Phân lập vi khuẩn Bacillis từ đất khảo sát khả năng ức chế sản sinh Aflatoxin của các chủng phân lập

Phân lập vi khuẩn Bacillis từ đất khảo sát khả năng ức chế sản sinh Aflatoxin của các chủng phân lập

i BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP PHÂN LẬP VI KHUẨN BACILLUS SUBTILIS TỪ ĐẤT, KHẢO SÁT KHẢ NĂNG ỨC CHẾ SẢN SINH AFLATOXIN CỦA CÁC CHỦNG PHÂN LẬP ĐƢỢC Ngành học: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Niên khóa: 2003 - 2007 Sinh viên thực hiện: PHẠM HOÀNG THÁI Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 8/2007 ii BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP PHÂN LẬP VI KHUẨN BACILLUS SUBTILIS TỪ ĐẤT, KHẢO SÁT KHẢ NĂNG ỨC CHẾ SẢN SINH AFLATOXIN CỦA CÁC CHỦNG PHÂN LẬP ĐƢỢC Giáo viên hƣớng dẫn: Sinh viên thực hiện: TS. NGUYỄN NGỌC HẢI PHẠM HOÀNG THÁI Ngành học: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Niên khóa: 2003 - 2007 Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 8/2007 iii LỜI CẢM TẠ Mãi khắc ghi công ơn sinh thành, nuôi nấng, dạy dỗ của ba, má và những người thân trong gia đình đã cho con có được ngày hôm nay. Chân thành cảm ơn Ban chủ nhiệm bộ môn Công Nghệ Sinh Học cùng toàn thể quý thầy cô đã tận tình dạy bảo và truyền đạt kiến thức cho em trong suốt thời gian học tập tại trường. Chân thành biết ơn sâu sắc đến các quý thầy cô Ts. Nguyễn Ngọc Hải Ts. Lê Anh Phụng Cô Nguyễn Thị Kim Loan đã tận tình chỉ bảo và giúp đỡ em trong suốt thời gian thực hiện đề tài. Chân thành cảm ơn toàn thể bạn bè đã động viên, chia sẽ và giúp đỡ tôi trong suốt thời gian học tập và thực hiện đề tài. iv TÓM TẮT LUẬN VĂN Qua thời gian thực hiện đề tài “Phân lập vi khuẩn Bacillus subtilis từ đất, khảo sát khả năng ức chế sản sinh aflatoxin của các chủng phân lập đƣợc.” từ tháng 3/2007 đến tháng 8/2007 tại Phòng thực hành Vi Sinh khoa Chăn Nuôi-Thú Y, chúng tôi có những kết luận sau: - Có thể phân lập được vi khuẩn Bacillus subtilis từ đất với tỷ lệ 8,16 %. - Đánh giá sơ bộ khả năng ức chế aflatoxin của các chủng vi khuẩn Bacillus subtilis phân lập được từ đất trên môi truờng thạch nước cốt dừa: sau 7 ngày nuôi cấy chung Bacillus subtilis và Aspergillus flavus trên môi trường thạch nước cốt dừa, quan sát bên ngoài và dưới ánh đèn tia cực tím (UV) cho thấy một số chủng có khả năng ức chế sinh trưởng và sản sinh aflatoxin của nấm mốc Aspergillus flavus. - Khảo sát khả năng ức chế sản sinh aflatoxin của các chủng vi khuẩn Bacillus subtilis phân lập được từ đất: môi trường bắp sau 7 ngày nuôi cấy bào tử nấm mốc và bào tử vi khuẩn , ghi nhận một số chủng có khả năng làm giảm aflatoxin trên môi trường bắp so với mẫu đối chứng chỉ có bào tử Aspergillus flavus không có bào tử Bacillus subtilis. - Khảo sát tỷ lệ nuôi cấy giữa bào tử nấm mốc/bào tử vi khuẩn Bacillus subtilis ảnh hưởng đến khả năng sản sinh aflatoxin trên môi trường bắp phối trộn tỷ lệ bào tử nấm mốc/bào tử vi khuẩn là 1/103, 1/104 và 