Luận văn tốt nghiệp với đề tài Phân lập vi khuẩn Bacillus Subtilis từ đất, khảo sát khả năng ức chế sản sinh Aflatoxin của các chủng phân lập được có mục tiêu phân lập tìm ra chủng Bacillus Subtilis có khả năng ức chế Aflatoxin để có ứng dụng trong bảo quản nguyên liệu, thức ăn gia súc thành phẩm.
Trang 1- BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀOTẠO
TRUONG DAI HOC NONG LAM TP HO CHI MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC
KHÓA LUẬN TÓT NGHIỆP
PHAN LAP VI KHUAN BACILLUS SUBTILIS TU DAT, KHAO SAT KHA
Trang 2- BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀOTẠO _
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HỊ CHÍ MINH BỘ MƠN CÔNG NGHỆ SINH HỌC
KHÓA LUẬN TÓT NGHIỆP
PHAN LAP VI KHUAN BACILLUS SUBTILIS TU DAT, KHAO SAT KHA NANG UC CHE SAN SINH AFLATOXIN
CUA CAC CHUNG PHAN LAP ĐƯỢC
Giáo viên hướng dẫn: Sinh viên thực hiện:
Trang 3LỜI CẢM TẠ
Mãi khắc ghi công ơn sinh thành, nuôi nắng, dạy dỗ của ba, má và những người
thân trong gia đình đã cho con có được ngày hôm nay
Chân thành cảm ơn
Ban chủ nhiệm bộ môn Công Nghệ Sinh Học cùng toàn thể quý thầy cô đã
tận tình dạy bảo và truyền đạt kiến thức cho em trong suốt thời gian học tập tại trường Chân thành biết ơn sâu sắc đến các quý thầy cô
Ts Nguyễn Ngọc Hải
Ts Lê Anh Phụng
Cô Nguyễn Thị Kim Loan
đã tận tình chỉ bảo và giúp đỡ em trong suốt thời gian thực hiện đề tài Chân thành cảm
ơn toàn thể bạn bè đã động viên, chia sẽ và giúp đỡ tôi trong suốt thời gian học tập và thực hiện đề tài
Trang 4TÓM TẮT LUẬN VĂN
Qua thời gian thực hiện đề tai “Phan lap vi khuan Bacillus subtilis từ đất,
khảo sát khả năng ức chế sản sinh aflatoxin của các chủng phân lập được.” từ
tháng 3/2007 đến tháng 8/2007 tại Phòng thực hành Vi Sinh khoa Chăn Nuôi-Thú Y, chúng tôi có những kết luận sau:
- Có thé phân lập được vi khuẩn Bacillus subrilis từ đất với tỷ lệ 8,16 %
- Đánh giá sơ bộ khả năng ức chế aflatoxin của các chủng vi khuan Bacillus subtilis
phân lập được từ đất trên môi truờng thạch nước cốt đừa: sau 7 ngày nuôi cấy chung Bacillus subtilis và Aspergillus flavus trên môi trường thạch nước cốt dừa, quan sát bên
ngoài và đưới ánh đèn tia cực tím (UV) cho thấy một số chủng có khả năng ức chế sinh
trưởng và sản sinh aflatoxin của nấm méc Aspergillus flavus
- Khảo sát khả năng ức ché san sinh aflatoxin của các chủng vi khuan Bacillus subtilis phân lập được từ đất: môi trường bắp sau 7 ngày nuôi cấy bào tử nắm mốc và bào tử vi
khuẩn , ghi nhận một số chủng có khả năng làm giảm aflatoxin trên môi trường bắp so với mẫu đối chứng chỉ có bào tir Aspergillus flavus khéng cé bao tit Bacillus subtilis - Khảo sát tỷ lệ nudi cy gitra bao tir ndm méc/bao tir vi khudn Bacillus subtilis anh hưởng đến khả năng sản sinh aflatoxin trên môi trường bắp phối trộn tỷ lệ bào tử nắm
mốc/bảo tử vi khuẩn là 1/10, 1/10” và 1/10” Sau 7 ngày nuôi cấy cho thấy khi tỷ lệ
bào tử vi khuẩn tăng lên thì tăng khả năng làm giảm aflatoxin
- Nguyên liệu bap nhiém aflatoxin có xử lý với vi khuẩn Bacillus subtilis gây chết vịt ít hơn nguyên liệu bắp nhiễm aflatoxin nhưng không xử lý với vi khuẩn
Trang 5SUMMARY
The thesis: “ Isolation of Bacillus subtilis in soil and survey their ability in inhibition of aflatoxin production by Aspergillus flavus on maize.” The thesis
Bacillus subtilis in inhibition of aflatoxin production by Aspergillus flavus on maize and in protection of duck frome aflatoxin infection was carried out in Microbiology and Infections Diseases Department of Freulty of Animal sciences and Veterinary, Nong Lam University, Ho Chi Minh cty frome 03/2007 to 08/2007
The results showed:
- Bacillus subtilis could inhibite the aflatoxin production of Aspergillus flavus on maize in times
- Bacillus subtilis treatment could reduce the neortility rate, health affect of the
Trang 6MỤC LỤC CHƯƠNG TRANG Trang bìa 1 Trang bìa 2 LỜI CẮM TẠ 5 5 5253339193911 9 1 1 1 1101 0103100 cng ve r iii
DANH MUC CAC HINH scssssscccceeessssececcccessessneececeeeesesascsneessesees xi DANH MUC CAC SO DO sssssscccccessssseccccecessssneececceeesseneeecesseecsnees xii I6) v09.) 03000777 xiii 1 0671070077 1 1.1 ĐẶT VẤN ĐỀ G900 900030 001 00090552083 58083800180 xsz 1 ¡2,10 0101196 ›)560 1000775 1.3 YEU CAU ĐÈ TÀII ( < G SE S359 3 99 9E 90981 re, r9 (c9) 907 2.1 KHÁI QUÁT VÈ VI KHUÂN BACILLUS SUBTILIS 2.1.1 Lịch sử phát hiện - - -< «<< c< c5 << 2.1.2 Đặc điểm phân loại và sự phân bố của vi khuẩn Bacillus subfilis
Trang 72.1.5 Đặc điểm sinh hóa
2.1.6 Đặc điểm cấu trúc kháng nguyên - - - «+ «css «+ se ssseesssesssssssss 6
2.1.7 Bào tử vi khuẩn acillws swbfilis 55 < 5< se eeeeeeeeeeceeeeeccee ƒ
PA N6 n ố ốốẽ ẻ 7
2.1.7.2 Đặc điểm và tác dụng của bào tử - <s«seesssessssssesssseesse.Ÿ 2.1.8 Tính chất đối kháng của Bacilus subiilis với vi sinh vật gây bệnh 9 2.1.9 Những nghiên cứu vé tac dung d6 khang Aspergillus ciia Bacillus subtilis 11
2.2 KHÁI QUÁT VẺ NÁM MÓC SINH ĐỘC TÓ AFLATOXIN 12
2.2.1 Khái niệm về nắm mốc - - «<< «+ + 253 9E3sEESssessse + s szssee 12 2.2.2 Các loài nắm mốc sinh độc tố aflatoxin -« -ssccsseccsssesseess- 2 2.2.3 Dc t6 aflatoxim cccccccsssssssscccceeessssssecssscssnsecssecssssssssesssessssseesseeesseel 3 2.2.3.1 Các loại độc tố aflatoxin - cesccesessssrsessersssetsssersssessssessssee 3 2.2.3.2 Cơ chế gây bệnh của aflafoxin - -«««c-ssecessseessessssesssseessseesssssee [4 2.2.3.3 Những tác hại do aflatoxin gây ra - -<-<esse«eseseseesessseesesese l4
2.2.3.4 Các phương pháp phân hủy afÏafoxin ‹ -< = « « e<«<«eses 15 3 NOI DUNG VA PHƯƠNG PHÁP TIẾN HÀNH - s< ss<ssse 19 3.1 THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIÊM -2°s2ssEvsseEvsstrvaserrasersaserrsssrre 19
3.1.1 Thời gÏann .o-5-< << 5< ch HH nH 0008040000004000040004000000000006 19
