xác định tính sinh miễn dịch và hiệu quả của các loại vacxin từ vi khuẩn Edwardsiella ictaluri phân lập

xác định tính sinh miễn dịch và hiệu quả của các loại vacxin từ vi khuẩn Edwardsiella ictaluri phân lập

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC  KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP XÁC ĐỊNH TÍNH SINH MIỄN DỊCH VÀ HIỆU QUẢ CỦA CÁC LOẠI VACXIN TỪ VI KHUẨN Edwardsiella ictaluri PHÂN LẬP TRÊN CÁ TRA TẠI CÁC VÙNG ĐỊA LÝ VÀO CÁC THỜI ĐIỂM KHÁC NHAU THUỘC ĐỒNG BẰNG SÔNG CỬU LONG NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC NIÊN KHÓA: 2003 – 2007 SINH VIÊN THỰC HIỆN: LÊ HÙNG DŨNG Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 09/2007 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC  XÁC ĐỊNH TÍNH SINH MIỄN DỊCH VÀ HIỆU QUẢ CỦA CÁC LOẠI VACXIN TỪ VI KHUẨN Edwardsiella ictaluri PHÂN LẬP TRÊN CÁ TRA TẠI CÁC VÙNG ĐỊA LÝ VÀO CÁC THỜI ĐIỂM KHÁC NHAU THUỘC ĐỒNG BẰNG SÔNG CỬU LONG GIÁO VIÊN HƢỚNG DẪN SINH VIÊN THỰC HIỆN TS. NGUYỄN VĂN HẢO LÊ HÙNG DŨNG Th.S. NGUYỄN DIỄM THƢ Th.S. NGUYỄN THỊ HIỀN Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 09/2007 iii LỜI CẢM TẠ Tôi xin chân thành cảm ơn: Ban Giám Hiệu trƣờng Đại học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh, Ban chủ nhiệm Bộ môn Công Nghệ Sinh Học, cùng tất cả Quý Thầy Cô đã truyền đạt kiến thức cho tôi trong suốt quá trình học tại trƣờng. TS. Nguyễn Văn Hảo đã hết lòng hƣớng dẫn cho tôi trong suốt quá trình thực tập tốt nghiệp tại Viện. Th.S. Nguyễn Diễm Thƣ, Th.S. Nguyễn Thị Hiền, Th.S. Nguyễn Mạnh Thắng, KS. Nguyễn Thị Mộng Hoàng, KS. Phạm Hồng Lan, KS. Lê Văn Tám, KS. Nguyễn Thị Hồng Vân, KS. Hà Thị Ngọc Nga đã tận tình chỉ bảo, giúp đỡ cho tôi trong suốt quá trình thực tập. Ban Giám Đốc Trung Tâm Quốc Gia Giống Thủy Sản Nƣớc Ngọt Nam Bộ, và các anh chị công nhân viên chức Trung tâm đã tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình thực tập. Các bạn sinh viên Đại học Nha Trang lớp Nuôi Trồng Thủy Sản một, hai khoá 2003 – 2008, các bạn sinh viên Đại học An Giang khoá 2004 - 2008, các bạn sinh viên lớp Nuôi Trồng Thuỷ Sản 30, Ngƣ Y 30 đã tận tình giúp đỡ và hỗ trợ công việc với tôi trong suốt quá trình thực tập. Bạn Phạm Văn Hùng, Nguyễn Thời Duy, Lê Thanh Tú, Nguyễn Thị Đang, Nguyễn Thị Hƣơng, Nguyễn Thảo Sƣơng, Đinh Thị Thuỳ Trang. Các bạn lớp Công Nghệ Sinh Học 29 đã cùng tôi trong quá trình học tập và trong suốt quá trình thực tập. Sinh viên thực hiện LÊ HÙNG DŨNG iv TÓM TẮT Cá tra là đối tƣợng nuôi có giá trị kinh tế cao trong các đối tƣợng cá nuôi nƣớc ngọt tại đồng bằng sông Cửu Long. Bệnh đốm trắng trên cá tra với các triệu chứng điển hình nhƣ việc xuất hiện các đốm trắng ở gan, thận, lách đang diễn ra khá phổ biến và gây thiệt hại đáng kể cho ngƣời nuôi. Nhằm hạn chế thiệt hại cũng nhƣ giảm thiểu việc sử dụng kháng sinh trên cá tra nuôi, chúng tôi tiến hành đề tài: “Xác định tính sinh miễn dịch và hiệu quả của các loại vacxin từ vi khuẩn Edwardsiella ictaluri phân lập trên cá tra tại các vùng địa lý vào các thời điểm khác nhau thuộc đồng bằng sông Cửu Long". Đề tài đƣợc thực hiện từ tháng 3 đến 8 năm 2007 tại Viện Nghiên Cứu Nuôi Trồng Thủy Sản II. Sau khi thu mẫu bệnh phẩm ngoài hiện trƣờng, định danh vi khuẩn bằng phƣơng pháp định danh truyền thống và phƣơng pháp PCR, thử nghiệm lại độc lực của vi khuẩn phân lập đƣợc (Edwarsiella ictaluri) và xác định liều gây chết 50% (LD50) của vi khuẩn này trên cá tại phòng thí nghiệm. Tiến hành sản xuất thử nghiệm vacxin kháng bệnh đốm trắng trên gan, thận lách cá tra bằng cách bất hoạt tế bào vi khuẩn bằng 0,4% formol kết hợp với hai chất bổ trợ là Montanide ISA 70M-PG và phèn chua nhằm đánh giá tính an toàn của các chất bổ trợ này và khả năng sinh miễn dịch của các loại vacxin trên. Những kết quả đạt đƣợc:  Vacxin với chất bổ trợ nhũ dầu Montanide ISA 70M-PG không hiệu quả, không có tính an toàn.  