1/105. Sau 7 ngày nuôi cấy cho thấy khi tỷ lệ bào tử vi khuẩn tăng lên thì tăng khả năng làm giảm aflatoxin. - Nguyên liệu bắp nhiễm aflatoxin có xử lý với vi khuẩn Bacillus subtilis gây chết vịt ít hơn nguyên liệu bắp nhiễm aflatoxin nhưng không xử lý với vi khuẩn. v SUMMARY The thesis: “ Isolation of Bacillus subtilis in soil and survey their ability in inhibition of aflatoxin production by Aspergillus flavus on maize.” The thesis Bacillus subtilis in inhibition of aflatoxin production by Aspergillus flavus on maize and in protection of duck frome aflatoxin infection was carried out in Microbiology and Infections Diseases Department of Freulty of Animal sciences and Veterinary, Nong Lam University, Ho Chi Minh cty frome 03/2007 to 08/2007. The results showed: - Bacillus subtilis could inhibite the aflatoxin production of Aspergillus flavus on maize in times. - Bacillus subtilis treatment could reduce the neortility rate, health affect of the ducks fed with 100 ppb aflatoxin containated maize. vi MỤC LỤC CHƢƠNG TRANG Trang bìa 1………………………………………………………………… … .i Trang bìa 2……………………………………………………………… …… ii LỜI CẢM TẠ………………………………………………………… .……… .iii MỤC LỤC…………………………………………………………….…… … .iv DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT………………………………………… .ix DANH MỤC CÁC BẢNG…………………………………………………… .… x DANH MỤC CÁC HÌNH…………………………………………………… .… xi DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ…………………………………………………… xii TÓM TẮT LUẬN VĂN….…………………………………………….…… .….xiii 1. MỞ ĐẦU………………………………………………………………….… …1 1.1. ĐẶT VẤN ĐỀ… .……………………………………………… .… ……1 1.2. MỤC TIÊU ĐỀ TÀI… .………………………………………… .……2 1.3. YÊU CẦU ĐỀ TÀI………… .……………………………… … ….…2 2. TỔNG QUAN………………………… ……………………… … .…3 2.1. KHÁI QUÁT VỀ VI KHUẨN BACILLUS SUBTILIS…… .…….3 2.1.1. Lịch sử phát hiện……………………………………………… 3 2.1.2. Đặc điểm phân loại và sự phân bố của vi khuẩn Bacillus subtilis 3 2.1.2.1. Đặc điểm phân loại…………………………… ….…………… ….3 2.1.2.2. Sự phân bố………………………………………………… …… .4 2.1.3. Đặc điểm hình thái………………….…………………………… .…….4 2.1.4. Đặc điểm nuôi cấy……………………………………………… … .… .4 vii 2.1.5. Đặc điểm sinh hóa……………………………………… …… 5 2.1.6. Đặc điểm cấu trúc kháng nguyên……………………… … .… 6 2.1.7. Bào tử vi khuẩn Bacillus subtilis………………………… .…… .7 2.1.7.1. Cấu tạo của bào tử………………………………………… … .… 7 2.1.7.2. Đặc điểm và tác dụng của bào tử……………………… …… .… .8 2.1.8. Tính chất đối kháng của Bacillus subtilis với vi sinh vật gây bệnh .9 2.1.9. Những nghiên cứu về tác dụng đố kháng Aspergillus của Bacillus subtilis .11 2.2. KHÁI QUÁT VỀ NẤM MỐC SINH ĐỘC TỐ AFLATOXIN…… .… 12 2.2.1. Khái niệm về nấm mốc……………………………………… .…… .12 2.2.2. Các loài nấm mốc sinh độc tố aflatoxin…………… .12 2.2.3. Độc tố aflatoxin………………………………… 13 2.2.3.1. Các loại độc tố aflatoxin……………………… .13 2.2.3.2. Cơ chế gây bệnh của aflatoxin…………………… .14 2.2.3.3. Những tác hại do aflatoxin gây ra…………………… .14 2.2.3.4. Các phƣơng pháp phân hủy aflatoxin……………………… .