3.1.2 Dia mẽ ẽẽ 19 k»;0w909) (e4: 7v 19 3.3 THIẾT BỊ DỤNG CỤ THÍ NGHIỆM . se s°vssvssessssesse 19 3.4 MÔI TRƯỜNG NUÔI CÁ Y - 2° EEvvradeeetttrtrrrrrrrrrrrrdie 20
3.4.1 Môi trường tự nhiên - << << «<< 9913 68980803889000808 5m 20
3.4.2 Môi trường tông hợpp -s°-essveseESrvxseE+rxeteorveenorrsetnsrxeeensrxee 20
Trang 83.5 NỘI DUNG
3.6 PHƯƠNG PHÁP TIỀN HÀNH NGHIÊN CỨU -ccee 20 3.6.1 Phân lập vi khuẩn Bacillus subiilis từ đẤT « ccccceeesseoeee 20
3.6.1.1 Cách lấy mẫu đắt để phân lập vi khuẩn - «se 20
3.6.1.2 Phương pháp phân lập vi khuẩn Bacilius subfilis . <« 21 3.6.2 Khảo sát đặc điểm sinh học của vi khuẩn phân lập được 21
3.6.2.1 Quan sát hình thái vi khuẩn dưới kính hiễn vi cccc-ee 21
3.6.2.2 Khảo sát các phản ứng sinh hóa của vi khuẩn phân lập được 22
3.6.3 Thí nghiệm 1: Kiểm tra khả năng sinh aflatoxin của chủng nắm mốc Aspergillus flavus va danh giá sơ bộ khả năng ức chế sản sinh aflatoxin của các
chủng Bacilius subíilis phân lập ÑưỢC 5-5-5 555 S12 s28 s sms 22 3.6.3.1 Kiếm tra khả năng sinh aflatoxin của chủng nắm mécAspergillusflavus 22 3.6.3.2 Thí nghiệm đánh giá sơ bộ khả năng ức chế sản sinh aflatoxin của các chủng Bacilius subfilis phân lập được . << {c1 23 3.6.4.Thí nghiệm 2: Khảo sát khả năng làm giảm aflatoxin sản sinh trên môi trường bắp của các chủng vi khuẩn Bacillus subfilis phân lập được 2⁄3
3.6.4.1 Phương pháp thu hoạch và xác định số lượng bào tử nắm mốc
ASD€TBIÏÏHS ƒÏVHS -c œ< SG Ăn 9 9 000.019 000 23 3.6.4.1.1 Phương pháp thu hoạch bào tử nắm mốc Aspergillus fÏayus 23 3.6.4.1.2 Phương pháp xác định số lượng bào tử nắm mốc
AspergiÏÏUs ÏIVIS - -œ «có 0001000 24 3.6.4.2 Phương pháp thu hoạch và xác định số lượng bào tử vi khuẩn
ĐACHllUs SUPẨÏHS 555555 =s=sseSeSsEeteStStttttststStstststtstE1115.000000000000000000000908 24 3.6.4.2.1 Phương pháp thu hoạch huyễn dịch bào tử vi khuẩnBacillus subfilis 24
Trang 93.6.4.2.2 Phương pháp xác định số lượng bào tử vi khuẩn Bacillus subfilis 25
3.6.4.3 Bố trí thí nghiệm
3.6.4.3.1 Xử lý nguyên liệu bắp ban đầu trước khi tiến hành thí nghiệm 26 3.6.4.3.2 Nuôi cấy chung bào tử vi khuẩn Bacillus subiilis và bào tử nắm
Aspergillus flavus trên môi trường nguyên liệu bắp -s-s<s<ss<s 26 3.6.5 Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ bào tử nấm mốc /bào tử vi khuẩn đối với sự sản sinh afÏaf0Xin -s- «se +sseEvsseevsseeszssersaserssserse 27
3.6.5.1 Phương pháp thu hoạch và xác định số lượng bào tử nắm mốc
Aspergillus [Ï(TVIM S << << E11 11 HH 0 0 0000.0089008 000010000008 28 3.6.5.2 Phương pháp thu hoạch và xác định số lượng bào tử vi khuẩn
Bacillus SLỤÍÏÏS o5 << 9 9 TH 0.00001000000060 8000 0800 0e 28
3.6.5.3 Bồ trí thí nghiệm s-ssss©+2ss©E+seE2Va©2VAE22A92249927399273992239900298A 28
3.6.6 Thí nghiệm 4: Thử mức độ an toàn của ngưyên liệu bắp đã nhiễm
aflatoxin sau khi xử lý bằng vi khuẩn Baciilus subfilis (có khả năng ức chế
aflatoxin) tréN VẬK 5-5 5< «<< Họ 0 0000101009000 0080808 29
3.7 PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH MẪU + < + «+ £££seeee 30 3.8 PHƯƠNG PHÁP XỨ LÝ SÓ LIIỆU -2- 2< s<ssvsseevsseevssecse 30
[43/90/0260 9.7(0000/09) 070 31
4.1 KHAO SÁT ĐẶC ĐIÊM SINH HỌC CỦA B4CILLUS SUBTILIS 31
4.1.1 Quan sát đặc điểm khuẩn lạc nghỉ ngờ là Bacillus subfilis 31 4.1.2 Đặc điểm hình thái của vi khuẩn nghỉ ngờ là Bacillus subtilis sau
nhuộm Gram - .-‹ -«< = « = + + 3050808008008 090 1909 809 809 609 0 8 89 0m 32 4.1.3 Khảo sát các đặc điểm sinh hóa của vi khuẩn nghỉ ngờ là Bacillussubiilis 32
Trang 104.2.THÍ NGHIỆM 1: KIỀM TRA KHẢ NĂNG SINH AFLATOXIN CỦA
CHUNG NAM MOC ASPERGILLUS FLAVUS VA DANH GIA SO BO KHA NANG UC CHE SAN SINH AFLATOXIN CUA CAC CHUNG
BACILLUS SUBTILIS PHÂN LẬP ĐƯỢC sessseecovvseseossrree 35
4.2.1 Kiểm tra khả năng sinh khả năng sinh aflatoxin của chủng nắm mốc
Aspergillus [Ï(TVIM(S o5 << << E11 1 HH 00101 0 00000040.009800808.008000000000 080 35 4.2.2 Thí nghiệm đánh giá sơ bộ khả năng ức chế sản sinh aflatoxin của các chủng Bacilius subfilis phân lập được -. c cG SH nu mm 35 4.3 THÍ NGHIỆM 2 : KHẢO SÁT KHẢ NĂNG LAM GIAM AFLATOXIN
SAN SINH TREN MOI TRUONG BAP CUA CAC CHUNG BACILLUS
SUBTILIS PHAN LAP DUQC cccesessssscccceeesssseeceecccseensneececeseessseess 38 4.4 THi NGHIEM 3: KHAO SAT ANH HUONG CUA TY LE BAO TU
NAM MOC/BAO TU VI KHUAN DOI VOI SU SAN SINH AFLATOXIN 40
4.5 THi NGHIEM 4: THU MUC BO AN TOAN CUA NGHUYEN LIEU BAP DA NHIEM AFLATOXIN SAU KHI XU LY BANG VI KHUAN BACILLUS SUBTILIS (CO KHA NĂNG ỨC CHÉ AFLATOXIN) TRÊN VỊT NUÔI 43
LŠ‹yän A0060 48
LEN‹š¿0n/ 9 48
“0090010057 ^ 48
Trang 11Viết tắt ADN ARN CFU ppb TLC UV DANH MỤC CÁC CHU VIET TAT Nguyên chữ Acid Deoxyribonucleic Acid Ribonucleic
Colony Formation Unit part per billion
Trang 12DANH MUC CAC BANG
Trang
Bảng 2.1 Các phản ứng sinh hóa của Bacillus sufiÏis 6 Bảng 2.2 Sự khác nhau giữa bào tử và tế bào dinh dưỡng của Bacillus subtilis 8
Bang 2.3: Số lượng của Escherichia coli sau 0 giờ, 12 giờ, 24 giờ và 36 giờ nuôi cây (CFU/ml) Bảng 2.4: Khả nang tre ché aflatoxin B, cia các chủng vi khuan Bacillus subtilis trong thí nghiệm của Norio Kimura - - - - Bảng 2.5: Một số loài nắm mốc có khả năng sản sinh aflatoxin Bảng 3.1: Bố trí thí nghiệm nghiệm 2
Bang 3.2: Bố trí thí nghiệm 3 5 21111222 ssssxy 28
Bảng 4.1: Kết quả thử phản ứng sinh hóa của các chủng phân lập được 33 Bảng 4.2: So sánh khả năng ức chế sản sinh aflatoxin của 8 chủng Bacillus subtilis 38 Bảng 4.3: Kết quả phân tích hàm lượng aflatoxin của thí nghiệm 2 39 Bảng 4.4: Kết quả thí nghiệm 3 2 2 221122222111 23212 Eserssesee 41
Bảng 4.5: Kết qua thí nghiệm 4 - s2 43 Bang 4.6: So sánh sự khác nhau về bệnh tích đại thể các mẫu gan VỊT 45 Bảng 4.7: Kết quả bệnh tích vi thể gan của vịt ở các lô thí nghiệm 46
Trang 13DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 2.1: Hình thái vi khuẩn Bacillus subtilis 555555 2555<<55<5© 5s <4
Hình 2.2: Bào ttr vi khuan Bacillus subtilis
