q TRÌNH AMƠN HĨA 2.3.2 Q TRÌNH NITRAT HĨA .7 2.3.3 QUÁ TRÌNH PHẢN NITRAT 2.3.4 QUÁ TRÌNH CỐ ĐỊNH N2 2.4 VAI TRÒ CỦA NITƠ ĐỐI VỚI THỰC VẬT .8 2.5 MỘT SỐ NGHIÊN CỨU TRONG VÀ NGOÀI NƯỚC .9 2.5.1 MỘT SỐ NGHIÊN CỨU TRONG NƯỚC .9 2.5.2 MỘT SỐ NGHIÊN CỨU TRÊN THẾ GIỚI 10 CHƯƠNG VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .12 3.1 THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM .12 3.2 VẬT LIỆU, DỤNG CỤ, THIẾT BỊ VÀ HÓA CHẤT .12 3.2.1 MẪU ĐẤT PHÂN LẬP .12 3.2.2 DỤNG CỤ VÀ THIẾT BỊ 13 3.2.3 HÓA CHẤT .13 3.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .13 3.3.1 PHÂN LẬP VÀ LÀM THUẦN 13 3.3.1.1 LẤY MẪU .13 3.3.1.2 PHÂN LẬP VÀ CHỌN LỌC 14 3.3.1.3 LÀM THUẦN VI KHUẨN 14 3.3.2 BẢO QUẢN GIỐNG VI KHUẨN 14 3.3.3 ĐỊNH DANH VI KHUẨN .14 3.3.3.1 ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁI .14 3.3.3.2 NHUỘM GRAM .14 3.3.3.3 ĐẶC ĐIỂM SINH HÓA .14 3.3.4 ĐỊNH LƯỢNG NITƠ TỔNG SỐ BẰNG PHƯƠNG PHÁP KJELDAHL 17 3.3.5 KHảO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA THỜI GIAN, NGUỒN CACBONHYDRATE LÊN KHẢ NĂNG CỐ ĐỊNH NITƠ CỦA CÁC CHỦNG VI KHUẨN 19 3.3.6 KHẢO SÁT KHẢ NĂNG CHỊU AXIT CỦA CÁC CHỦNG VI KHUẨN CHỌN LỌC 19 3.3.7 XỬ LÝ SỐ LIỆU .20 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .21 4.1 KẾT QUẢ PHÂN LẬP VÀ LÀM THUẦN 21 4.2 KẾT QUẢ QUAN SÁT HÌNH THÁI, NHUỘM GRAM VÀ SINH HÓA 22 4.2.1 KẾT QUẢ QUAN SÁT HÌNH THÁI 22 4.2.2 KẾT QUẢ NHUỘM GRAM VÀ SINH HÓA .23 v   4.3 KẾT QUẢ XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG ĐẠM TỔNG SỐ BẰNG PHƯƠNG PHÁP KJELDAHL .25 4.4 KẾT QUẢ KHẢO SÁT THỜI GIAN TỐI ƯU CHO QUÁ TRÌNH CỐ ĐỊNH NITƠ .26 4.5 KẾT QUẢ KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA NGUỒN CACBONHYDRATE LÊN QUÁ TRÌNH NHÂN SINH KHỐI VÀ CỐ ĐỊNH NITƠ .27 4.5.1 KẾT QUẢ KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA CÁC NGUỒN ĐƯỜNG LÊN QUÁ TRÌNH NHÂN SINH KHỐI VÀ CỐ ĐỊNH NITƠ 27 4.5.2 KẾT QUẢ KHẢO SÁT TỈ LỆ RỈ ĐƯỜNG THÍCH HỢP NHẤT CHO QUÁ TRÌNH NHÂN SINH KHỐI VÀ CỐ ĐỊNH NITƠ CỦA CÁC CHỦNG VI KHUẨN CHỌN LỌC 28 4.6 KẾT QUẢ KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA MÔI TRƯỜNG AXIT LÊN KHẢ NĂNG TĂNG SINH KHỐI VÀ CỐ ĐỊNH ĐẠM 30 CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 32 5.1 KẾT LUẬN 32 5.2 ĐỀ NGHỊ .32 TÀI LIỆU THAM KHảO 33 PHỤ LỤC Hàm lượng đạm tổng số ( %) canh trường nuôi cấycủa chủng A5, A6 qua thời gian khảo sát a Chủng A5 b Chủng A6 Ghi chú: 1, 2, 3, 4, 5, 6, cột ứng với 2, 3, 4, 5, 6, 7, ngày Hàm lượng đạm tổng số canh trường nuôi cấy chủng A5, A6 với nguồn cacbonhydrate a Chủng A5 b Chủng A6 Ghi chú: 1, 2, 3, 4, cột carbonhydrate ứng với Sucrose, Glucose, Lactose, Saccharose, Rỉ đường  Hàm lượng đạm tổng số (%) canh trường nuôi cấy chủng A5, A6 với hàm lượng rỉ đường khác a Chủng A5 b Chủng A6 33    Ghi chú:1, 2, 3, 4, cột rỉ đường ứng với tỉ lệ 0,5 %, %, 1,5 %, 2%, 2,5 % rỉ đường Hàm lượng đạm tổng số (%) canh trường nuôi cấy chủng A5, A6 với pH acid a Chủng A5 b Chủng A6 Ghi chú: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 cột pH ứng với giá trị pH 2; 2,5; 3; 3,5; 4; 4,5; 5; 5,5; 6; 6,5; 7; 7,5 ... tự đất trồng lúa bị nhiễm phèn? ??   1.2 Yêu cầu đề tài ƒ Phân lập chọn lọc dịng Arthrobacter có khả cố định nitơ tự đất trồng lúa bị nhiễm phèn ƒ Khảo sát số phản ứng sinh hóa nhuộm Gram ƒ Xác định. .. CƯƠNG VỀ VI KHUẨN CỐ ĐỊNH NITƠ TỰ DO 2.1.1 VI KHUẨN CỐ ĐỊNH NITƠ TỰ DO (TRẦN CẨM VÂN, 2001) 2.1.2 ARTHROBACTER .3 2.2 QUÁ TRÌNH CỐ ĐỊNH NITƠ .4 2.2.1 VỊNG TUẦN HỒN NITƠ... vật cố định đạm đất phèn để bổ sung vào chế phẩm vi sinh điều cần thiết để mang lại hiệu cao nơng nghiệp Trên sở tiến hành đề tài: ? ?Phân lập tuyển chọn dòng vi khuẩn Arthrobacter cố định nitơ tự