……… 15 3. NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP TIẾN HÀNH 19 3.1. THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM 19 3.1.1. Thời gian 19 3.1.2. Địa điểm 19 3.2. ĐỐI TƢỢNG KHẢO SÁT .19 3.3. THIẾT BỊ DỤNG CỤ THÍ NGHIỆM 19 3.4. MÔI TRƢỜNG NUÔI CẤY 20 3.4.1. Môi trƣờng tự nhiên 20 3.4.2. Môi trƣờng tổng hợp .20 viii 3.5. NỘI DUNG .20 3.6. PHƢƠNG PHÁP TIẾN HÀNH NGHIÊN CỨU .20 3.6.1. Phân lập vi khuẩn Bacillus subtilis từ đất .20 3.6.1.1. Cách lấy mẫu đất để phân lập vi khuẩn 20 3.6.1.2. Phƣơng pháp phân lập vi khuẩn Bacillus subtilis .21 3.6.2. Khảo sát đặc điểm sinh học của vi khuẩn phân lập đƣợc 21 3.6.2.1. Quan sát hình thái vi khuẩn dƣới kính hiển vi .21 3.6.2.2. Khảo sát các phản ứng sinh hóa của vi khuẩn phân lập đƣợc………… 22 3.6.3. Thí nghiệm 1: Kiểm tra khả năng sinh aflatoxin của chủng nấm mốc Aspergillus flavus và đánh giá sơ bộ khả năng ức chế sản sinh aflatoxin của các chủng Bacillus subtilis phân lập đƣợc 22 3.6.3.1. Kiểm tra khả năng sinh aflatoxin của chủng nấm mốcAspergillusflavus 22 3.6.3.2. Thí nghiệm đánh giá sơ bộ khả năng ức chế sản sinh aflatoxin của các chủng Bacillus subtilis phân lập đƣợc……………………………… ………… …23 3.6.4.Thí nghiệm 2: Khảo sát khả năng làm giảm aflatoxin sản sinh trên môi trƣờng bắp của các chủng vi khuẩn Bacillus subtilis phân lập đƣợc…… … 23 3.6.4.1. Phƣơng pháp thu hoạch và xác định số lƣợng bào tử nấm mốc Aspergillus flavus……………………………………………………………… .… 23 3.6.4.1.1. Phƣơng pháp thu hoạch bào tử nấm mốc Aspergillus flavus .23 3.6.4.1.2. Phƣơng pháp xác định số lƣợng bào tử nấm mốc Aspergillus flavus…………………………………………………………………… 24 3.6.4.2. Phƣơng pháp thu hoạch và xác định số lƣợng bào tử vi khuẩn Bacillus subtilis .24 3.6.4.2.1. Phƣơng pháp thu hoạch huyễn dịch bào tử vi khuẩnBacillus subtilis…24 ix 3.6.4.2.2. Phƣơng pháp xác định số lƣợng bào tử vi khuẩn Bacillus subtilis 25 3.6.4.3. Bố trí thí nghiệm 26 3.6.4.3.1. Xử lý nguyên liệu bắp ban đầu trƣớc khi tiến hành thí nghiệm……….26 3.6.4.3.2. Nuôi cấy chung bào tử vi khuẩn Bacillus subtilis và bào tử nấm Aspergillus flavus trên môi trƣờng nguyên liệu bắp 26 3.6.5. Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hƣởng của tỷ lệ bào tử nấm mốc /bào tử vi khuẩn đối với sự sản sinh aflatoxin 27 3.6.5.1. Phƣơng pháp thu hoạch và xác định số lƣợng bào tử nấm mốc Aspergillus flavus 28 3.6.5.2. Phƣơng pháp thu hoạch và xác định số lƣợng bào tử vi khuẩn Bacillus subtilis .28 3.6.5.3. Bố trí thí nghiệm 28 3.6.6. Thí nghiệm 4: Thử mức độ an toàn của ngƣyên liệu bắp đã nhiễm aflatoxin sau khi xử lý bằng vi khuẩn Bacillus subtilis (có khả năng ức chế aflatoxin) trên vịt 29 3.7. PHƢƠNG PHÁP PHÂN TÍCH MẪU……………………………………… .30 3.8. PHƢƠNG PHÁP XỬ LÝ SỐ LIỆU 30 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN…………………………………………………… 31 4.1. KHẢO SÁT ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA BACILLUS SUBTILIS……… .31 4.1.1. Quan