Hình 3.1: Nuôi cấy bào tử vi khuẩn và bào tử nắm mốc trên môi trường bắp 28
Hình 4.1: Khuẩn lạc nghỉ ngờ Bacillus subtilis trên môi trường TSA „31
Hình 4.2: Hình dạng tế bao và bào tử của Bacillus subiilis sau khi nhuộm Gram 32
Hình 4.3: Kết quả các phản ứng sinh hóa xác định Bacillus subtilis - 34
Hình 4.4: Khun lac Aspergillus flavus sau 5 ngày nuôi cây trên môi trường 019/00/22), NA 35
Hình 4.5: Khun lac Aspergillus flavus tiép xúc và chưa tiếp xúc với khuẩn lạc Bacillus subtilis trên môi trường thạch nước cốt dừa
Hình 4.6: Sự ức chế phát triển của khuẩn lạc vi khuẩn đối với nắm mốc 36
Hình 4.7: Vòng sáng aflatoxin không đều ở các phía của khuẩn lạc
ASD€T.SiÏÏLLS ,[Ï(1VILS 5 xxx TT nh TT TT nhe 37 Hinh 4.8: So sánh các mẫu bắp 42
Hình 4.9: Kết quả thí nghiệm lô 2 sau 4 ngày ¿+52 2 +22 ***++ssssce2 44 Hình 4.10: Sự khác nhau giữa 2 mẫu gan vịt ‹- 5c sc c2 22+ ssse 45 Hình 4.11: Bệnh tích vi thể các mẫu gan vịt ở các lô thí nghiệm - 47
Trang 14DANH MỤC CÁC SƠ ĐÒ
Sơ đồ 3.1: Các phản ứng sinh hóa của vi khuân Bacillus subiilis
Sơ đồ 3.2: Phương pháp thu hoạch huyén dich bao tir Bacillus subtilis Sơ đồ 3.3: Phương pháp xác định số lượng bào tir Bacillus subtilis
Trang 15Chương 1
MỞ ĐẦU
1.1 ĐẶT VẤN ĐÈ
Mycotoxin hay độc tố nắm mốc là một trong những nhóm độc chất tự nhiên do các loài nắm mốc sản xuất ra trong quá trình phát triển trên các cơ chất, đặc biệt là
lương thực, thực phẩm dành cho con người và gia súc Người ta đã phát hiện khoảng
3000 loại mycotoxin nhưng độc tố quan trọng nhất cho đến hiện nay 1a aflatoxin do
nam mốc Aspergillus sản sinh Aflatoxin khong chi là độc tố gây nhiễm độc, gây rối
loạn chức năng, gây suy giảm miễn dịch, thoái hóa gan thận mà còn gây chết gia súc,
gia cầm trong trường hợp nhiễm độc hàm lượng lớn Aflatoxin cũng được chứng minh
là chất độc gây ung thư cho động vật thí nghiệm Trong điều kiện nhiệt độ và độ âm thích hợp của nước ta, nếu không được bảo quản tốt thì các loại nguyên liệu cũng như thức ăn gia súc thành phẩm rất dễ bị nhiễm các loại nắm mốc sinh aflatoxin Một khi điều đó xảy ra sẽ gây tôn thất rất lớn cho nhà chăn nuôi, ngành chăn nuôi nước nhà và
nguy hiểm hơn là ảnh hưởng gián tiếp đến sức khỏe của người tiêu dùng sản phẩm
chăn nuôi
Xuất phát từ tình hình thực tế đó, đã có nhiều nghiên cứu khoa học trong và
ngoài nước được tiến hành nhằm giải quyết vấn đề này: như dùng nhiệt độ, ánh sáng, chất oxy hóa dé làm mất hiệu lực của aflatoxin, Một trong những xu hướng hiện nay
Trang 16Rhizopus arrhizus), vi khuân (Bacillus subtilis, Bacillus pulimus), nom men (Saccharomyces cerevisiae), xa khuẩn đã được thử nghiệm về khả năng làm giảm aflatoxin thu được kết quả cũng rất khả quan
Được sự phân công của Bộ Môn Công Nghệ Sinh Học trường Đại học Nông
Lâm Tp.HCM, sự cho phép của phòng vi sinh Khoa Chăn Nuôi-Thú Y và dưới sự
hướng dẫn của thầy Nguyễn Ngọc Hải, chúng tôi tiến hành đề tài: “ Phân lập vi
khudn Bacillus subtilis tir dit, khảo sát khả năng ức chế sản sinh aflatoxin của các chủng phân lập được.”
1.2 MỤC TIÊU ĐÈ TÀI
Phan lap, tim ra chung Bacillus subtilis c6 kha nang tr chế afltoxin dé có thé
ứng dụng trong bảo quản nguyên liệu, thức ăn gia súc thành phẩm
1.3 YÊU CẦU ĐÈ TÀI
- Phân lập vi khuan Bacillus subtilis tir dat
- Khảo sát khả năng ức ché san sinh aflatoxin của chủng vi khuẩn phân lập được
- Khảo sát khả năng ức chế aflatoxin theo tỷ lệ nuôi cấy giữa bào tử của nắm
mốc và bảo tử vi khuẩn Bacillus subtilis
Trang 17Chương 2
TONG QUAN
2.1 KHAI QUAT VE VI KHUAN BACILLUS SUBTILIS 2.1.1 Lịch sử phát hiện
Bacillus subtilis được phát hiện đầu tiên trong phân ngựa năm 1941 bởi tổ chức
y học Nazi của Đức Lúc đầu được sử dụng chủ yếu là để phòng bệnh ly cho các binh sĩ Đức chiến đấu ở Bắc Phi.Việc ứng dụng điều trị phải đợi tới những năm 1949 - 1957
khi Henrry, Albot và các cộng sự tách được các chủng thuần khiết của Bacillus subiilis Từ đó “subtilis therapy “ có nghĩa là thuốc subtilin ra đời trị các chứng viêm ruột, viêm đại tràng, chống tiêu chảy trong rối loạn tiêu hóa Ngày nay, vi khuẩn này đã trở nên rất phổ biến, được sử dụng rộng rãi trong y học, chăn nuôi, (trích dẫn bởi Lê Văn Hiệp,
2004)
2.1.2 Đặc điểm phân loại và sw phan bé ciia vi khuan Bacillus subtilis
2.1.2.1 Đặc điểm phân loại
Trang 182.1.2.2 Đặc điểm phân bố
Vi khuan Bacillus subtilis thuéc nhom vi sinh vật bắt buộc của đường ruột, chúng được phân bố hầu hết trong tự nhiên như: cỏ khô, bụi, đất, nước, Phần lớn chúng tồn tại trong đất, thông thường đất trồng trọt chứa khoảng 10 - 100 triệu CFU/g Đất nghèo dinh dưỡng ở sa mạc, đất hoang thi Bacillus subtilis rat hiếm
Nước và bùn ở cửa sông cũng như nước biển có sự tồn tại của bào tử và tế bao sinh đưỡng vi khuân Bacillus subtilis 2.1.3 Đặc điểm hình thái wW seb Mẹ “⁄^S» \ mg ; : here Nw Hình 2.1: Hinh thai vi khuan Bacillus subtilis (http://en.wikipedia.org/wiki/Sporulation)
Vi khuẩn Bacillus subrilis có dạng trực khuẩn nhỏ và ngắn, hai đầu tròn, bắt màu Gram dương, kích thước 0,5 - 0,8 um x 1,5 - 3 um, thường đứng đơn lẻ hoặc tạo thành chuỗi ngắn Vi khuẩn có khả năng di động, có từ 8 - 12 chiên mao, sinh bảo tử
nhỏ hơn tế bao sinh dưỡng, kích thước 0,9 - 0,6 um Vi tri cua bao tir trong té bao sinh
dưỡng không theo một nguyên tắc chặt chẽ nào, có thể lệch tâm hoặc gần tâm nhưng không chính tâm (trích dẫn bởi Nguyễn Lân Dũng,1983)
2.1.4 Đặc điểm nuôi cấy
- Điều kiện nuôi cấy: hiếu khí, nhiệt độ tối ưu 370C
- Nhu cau O,: Bacillus subrillis là vì khuẩn hiếu khí nhưng có khả năng phát triển
Trang 19- Độ pH: Bacillus subtilis thich hgp nhat véi pH = 7 - 7,4
- Trên môi trường thach dia TSA: khuẩn lạc dang tron, ria rang cưa không đều, có tâm sm mau, phát triển chậm, màu vàng sám, đường kính 3 — 5 mm Sau 1 - 4 ngày bề mặt nhăn nheo, màu hơi sắm
- Trên môi trường thạch nghiêng TSA: dễ mọc, tạo thành màu hơi xám, rìa gon
song
- Môi trường canh TSB: Bacillus subtilis phát triển làm đục môi trường, tạo màng nhăn trên bề mặt môi trường canh, lắng cặn kết lại như vẫn mây ở đáy, khó tan đều
khi lắc lên
- Dinh dưỡng: cần các nguyên tố C, H, O, N và các nguyên tố khác 2.1.5 Đặc điểm sinh hóa
Lên men không sinh hơi các loại đường: glucose, maltose, manitol, saccharose,
xylose, arabinose
Indol (-), nitrate (-), MR-VP (+), H2S (-), NH (+), catalase (+), amylase (+), casein (+), citrate (+), di động (+), hiếu khí (+)
Dung huyét: mét sé dong gay dung huyét trên thạch máu ngựa và thỏ do tác
Trang 20Bảng 2.1 Các phản ứng sinh héa cia Bacillus sutilis Phản ứngsinhhóa | Kết quả Hoạt tính catalase + Sinh indol MR VP Str dung citrate Khw nitrate Tan chay gelatin Di động Phân giải tinh bột Arabinose Xylose Saccharose Mannitol +] +) +] +] +] +) +] 4] +] +] +] + Glucose Lactose - Mantose + (Theo Holt, 1992)
2.1.6 Đặc điểm cấu trúc kháng nguyên
Bacillus subtilis có kháng nguyên H và O, cấu trúc kháng nguyên dạng D và L cua acid glutamic
Trang 212.1.7 Bao tir vi khudn Bacillus subtilis
Bào tử vi khuẩn là một kết cấu do sự biến đổi của tế bào sinh dưỡng trong một giai
đoạn nào đó của quá trình sinh trưởng của vi khuẩn Mỗi tế bào chỉ tạo thành một
bào tử (trích dẫn bởi Nguyễn Khắc Tuấn, 1996) X ĐÁ 8P `3 * 457) a kề - ` <: a Bào tử Hinh 2.2: Bao tir vi khudn Bacillus subtilis (http://en wikipedia.org/wiki/Sporulation) 2.1.7.1 Cấu tạo của bào tử
Ngoài cùng của bào tử là một lớp màng, dưới lớp màng là vỏ Vỏ bào tử có
nhiều lớp Đây là những lớp có tác dụng ngăn chặn sự thấm thấu của nước và các chất
hòa tan trong nước Dưới lớp vỏ là lớp màng trong của bào tử và trong cùng là một
khối tế bào chất đồng nhất Trong các bào tử tự do không tồn tại sự trao đổi chất, vì
Trang 22Bảng 2.2 Sự khác nhau giữa bào tử và tế bào dinh dưỡng của Bacillus subtilis
Đặc tính Té bào sinh dưỡng Bào tử
Câu trúc Tê bào G+, điên hình Vỏ bào tử dày, khó thâm nước
Thành phần hóa học
Canxi Thap Cao
Protein Thap hon Cao hon
Hoat tinh enzyme Cao Thap
Kha nang chiu nhiét Yêu Cao Chịu bức xạ Kém Mạnh Hoạt tính các chất hóa học | Yếu Cao và acid Khả năng bắt màu chất | Dễ nhuộm Phải dùng phương pháp đặc nhuộm biệt
(trích dẫn bởi Tô Minh Châu, 2000) 2.1.7.2 Đặc điểm và tác dụng của bào tử
Bào tử vi khuẩn không phải là một bộ phận làm chức năng sinh sản mà chỉ là một thể biến đổi của tế bào nhằm bảo tồn, đổi mới và nâng cao sức sống của vi khuẩn
Bào tử là một hình thức tiềm sinh của vi khuẩn, có sự đề kháng cao với các nhân tố bất
lợi của ngoại cảnh
Theo Nguyễn Xuân Thành và ctv (2005) thì sự tồn tại lâu dài của bào tử là do chúng có các đặc tính sau:
- Nước trong bào tử phần lớn ở trạng thái liên kết, do đó không có khả năng làm biến tính protein khi tăng nhiệt độ
- Do trong bào tử có một lượng lớn ion Ca”” và acid dipicolinic Protein trong
bào tử kết hợp với đipicolinat canxi tạo thành một phức chất có tính ổn định cao đối với nhiệt độ
Trang 23- Sự có mặt của các acid amin chứa lưu huỳnh, đặt biệt là cysteine giúp bào tử đề kháng với tia cực tím
- Với cấu trúc có nhiều màng bao bọc và tính ít thâm thấu của các lớp màng ,
làm cho các chất hóa học và các chất sát trùng khó có thể tác động đến bào tử
Khi gặp điều kiện thuận lợi, bào tử sẽ nảy mầm và phát triển thành một tế bào
mới có sức sống mạnh mẽ hơn (trích dẫn bởi Nguyễn Khắc Tuấn, 1996)
2.1.8 Tính chất đối kháng của Bacilius subfilis với vi sinh vật gây bệnh
Mỗi loài vi sinh vật khác nhau sẽ thích hợp ở điều kiện môi trường khác nhau, sinh khuân lạc khác nhau
Thay đổi môi trường hoặc các yếu tố môi trường bất lợi tức là thay đổi điều
kiện sống sẽ hạn chế hoặc ức chế sự phát triển của vi sinh vật Thực tế, khi môi trường nuôi cấy nấm bệnh có sự hiện diện của Bacillus subtilis với một số lượng lớn sẽ xảy ra
sự cạnh tranh chất đinh dưỡng, cạnh tranh không gian giữa vi khuẩn và nắm Do vi khuẩn phát triển nhanh hơn (trong 24 giờ) sẽ sử dụng phần lớn các chất dinh dưỡng
trong môi trường, đồng thời tạo ra một số loại kháng sinh nên sự sinh trưởng của nam
bị ức chế (Nguyễn Lân Dũng và Hoàng Đức Nhuận, 1976, trích dẫn Lý Kim Hữu, 2005)
Phương thức diệt nắm và các tác nhân gây bệnh của vi khuẩn Bacillus subtilis như sau:
- Đầu tiên vi khuan Bacillus subtilis tao thành khối xung quanh tác nhân gây bệnh ngăn chặn không cho chúng bám vào vật chủ để gây bệnh
- Sau đó, Bacillus tiết ra hỗn hợp gồm nhiều lipopeptid (được gọi là serenade)
để làm thủng vách tế bào và màng tế bào chất của tác nhân gây bệnh do đó ngăn chặn
sự phát triển của chúng Serenade có thể được bảo quản, sử dụng như một loại thuốc trừ sâu hóa học tổng hợp, đã được kiểm tra và chứng minh trong phòng thí nghiệm là
không gây độc đối với cá hồi, ong mật, chỉm cút, sâu đất và nhiều loài khác Serenade
gồm 3 nhóm lipopeptid có tên là surfactin, agrastatin và iturin Ba nhóm này kết hợp
với nhau để làm tăng hoạt tính diệt các mầm bệnh kể cả vi sinh vật gây hại, nắm mốc
Trang 2410
Surfactin là nhóm chất có hoạt tính sinh học, bản chất là lipopeptid Bản thân
surfactin không gây độc cho nấm nhưng khi kết hợp với iturin thì trở thành hợp chất
diệt nắm Surfactin có khả năng làm thủng vách tế bào của các tác nhân gây bệnh và bào tử của chúng, giúp cho agrastatin và iturin phát huy tác dụng
Agrastatin vừa mới được phát hiện, cũng có khả năng diệt nấm giống như surfactin và iturin
Iturin là nhóm chất chiếm vai trd quan trong hat trong quá trình diệt nắm, bản
chất là lipopeptide được chiết từ môi trường nuôi cấy vi khuẩn Bacillus subrilis Inturin diệt nắm bằng cách tác dụng lên màng tế bào chất, làm tan màng, tạo thành những lỗ
thủng trên đó đề làm mất tính thâm thấu chọn lọc của màng
Ngoài nắm gây bệnh ra thì Bacillus subtilis cũng đối kháng với vi khuẩn gây
bệnh như Escherichia coli Khi nuôi cây chung trên môi trường TSB thi Bacillus