sát đặc điểm khuẩn lạc nghi ngờ là Bacillus subtilis…………… … 31 4.1.2. Đặc điểm hình thái của vi khuẩn nghi ngờ là Bacillus subtilis sau nhuộm Gram………………………………………………………………………….32 4.1.3. Khảo sát các đặc điểm sinh hóa của vi khuẩn nghi ngờ là Bacillussubtilis 32 x 4.2.THÍ NGHIỆM 1: KIỂM TRA KHẢ NĂNG SINH AFLATOXIN CỦA CHỦNG NẤM MỐC ASPERGILLUS FLAVUS VÀ ĐÁNH GIÁ SƠ BỘ KHẢ NĂNG ỨC CHẾ SẢN SINH AFLATOXIN CỦA CÁC CHỦNG BACILLUS SUBTILIS PHÂN LẬP ĐƢỢC .35 4.2.1. Kiểm tra khả năng sinh khả năng sinh aflatoxin của chủng nấm mốc Aspergillus flavus 35 4.2.2. Thí nghiệm đánh giá sơ bộ khả năng ức chế sản sinh aflatoxin của các chủng Bacillus subtilis phân lập đƣợc…………………………………………… … ……35 4.3. THÍ NGHIỆM 2 : KHẢO SÁT KHẢ NĂNG LÀM GIẢM AFLATOXIN SẢN SINH TRÊN MÔI TRƢỜNG BẮP CỦA CÁC CHỦNG BACILLUS SUBTILIS PHÂN LẬP ĐƢỢC…………………………………… .…………… 38 4.4. THÍ NGHIỆM 3: KHẢO SÁT ẢNH HƢỞNG CỦA TỶ LỆ BÀO TỬ NẤM MỐC/BÀO TỬ VI KHUẨN ĐỐI VỚI SỰ SẢN SINH AFLATOXIN…….40 4.5. THÍ NGHIỆM 4: THỬ MỨC ĐỘ AN TOÀN CỦA NGHUYÊN LIỆU BẮP ĐÃ NHIỄM AFLATOXIN SAU KHI XỬ LÝ BẰNG VI KHUẨN BACILLUS SUBTILIS (CÓ KHẢ NĂNG ỨC CHẾ AFLATOXIN) TRÊN VỊT NUÔI 43 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ………………………………………… .……….… 48 5.1. KẾT LUẬN…………………………………………………………… ……… 48 5.2. ĐỀ NGHỊ………………………………………………………………… .…….48 TÀI LIỆU THAM KHẢO…………………………………………………… .……49 [...]... sản sinh aflatoxin của các chủng phân lập đƣợc.” 1.2 MỤC TIÊU ĐỀ TÀI Phân lập, tìm ra chủng Bacillus subtilis có khả năng ức chế afltoxin để có thể ứng dụng trong bảo quản nguyên liệu, thức ăn gia súc thành phẩm 1.3 YÊU CẦU ĐỀ TÀI - Phân lập vi khuẩn Bacillus subtilis từ đất - Khảo sát khả năng ức chế sản sinh aflatoxin của chủng vi khuẩn phân lập được - Khảo sát khả năng ức chế aflatoxin theo tỷ lệ... (+) MR-VP (+) Citrate (+) Maltose (+) Vi khuẩn Bacillus subtilis Sơ đồ 3.1 :Các phản ứng sinh hóa của vi khuẩn Bacillus subtilis 3.6.3 Thí nghiệm 1: Kiểm tra khả năng sinh aflatoxin của chủng nấm mốc Aspergillus flavus và đánh giá sơ bộ khả năng ức chế sản sinh aflatoxin của các chủng Bacillus subtilis phân lập đƣợc 3.6.3.1 Kiểm tra khả năng sinh aflatoxin của chủng nấm mốc Aspergillus flavus Trƣớc... cerevisiae), xạ khuẩn đã được thử nghiệm về khả năng làm giảm aflatoxin thu được kết quả cũng rất khả quan Được sự phân công của Bộ Môn Công Nghệ Sinh Học trường Đại học Nông Lâm Tp.HCM, sự cho phép của phòng vi sinh Khoa Chăn Nuôi-Thú Y và dưới sự hướng dẫn của thầy Nguyễn Ngọc Hải, chúng tôi tiến hành đề tài: “ Phân lập vi khuẩn Bacillus subtilis từ đất, khảo sát khả năng ức chế sản sinh aflatoxin của. .. Môi trường thạch nước cốt dừa dùng trong thí nghiệm trên không chứa kháng sinh - Chỉ tiêu theo dõi: định tính khả năng ức chế sản sinh aflatoxin của các chủng vi khuẩn Bacillus subtilis phân lập được 3.6.4.Thí nghiệm 2: Khảo sát khả năng làm giảm aflatoxin sản sinh trên môi trƣờng bắp của các chủng vi khuẩn Bacillus