subiilis có khả năng tổng hợp một số chất kháng sinh nên sẽ ức chế quá trình sinh trưởng và phát triển của Escherichia coli, điều đó được thê hiện trong bảng 2.3 qua số
lượng Escherichia coli sau 0 giờ, 12 giờ, 24 giờ và 36 giờ nuôi cấy (trích dẫn bởi Nguyễn Huỳnh Nam, 2006)
Bảng 2.3: Số lượng của Escherichia coli sau 0 giờ, 12 giờ, 24 giờ và 36 giờ nuôi cây (CFU/ml) Thời gian (giờ) 0 12 24 36 Mẫu Mẫu thí nghiệm 1 4,45.1019 29,80.10Ẻ 15,75.10 <10° 2 4,45.10° 19,95.10° 9,55.10 <10° 3 4,45.10" 17,26.10° 8,30.10 <10° 4 4.45.10!9 19,95.10° 13,67.10” <10° 5 4,45.10° 23,40.10Ẻ 2,60.10 <10° Mẫu đối chứng 4,45.10 | 22,15.10" 61,76.10"" 23.10” Ghi chú:
- Mau thi nghiém: mdi truéng TSB chira Bacillus subtilis va Escherichia coli
Trang 2511
2.1.9 Những nghiên ciru vé tac dung déi khang Aspergillus cia Bacillus subtilis
Trong nuớc
Nguyễn Đình Đào năm 1993 đã tiến hành kiểm tra khả năng đối kháng của ching Bacillus subtilis AO, v6i Aspergillus flavus va Aspergillus parasiticus va két quả là có sự ức chế nắm mốc Aspergillus (trích dẫn bởi Nguyễn Thị Ngọc Trân, 1995)
Nguyễn Hữu Phúc và cộng sự năm 1993 đã sử dụng vi khuẩn Bacillus subiilis dé ức chế sinh trưởng và sản xuất aflatoxin của Aspergillus flavus, Aspergillus parasiticus trén đậu phộng (trích dẫn bởi Lâm Thanh Thúy Trân, 1995)
Nguyễn Thị Ngọc Trân năm 1995 đã tiến hành kiểm tra khả năng đối kháng của
ching Bacillus subtilis AO, (do Trung tâm công nghệ sinh học thuộc liên hiệp sản xuất hóa chất cung cấp) với Aspergillus flavus trên môi trường thạch khoai tây-glucose và
kết quả đạt được rất khả quan Ngoài nước
Một số thí nghiệm về khả năng ức chế sinh tổng hợp aflatoxin của một số chủng vi khuẩn Bacillus subtilis đã được thực hiện với Aspergillus flavus và Aspergillus parasiticus
Norio Kimura (1990) da sir dung vi khudn Bacillus subtilis để ngăn chặn sự phát triển và sinh độc tố cua ching Aspergillus flavus va Aspergillus parasiticus trén dau
phộng và bắp Các chủng Bacillus subrilis NK330 và NK-C-3 ức chế mạnh mẽ sự phát
triển của nắm mốc và tống hợp aflatoxin
Trang 2612
Bảng 2.4: Khả năng ức chế aflatoxin B; của các chủng vi khuẩn Bacillus subfilis trong thí nghiệm của Norio Kimura
Ham luong aflatoxin B; (ppm)
Thời gian (ngày) 3 5 7 9
Đối chứng: Aspergillus flavus 4,8 63,9 43,8 37,6
Aspergillus flavus + BSNK C3 0 0 0 0
Aspergillus flavus + BSIAM 1 45,8 51,7 32,2
Ghi chú:
Thí nghiệm được tiến hành với 15 g bắp thanh trùng cấy 20 bào tử Aspergillus flavus và 200 té bao Bacillus subtilis NK-C3 hoac 200 té bao Bacillus subtilis [AM 6
25°C (trích dẫn bởi Nguyễn Thị Ngọc Trân, 1995)
2.2 KHAI QUAT VE NAM MOC SINH DOC TO AFLATOXIN 2.2.1 Khái niệm về nắm mốc
Nắm mốc là vi sinh vật (vi nắm) có cấu tạo gần giống với thực vật, sống ký sinh
hay hoại sinh trên nhiều loại chất khác nhau, đặc biệt là các chất hữu cơ đơn giản nhất là hydratcacbon
Nắm mốc không chứa diệp lục tố, cấu tạo dang sợi có vách ngăn hoặc không có
vách ngăn Những sợi nam nay phân nhánh, hình thành từng đám chẳng chịt gọi là hệ
sợi nấm Có 2 loại sợi:
` - Sợi nắm dinh đưỡng: nằm trong lớp môi trường, làm nhiệm vụ hấp thu chất
dinh dưỡng cho toàn bộ hệ nắm
- Sợi nắm khí sinh: thường nhô lên trên môi trường, giữ vai trò sinh sản (tạo bào
tử)
2.2.2 Các loài nắm mốc sinh độc tổ aflatoxin
Aflatoxin là một nhóm độc tố chủ yếu do nam méc Aspergillus flavus và Aspergillus parasiticus sản sinh ra, được tìm thấy đầu tiên từ bánh dầu phộng nhập từ
Trang 27Bảng 2.5: Một số loài nắm mốc có khả năng sản sinh aflatoxin Aflatoxin Tác giả Loài nắm mốc Bị Bạ G, G;
Aspergillus flavus + + Sargeant va ctv, 1961
Aspergillus parasiticus + + + + | Coduer va ctv, 1963
Aspergillus nomius + + + + | Kurzman va ctv, 1987
Aspergillus oryzae + Basappa va ctv, 1967
Aspergillus niger + Kulik va Holaday, 1967
Aspergillus wentii + Kulik va Holaday, 1967
Aspergillus ruber + Kulik va Holaday, 1967
Aspergillus ostianus + + Scot va ctv, 1968
Aspergillus ochraceus + Van Walbeck va ctv,1968
Penicillium puberulum + + + + | Kulik va Holaday, 1967
Penicillum variabile + Kulik va Holaday, 1967
Penicillium frequentans + Kulik va Holaday, 1967
Penicillium citrinum + Kulik va Holaday, 1967
Rhizopus sp + Van Walbeck va ctv,1968
Cac loai nam cé vai tro quan trong trong trong san sinh aflatoxin la Aspergillus 13
flavus va Aspergillus parasiticus, cac loài nam khac: Penicillium spp va Rhizopus sp
thường ít có vai trò gây bệnh trong thực tế (Lê Anh Phụng, 2001) 2.2.3 Độc tố aflatoxin
2.2.3.1 Các loại độc tố aflatoxin
Trong tự nhiên, có 4 loại aflatoxin được nam mốc sinh ra, ký hiệu là AFB¡,
AFB;, AFG¡, AFG;
B¡ và B;: phát ra màu xanh nước biển dưới ánh sáng UV
G¡ và G;: phát màu xanh lá cây dưới ánh sáng UV
Trang 2814
Giữa các loại trên thì aflatoxin B, dugc san sinh với số lượng nhiều nhất trong nông sản và cũng gây tác hại nhiều nhất, gây ra ngộ độc nhiều nhất
2.2.3.2 Cơ chế gây bệnh của aflatoxin
Aflatoxin có khả năng liên kết với ADN trong nhân tế bào Sự liên kết này gây
ức chế enzym polymerase của ARN Nó gây tác dụng hạn chế trong tổng hợp ARN và ức chế polymerase t-ARN Đây là nguyên nhân gây hạn chế sự tổng hợp protein trong
tế bào Người ta cũng đã chứng minh rằng vòng œ,B-lacton không bão hòa có trong phân tử aflatoxin làm cho hợp chất này có hoạt tính gây ung thư và cũng chính vòng
lacton này gây ức chế tổng hợp AND trong nhân tế bào, do đó nó làm rối loạn tăng
trưởng bình thường của tế bào (M.F.Nexterin và V.I.A Vixarinova, 1971, trích dẫn bởi Lê Anh Phụng, 2001)
2.2.3.3 Những tác hại do aflatoxin gây ra
Theo Dương Thanh Liêm (2002), aflatoxin gây ra những tác hại rất lớn cho cơ thể con người và động vật Những tác hại đó như sau:
- Gây tốn thương tế bào gan: tất cả các trường hợp xác nhận sự ngộ độc
aflatoxin đều có bệnh tích giống nhau là gan của động vật bị nhiễm đều hư hại nặng
Tùy theo mức độ nhiễm ít hay nhiều, lâu hay mau mà bệnh tích trên gan có khác nhau Biểu hiện chung là: ban đầu gan biến thành màu vàng tươi, mật sưng Sau đó gan sưng
to lên, mật căng phông và bắt đầu nổi mụt nhỏ trên bề mặt gan làm cho nó gồ ghề đôi khi có những nốt hoại tử màu trắng Sau cùng do nhiễm khuẩn mà gan trở nên bở, dễ
bể
- Thận cũng bị sưng to làm cho việc bài thải chất độc ra khỏi cơ thể trở nên khó khăn Từ đó làm cho triệu chứng ngộ độc trở nên trầm trọng
- Bào mòn ống tiêu hóa nên làm giảm khả năng tiêu hóa các chất dinh dưỡng
trong thức ăn Đôi khi cũng thấy tổn thương ở miệng, làm cho thú khó lấy thức ăn - Làm giảm khả năng đề kháng của động vật, ức chế hệ thống sinh kháng thé
Do đó khi nhiém aflatoxin co thé rat mẫn cảm với các bệnh thông thường, có thé gay tử
vong cho thú
Trang 2915
- Làm giảm tính ngon miệng đối với thức ăn do sự phát triển của nắm mốc làm
mat mui thức ăn
- Làm hư hại các chất dinh dưỡng trong thức ăn như glucid, protein, acidamin, vitamin Làm thức ăn bị giảm giá trị nghiêm trọng, mất mùi tự nhiên nên thú không
thích ăn
Đặc biệt aflatoxin còn có khuynh hướng gây ung thư
Làm giảm thấp sự sinh trưởng, sức sản xuất của thú Hậu quả cuối cùng là có thể gây chết cho thú
2.2.3.4 Các phương pháp phân hủy aflatoxin
Phương pháp vật lý học
Cấu trúc mạch vòng của aflatoxin rất bền chắc Nếu ta đem nguyên liệu nấu ở
nhiệt độ thường (<100°C) thì aflatoxin không bị phá hủy Tuy nhiên ở nhiệt độ này thi
có khả giết chết nắm sinh ra độc tố, từ đó giới hạn được mức độ nhiém aflatoxin (theo Dương Thanh Liêm, Bùi Huy Như Phúc, Dương Duy Đồng, 2002)
- Phân hủy aflatoxin bằng không khí nóng: dùng không khí nóng thổi qua
nguyên liệu có chứa aflatoxin để làm giảm thiểu lượng aflatoxin đã được nhiều tác giả
nghiên cứu (Lee, 1969; Waltking, 1971; Elkady, 1981; Frank, 1974; trích dẫn bởi Đậu
Ngọc Hào và Lê Thị Ngọc Diệp, 2003) Phương pháp này đã đem lại nhiều kết quả
đáng kế Nếu nhiệt độ thổi gió là 100 - 145°C ở ngô hạt thì lượng aflatoxin B¡ có thể giảm từ 877 ppb còn 452 ppb, từ 378 ppb còn 213 ppb, tir 133 ppb con 80 ppb va tir 80 ppb còn 25 ppb Nếu tăng nhiệt độ thôi lên tới 165°C có thể làm cho lugng aflatoxin B,
giảm từ 66 - 67%
- Phân hủy aflatoxin bằng hấp ướt ở áp suất cao: phương pháp hấp ướt ở nhiệt độ cao dưới áp lực hơi nước đem lại kết quả khả quan hơn Quá trình này phá hủy nhanh chóng vòng lacton trong cấu trúc phân tử của aflatoxin Rehana (1979) (trích
dẫn bởi Đậu Ngọc Hào và Lê Thị Ngọc Diệp, 2003) nhận thấy nếu gạo nhiễm aflatoxin
Trang 3016
aflatoxin thấp (760 ppb) được hấp ở 1,5 atm trong vòng một giờ đã phân hủy hoàn toàn aflatoxin
- Làm giảm aflatoxin bằng các chất hấp phụ hoặc kết dính độc tố: các chất hấp phụ thường là các chất vô cơ hoặc hữu cơ (tự nhiên hoặc nhân tạo) có hoạt tính bề mặt
cao
Các chất có khả năng hấp phụ aflatoxin gồm: than hoạt tinh, mét sé polymer
hữu vô cơ có bản chất aluminosilicat như bentonite, HSCAS (Hydrated sodium
calcium alumino-silicate), mốt số chất sét đặc biét (kaolin, sepiolite, clinoptilolite, zeolite), mdt số polymer hữu cơ tự nhiên (alfalfa) hoặc nhân tạo (nhựa trao đổi ion,
polyvinyl polypyrrolidone) (Charmley, 1994; trích dẫn bởi Đậu Ngọc Hào và Lê Thị Ngọc Diệp, 2003) Những chất này không được hấp phụ qua ruột mà được bài thải ra
ngoài
- Tách aflatoxin bằng dung môi hữu cơ: đây là phương pháp có thể áp đụng đối với
thức ăn và nguyên liệu làm thức ăn căn nuôi Một thí nghiệm sử dụng hỗn hợp methanol-nước
để tách aflatoxin ra khỏi bắp ở tỷ lệ 5:1 đã cho kết quả rất khả quan
- Phân hủy aflatoxin bằng các tia bức xạ: aflatoxin rất mẫn cảm với tia cực tím Ở bước sóng 365 nm, khả năng hấp phụ của aflatoxin đạt cực đại Okonkwo (1978) nhận thấy, lượng aflatoxin ở bắp (150 ppb và 250 ppb) có thể giảm tới 30% và 16% trong 10 giờ tiếp xúc với ánh nắng mặt trời (Đậu Ngọc Hào và Lê Thị Ngọc Diệp,
2003 Như vậy ánh nắng mặt trời có tác dụng tốt để phá hủy aflatoxin, tuy nhiên nó
không triệt để, vì ánh nắng chỉ có tác dụng bên ngoài của lớp thức ăn (Dương Thanh Liêm, Bùi Huy Như Phúc, Dương Duy Đồng, 2002)
Phương pháp hóa học
- Phương pháp sử dụng các chất oxi hóa-khử: các chất oxy hóa-khử như natrihypochlorit (ÑaOC]), oxy già (H;O;) được sử dụng để làm mất độc tính của
aflatoxin Tuy nhiên sử dụng NaOCI đề xử lý hạt nhiễm aflatoxin có thể làm mất màu sắc của hạt và biến chất các acid amin Khí ozon (O;) cũng được thử nghiệm về khả năng phân hủy aflatoxin trong mẫu và đạt được hiệu quả tốt, song có bằng chứng là
Trang 3117
- Phương pháp sử dụng các chất kiềm: hydroxit amon (NH„OR) và hyroxit natri
(NaOH) là 2 chất kiềm được sử dụng làm vô hoạt afaltoxin Các chất này đều có hoạt tính mạnh, có thể phá vỡ vòng lacton trong cấu trúc phân tử của aflatoxin
- Phương pháp sử dụng khí NH;: nhiều thí nghiệm đã chứng minh hiệu quả của việc dùng khí NHạ làm vô hoạt aflatoxin Xử lý ngô bằng khí NHa được đặc biệt quan tâm ứng dụng hơn cả Người ta nhận thấy, nếu hàm lượng NH; là 0,5 - 1,5% và nhiệt
độ bên ngoài là 25°C, trong 14 ngày tiếp xúc, lượng aflatoxin từ 200ppb có thê giảm
xuống con 10 ppb (theo Đậu Ngọc Hào và Lê Thị Ngọc Diệp, 2003) Phương pháp sinh vật học
Phương pháp vi sinh vật học dùng các loài nắm men, mốc, vi khuẩn, xạ khuẩn không có độc tính đề thử nghiệm về khả năng làm giảm aflatoxin
Rhizopus stolonifer phân hủy được aflatoxin Gì Rhizopus arrhizus có thé lam giảm tính gây độc của aflatoxin Bị
Aspergillus parasiticus cũng có thê tác động lên aflatoxin qua hệ thống men của hệ sợi nắm Tuy nhiên, tác dụng này còn phụ thuộc vào chủng loại nắm, nhiệt độ, độ pH và hàm lượng aflatoxin trong môi trường
Một số dạng nấm men Saccharomyces cerevisiae co tac dung han chế ảnh hưởng xấu của aflatoxin trong thức ăn chăn ni, ngồi ra còn giúp tăng trọng và giảm bệnh đường tiêu hóa ở vật nuôi (theo Đậu Ngọc Hào và Lê Thị Ngọc Diệp, 2003)