subtilis phân lập đƣợc 3.6.4.1 Phƣơng pháp thu hoạch và xác định số lƣợng bào tử nấm mốc... lần Các chỉ tiêu quan sát: sự bắt màu, hình dạng, cách sắp xếp của tế bào vi khuẩn, có hay không có bào tử Sau khi quan sát dưới kính hiển vi nếu thấy tiêu bản vi khuẩn nào phù hợp với những đặc điểm của vi khuẩn Bacillus subtilis thì tiếp tục thử phản ứng sinh hóa để khẳng định 21 3.6.2.2 Khảo sát các phản ứng sinh hóa của vi khuẩn phân lập đƣợc Chủng vi khuẩn thuần đã kiểm tra dưới kính hiển vi Hoạt... flavus ở các phía có cấy vi khuẩn Bacillus subtilis và không có cấy vi khuẩn bằng cách đem đĩa soi dưới ánh đèn tia cựa tím (UV) có bước sóng 365 nm Nếu màu huỳnh quang càng sáng ít ở phía ở phía cấy chủng vi khuẩn nào thì chủng Bacillus subtilis đó cho khả năng ức chế sản sinh aflatoxin càng mạnh Sau thí nghiệm sơ bộ này, chọn những chủng vi khuẩn Bacillus subtilis cho khả năng ức chế sản sinh aflatoxin. .. sử dụng vi khuẩn Bacillus subtilis để ngăn chặn sự phát triển và sinh độc tố của chủng Aspergillus flavus và Aspergillus parasiticus trên đậu phộng và bắp Các chủng Bacillus subtilis NK330 và NK-C-3 ức chế mạnh mẽ sự phát triển của nấm mốc và tống hợp aflatoxin Khả năng ức chế aflatoxin B1 của các chủng vi khuẩn Bacillus subtilis trong thí nghiệm của Norio Kimura 12 Bảng 2.4: Khả năng ức chế aflatoxin. .. chủng Bacillus subtilis phân lập được - Khảo sát tỷ lệ nuôi cấy thích hợp giữa bào tử nấm mốc sinh aflatoxin và bào tử vi khuẩn Bacillus subtilis để vi khuẩn có thể ức chế sản sinh aflatoxin tốt nhất - Thử độ an toàn của nguyên liệu bắp nhiễm aflatoxin sau khi xử lý với vi khuẩn Bacillus subtilis thu được trên vịt nuôi 3.6 PHƢƠNG PHÁP TIẾN HÀNH NGHIÊN CỨU 3.6.1 Phân lập vi khuẩn Bacillus subtilis từ. .. đó quan sát các khuẩn lạc hình thành trên đĩa TSA, chọn ra những khuẩn lạc nghi ngờ là của Bacillus subtilis, dùng que cấy vòng bắt và cấy giữ giống lại trên môi trường ống thạch TSA nghiêng 3.6.2 Khảo sát đặc điểm sinh học của vi khuẩn phân lập đƣợc 3.6.2.1 Quan sát hình thái vi khuẩn dƣới kính hiển vi Lấy một ít sinh khối vi khuẩn từ ống TSA làm tiêu bản nhuộm Gram để quan sát dưới kính hiển vi, độ... phần các môi trường được trình bày ở phần phụ lục) 3.4.2 Môi trƣờng tổng hợp - Môi trường phân lập, giữ giống và đếm số lượng vi khuuẩn: môi trường TSA (Trypticase Soya Agar) - Môi trường tăng sinh khối vi khuẩn: môi trường TSB (Trypticase Soya Broth) - Môi trường giữ giống nấm: môi trường thạch khoai tây 3.5 NỘI DUNG - Phân lập chủng Bacillus sutilis từ đất - Khảo sát khả năng ức chế aflatoxin của các . NGHỆ SINH HỌC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP PHÂN LẬP VI KHUẨN BACILLUS SUBTILIS TỪ ĐẤT, KHẢO SÁT KHẢ NĂNG ỨC CHẾ SẢN SINH AFLATOXIN CỦA CÁC CHỦNG PHÂN LẬP. NGHỆ SINH HỌC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP PHÂN LẬP VI KHUẨN BACILLUS SUBTILIS TỪ ĐẤT, KHẢO SÁT KHẢ NĂNG ỨC CHẾ SẢN SINH AFLATOXIN CỦA CÁC CHỦNG PHÂN LẬP