Một số chủng vi khuẩn Bacillus subtilis đã được thử nghiệm về khả năng ức
Trang 3218
Chương 3
NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP TIỀN HÀNH
3.1 THỜI GIAN VA DIA DIEM 3.1.1 Thời gian Thời gian thực hiện đề tài từ tháng 3/2007 đến tháng 8/2007 3.1.2 Địa điểm Phòng thực hành vi sinh, khoa Chăn Nuôi —Thú Y trường Đại Học Nông Lâm Tp.HCM
3.2 ĐÓI TƯỢNG KHẢO SÁT
- Chủng vi khuẩn Bacillus subtilis được phân lập từ đất
- Ching nam méc Aspergillus flavus sinh aflatoxin do phòng thực hành vi sinh cấp - Vịt nuôi 3.3 THIẾT BỊ VÀ DỰNG CỤ THÍ NGHIỆM - Thiết bị: kính hién vi, tủ sấy, nồi hấp tiệt trùng (autoclave), cân điện tử, máy lắc (vortex), lò vi sóng, đèn cực tím,
- Dụng cụ: ống nghiệm, đĩa petri, que cấy, đèn cồn, bình tam giác, bacher, micropipette, đũa khuấy thủy tỉnh, ống đong, nhiệt kế, que trang, buồng đếm Neubauer, giá để ống nghiệm Tất cả các dụng cụ thủy tinh dùng trong thí nghiệm phải dược sấy
tiệt trùng ở 180”C/45 phút
Trang 3319
3.4 MOI TRUONG NUOI CAY
3.4.1 Môi trường tự nhiên
- Môi trường thạch nước cốt dừa: dùng kiểm tra khả năng sinh aflatoxin của
Aspergillus flavus Nước cốt dừa đóng hộp được pha loãng với nước theo tỷ lệ 1:1
Sau đó thêm agar theo tỷ lệ thích hợp Hấp tiệt trùng ở 121°C/20 phút
- Môi trường bắp: bắp hạt trước khi dùng phải được nghiền nhỏ như hạt tắm Sau đó sấy tiệt trùng, xác định hàm lượng aflatoxin và đo hàm lượng ẩm Điều chỉnh hàm lượng âm đến 30% bằng nước, cho vào chai nâu, mỗi chai 150 g bap Hap tiệt trùng ở 121°C/20 phút trước khi tiến hành nuôi cấy
(Thành phần các môi trường được trình bày ở phần phụ lục)
3.4.2 Môi trường tông hợp
- Môi trường phân lập, giữ giống và đếm số lượng vi khuuẩn: môi trường TSA
(Trypticase Soya Agar)
- Môi trường tăng sinh khối vi khuẩn: môi trường TSB (Trypticase Soya Broth)
- Môi trường giữ giống nắm: môi trường thạch khoai tây
3.5 NỘI DUNG
- Phân lap ching Bacillus sutilis tir dat
- Khao sat khả năng ức ché aflatoxin cla cac ching Bacillus subtilis phan lap
được
- Khảo sát tỷ lệ nuôi cấy thích hợp giữa bào tử nắm mốc sinh aflatoxin và bào tử
vi khuan Bacillus subtilis dé vi khuan có thể ức chế sản sinh aflatoxin tốt nhất
- Thử độ an toàn của nguyên liệu bap nhiém aflatoxin sau khi xử lý với vi khuẩn Bacillus subtilis thu được trên vịt nuôi
3.6 PHƯƠNG PHÁP TIỀN HÀNH NGHIÊN CỨU 3.6.1 Phân lập vi khuan Bacillus subtilis tir dat
3.6.1.1 Cách lấy mẫu đất để phân lập vi khuẩn
Trang 3420
Cân 10 g mau dat cho vào bình tam giác có chứa 90 ml nước muối sinh lý vô trùng và
lắc đều, được nồng độ pha loãng 10”
3.6.1.2 Phuong phap phan lap vi khuan Bacillus subtilis
Chuẩn bị 4 ống nghiệm, mỗi ống chứa 9 ml nước muối sinh lý vô trùng, đánh số
thứ tự từ 1 - 4 Dùng micropipette hut 1 ml dich mẫu từ bình tam giác chứa mẫu đất phân lập có nồng pha loãng 10” cho vào ống nghiệm thứ 1 và lắc đều bằng máy vortex,
được nồng độ pha loãng 10°, ctr như vậy tiếp tục làm cho đến ống cuối cùng Tiếp theo chọn các ống nghiệm có nồng độ pha loãng 103,10,10 đem đun cách thủy ở 70°C/30
phút Sau khi đun thi ding micropipette hút 0,1 ml từ mỗi nồng độ pha lỗng cho lên
đĩa mơi trường TSA và trang đều bằng que trang vô trùng, để đĩa TSA ở 37C/24 giờ
trong tủ ấm Sau đó quan sát các khuẩn lạc hình thành trên đĩa TSA, chọn ra những
khuẩn lạc nghỉ ngờ là của Bacillus subzilis, dùng que cấy vòng bắt và cấy giữ giống lại
trên môi trường ống thạch TSA nghiêng
3.6.2 Khảo sát đặc điểm sinh học của vi khuẩn phân lập được 3.6.2.1 Quan sát hình thái vi khuẩn dưới kính hiển vi
Lấy một ít sinh khối vi khuẩn từ ống TSA làm tiêu bản nhuộm Gram để quan sát
Trang 3521
3.6.2.2 Khảo sát các phản ứng sinh hóa của vi khuẩn phân lập được
Chủng vi khuẩn thuần đã kiểm tra dưới kính hiển vi v Hoat tinh catalase (+) v Lecithinase (-) v Nitrate (+) MR-VP (+) Citrate (+) Maltose (+) v
Vi khuan Bacillus subtilis
Sơ đồ 3.1:Các phản ứng sinh hóa của vi khuẩn Bacilius subtilis
3.6.3 Thí nghiệm 1: Kiểm tra kha nang sinh aflatoxin cia chủng nấm mốc Aspergillus flavus và đánh giá sơ bộ khả năng ức chế sản sinh aflatoxin của các
ching Bacillus subtilis phan lap duge
3.6.3.1 Kiém tra kha nang sinh aflatoxin cia chiing nam méc Aspergillus flavus Trước khi tiến hành thí nghiệm phải tiến hành kiểm tra định tính khả năng sinh độc tố aflatoxin của chủng nắm mốc Aspergiliws flayus trên môi trường thạch nước cốt dừa
Cho vào đĩa petri khoảng 15 ml môi trường thạch nước cốt dừa và chờ đến khi thạch đông Dùng que cấy móc lấy 1 ít sợi nắm mốc trong ống giống (môi trường thạch
khoai tây), cấy 1 chấm vào giữa đĩa và giữ đĩa ở nhiệt độ phòng Sau 5 ngày, theo dõi
Trang 362 3.6.3.2 Thí nghiệm đánh giá sơ bộ khả năng ức chế sản sinh aflatoxin của các ching Bacillus subtilis phan lap duge
Dùng que cấy vòng lấy 1 ít vi khuan Bacillus subtilis phan lập được được giữ trong ống môi trường TSA nghiêng vào đĩa môi trường thạch nước cốt đừa và ủ trong tủ ấm ở 37C trong 3 ngày Mỗi đĩa từ 3 đến bốn chủng vi khuẩn Bacillus subtilis phan
lập được Sau 3 ngày, dùng que cấy móc lấy 1 ít soi nam méc Aspergillus flavus trong
ống giống (đã kiểm tra khả năng sinh độc tố aflatoxin trên môi trường thạch nước cốt
dừa) cấy vào giữa đĩa môi trường thạch nước cốt dừa nước cốt dừa đã cấy vi khuẩn xung quanh và xem kết quả sau 7 ngày
Sau khoảng 7 ngày theo dõi màu huỳnh quang xung quanh khuẩn lạc Aspergillus flavus ở các phía có cây vi khuẩn Bacillus subiilis và không có cấy vi khuẩn bằng cách đem đĩa soi đưới ánh đèn tia cya tím (UV) có bước sóng 365 nm Nếu
màu huỳnh quang càng sáng ít ở phía ở phía cấy chủng vi khuẩn nao thì ching Bacillus subtilis đó cho khả năng ức chế sản sinh aflatoxin càng mạnh
Sau thí nghiệm sơ bộ này, chọn những chủng vi khuan Bacillus subtilis cho kha nang
ức chế san sinh aflatoxin manh nhất dé tiến hành thí nghiệm tiếp theo Ghi chú:
- Môi trường thạch nước cốt dừa dùng trong thí nghiệm trên không chứa kháng
sinh
- Chỉ tiêu theo đối: định tính khả năng ức chế sản sinh aflatoxin của các ching vi
khuan Bacillus subtilis phân lập được
3.6.4.Thí nghiệm 2: Khảo sát khả năng làm giảm aflatoxin sản sinh trên môi trường bắp của các chúng vi khuẩn Bacilius subfilis phân lập được
3.6.4.1 Phương pháp thu hoạch và xác định số lượng bào tử nắm mốc Aspergillus flavus
3.6.4.1.1 Phương pháp thu hoạch bào tử nắm mốc Aspergillus flavus
Cấy chủng nắm mốc đã được kiểm tra khả năng sinh độc tố lên ống môi trường
Trang 3723 dùng que cấy móc khuấy nhẹ và hút lấy huyễn dịch bào tử bằng micropipette rồi cho
vào một ống nghiệm vô trùng khác Sau đó tiến hành đếm số lượng bào tử nắm mốc
trong huyễn dịch thu được bằng phương pháp dùng buồng đếm Neubauer dưới kính hiển vi có độ phóng dai x 400 lần
3.6.4.1.2 Phương pháp xác định số lượng bào tử nắm mốc Aspergilius flavus Cố định buồng đếm Neubauer đưới kính hién vi độ phóng đại x 400 lần, đặt lamell lên Dùng micropipette hút 1 ít (khoảng 0,4 ml) huyễn dịch bào tử nắm mốc thu được nhỏ vào rãnh của buồng đếm Đề yên 1 - 2 phút để dịch đếm tự dàn đều khắp
buồng đếm Cộng số bào tử có được ở các ô vừa đếm và áp dụng công thức để xác định số lượng bào tử nắm mốc/ml (xem phụ lục)
3.6.4.2 Phương pháp thu hoạch và xác định số lượng bào tử vi khuẩn Bacillus subtilis
3.6.4.2.1 Phuong phap thu hoach huyén dich bao tir vi khuan Bacillus subtilis Dùng que cấy vòng lấy một ít sinh khối của vi khuân Bacillus subiilis từ ông giống cấy chuyền sang môi trường ống thạch nghiên TSA, để ống TSA ở 37C trong 24h
Tiếp theo cũng dùng que cấy vòng lấy một ít sinh khối vi khuẩn từ ống TSA cấy sang môi trường ống TSB lỏng, để ống TSB ở 37°C trong 24 h Sau đó dùng micropipette
hút 0,1ml canh khuẩn từ môi trường TSB cho lên môi trường đĩa TSA và trang đều bằng que trang vô trùng, dé dia TSA ở 37°C trong khoảng 7 ngày Sau đó nhuộm Gram theo dõi số lượng bào tử được hình thành Tiến hành thu hoạch bào tử vi khuẩn khi có
hơn 50% tế bao Bacillus subtilis ở đạng bào tử Cuối cùng thu huyén dich bao tir bang
Trang 3824
Ống giống Cấy chuyển - Cấy sang TSB ;
Vikhuan —————_>+ Ong TSA —————————_> Ong TSB
Bacillus subtilis 37°C/24 gis 37°C/24 giờ Hút 0,1ml trang lên đĩ; _ Dia TSA (để ở 37°C/7ngày) 4 Cho nuớc muối sinh lý vô trùng vao dia TSA ‘Thu hoach huyền dịch bào tử)
Ong huyén dich bao tur Bacillus subtilis
So dé 3.2: Phuong phap thu hoach huyén dich bao tir Bacillus subtilis 3.6.4.2.2 Phương pháp xác dinh sé long bao tir vi khuan Bacillus subtilis
Pha loang huyén dich bao tr vi khuan thu được theo bậc 10 liên tiếp bằng cách
dùng các ống nghiệm chứa 9 ml nước muối vô trùng, đánh số thứ tự trên các ống nước muối Dùng micropipette hút 1ml huyễn dịch vi khuẩn cho vào 2 ống nghiệm 1, bơm lên bơm xuống nhiều lần và lắc trên may vortex để trộn đều, ta được nồng độ pha loãng
101 hút 1ml từ ống 1 cho vào ống 2, trộn đều được nồng độ pha loãng 10” và tiếp tục
cho tới ống cuối cùng Sau đó chọn 3 nồng độ pha loãng liên tiếp thích hợp và đun
cách thủy các ống nghiệm đó ở 70°C trong 30 phút để làm chết các tế bào sinh dưỡng
còn sót lại và hoạt hóa bào tử vi khuẩn Đun xong, để nguội,dùng micropipette hút 0,1
huyễn dịch bảo tử vi khuẩn cho lên môi trường đĩa TSA (mỗi nồng độ 2 đĩa), trang đều
bằng que trang vô trùng, dé dia TSA 6 37°C trong 24 h Sau đó đếm số lượng khuẩn lạc
Trang 3925
Huyễn dịch Pha loãng ` `
bao tr —————* Nôngđộ ——————* Chọn 3 nông độ vi khuẩn 10” đến 10" pha loãng liên tiếp thích hợp
Dun cach thủy ở 70°C/30 phút Hút 0,Iml trang lên đĩa TSA (mỗi nồng độ 2 đĩa) Dé dia TSA 6 37°C/24 gid} Đếm số khuẩn lạc hình thành trên đĩa Sơ đồ 3.3: Phương pháp xác định số lượng bào tử Bacillus subtilis 3.6.4.3 Bố trí thí nghiệm
3.6.4.3.1 Xử lý nguyên liệu bắp ban đầu trước khi tiến hành thí nghiệm
Nguyên liệu bắp được xay nhuyễn tương đối kích khoảng 2 - 3 pm Sau dé
được sây khô bằng ti say ở 110°C trong 30 phút nhằm ngăn chặn sự phát triển của nắm
mốc, để bảo quản nguyên liệu bắp dùng trong các thí nghiệm Tiếp theo tiến hành gửi mẫu bắp đã sấy đi phân tích hàm lượng aflatoxin bằng phương pháp sắc ký bản mỏng (TLC) nhằm xác định hàm lượng aflatoxin có trong nguyên liệu bắp ban đầu
3.6.4.3.2 Nuôi cấy chung bào tử vi khuẩn Bacillus subfilis và bào tử nắm Aspergilius flavus trên môi trường nguyên liệu bắp
Sau khi xác định được số lượng thì tiến hành nuôi cay chung bao tir nam mốc và
bảo tử vi khuẩn trên môi trường bắp theo tỷ lệ và số lượng phù hợp.Tỷ lệ bào tử nắm
Trang 4026 Bảng 3.1: Bố trí thí nghiệm 2
Tỷ lệ bào tử nắm/bào tử vi khuẩn 1/107
Số lượng bào tử Thí nghiệm | Đối chứng Nắm mốc (1 ching) 10 10° Vi khuan (8 ching) 10° - Ghi chú:
- Mẫu đối chứng không bỗ sung bào tử vi khuan Bacillus subtilis
- Sau khi cây bào tử nấm mốc và bào tử vi khuẩn theo tỷ lệ nghiên cứu thì đặt
các chai ở nhiệt độ phòng (25-30°C), hàng ngày lắc đều chai để tránh hiện tượng vón cục và tạo độ thoáng giữa các hạt
- Sau 7 ngày gửi mẫu phân tích hàm lượng aflatoxin bằng phương pháp sắc ký ban mong (TLC)
- Chỉ tiêu theo dõi: hàm lượng của aflatoxin của mẫu đối chứng và mẫu thi
nghiệm
3.6.5 Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ bào tử nắm mốc /bào tử vi
khuẩn đối với sự sản sinh aflatoxin
Thí nghiệm 2 cho thấy một số chủng vi khuẩn Bacillus subtilis phan lap được có
khả năng làm giảm aflatoxin trên bắp nhưng kết quả chưa tốt lắm Vì vậy chúng tôi tiến hành thí nghiệm 3với mục dich tìm ra tỷ lệ bào tử nấm mốc/bào tử vi khuẩn để vi khuẩn có thê ức chế aflatoxin tốt nhất
Dựa vào kết quả phân tích ham lugng aflatoxin cua thi nghiệm 2, chọn chủng vi
khuẩn Bacillus subiilis có khả năng làm giảm aflatoxin mạnh nhất để thực hiện thí