Vacxin với chất bổ trợ phèn chua bƣớc đầu thử nghiệm có độ an toàn, có khả năng tạo sức đề kháng và tạo đáp ứng miễn dịch cho cá tra mang mầm bệnh đốm trắng. Nồng độ vacxin thích hợp cho cá tra với chất bổ trợ phèn chua là 3x109 CFU/cá. v ABSTRACT In recent years, freshwater sutchi catfish, Pangasius hypophthalmus, becomes one of aqua-species with highly economic value in Mekong Delta. However, diseases had been occurred, particularly the white spot disease (WSD) with typical signs such as white spots of different sizes on liver, kidney and spleen. The outbreak in Tra-catfish caused unbenefied for fish farms. To reduce the risks for Tra-catfish farm as well as the antibiotics overused, we carry out this topic: “Determination of immune response on Tra-catfish and the efficacy of different vaccines against Edwardsiella ictalluri isolated from different areas and times in Mekong Delta”. This topic was performed from 3 to 8/2007 in Research Institute for Aquaculture II. After collecting fish samples in different areas on fish farms, biochemical tests and PCR analyses, challenge test to identify 50% lethal dose (LD50) of Edwardsiella ictalluri in wetlab. We carried out the experiments on vaccines with oil adjuvant - Montanide ISA 70M-PG and alum adjuvant to evaluate the immunizarion and safety of these vaccines. The results showed that:  Vaccine with oil adjuvant - Montanide ISA 70M-PG is not effective and safe.  While vaccine with alum adjuvant is safe, can induce the immune response of fish and increase its resistance to Ed. ictaluri. A suitable concentration of vaccine with alum adjuvant determined is 3 x109 CFU/ fish. vi MỤC LỤC ĐỀ MỤC TRANG TRANG TỰA LỜI CẢM TẠ iii TÓM TẮT .iv ABSTRACT . v MỤC LỤC .vi DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT ix DANH SÁCH CÁC BẢNG . x DANH SÁCH CÁC HÌNH .xi Chƣơng 1: MỞ ĐẦU 1 1.1 Đặt vấn đề 1 1.2 Mục đích và yêu cầu 2 Chƣơng 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU . 3 2.1 Giới thiệu về cá tra Pangasius hypophthalmus Sauvage, 1878 .3 2.1.1 Hình thái 3 2.1.2 Đặc điểm sinh trƣởng 4 2.1.3 Đặc điểm sinh sản .4 2.1.4 Tình hình sản xuất và tiêu thụ cá tra 5 2.2 Các bệnh thƣờng gặp trên cá tra 5 2.2.1 Bệnh nhiễm khuẩn .5 2.2.1.1 Bệnh nhiễm khuẩn huyết do vi khuẩn Aeromonas .5 2.2.1.2 Bệnh nhiễm khuẩn do Pseudomonas .6 2.2.1.3 Bệnh nhiễm khuẩn huyết do Edwardsiella .6 2.2.1.4 Bệnh đốm trắng nội tạng 7 2.2.2 Bệnh ký sinh trùng 9 2.2.2.1 Bệnh trùng bánh xe 9 2.2.2.2 Bệnh trùng quả dƣa .10 2.2.2.3 Bệnh trùng mỏ neo .10 2.2.2.4 Bệnh do sán lá đơn chủ ký sinh 10 2.2.2.5 Bệnh do giun sán nội ký sinh .11 2.2.2.6 Bệnh rận cá .11 2.2.3 Bệnh nấm thủy mi .11 vii 2.3 Giới thiệu về vacxin phòng bệnh .12 2.3.1 Hệ thống đáp ứng miễn dịch đặc hiệu .12 2.3.2 Các loại vacxin: .12 2.3.2.1 Vacxin bất hoạt (chết) .12 2.3.2.2 Vacxin sống nhƣợc độc 13 2.3.2.3 Vacxin DNA .13 2.3.3 Tình hình sử dụng vacxin 13 2.3.3.1 Trên thế giới .13 2.3.3.2 Tại Việt Nam 14 2.3.4 Các phƣơng pháp sử dụng vacxin phòng bệnh cho cá .15 2.3.4.1 Tiêm 15 2.3.4.2 Ngâm 15 2.3.4.3 Cho ăn .15 2.3.5 Giới thiệu sơ lƣợc về chất bổ trợ .16 2.3.5.1 Nguyên lý tác dụng của chất bổ trợ 16 2.3.5.2 Các loại chất bổ trợ thông dụng 16 Chƣơng 3: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP . 18 3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 18 3.2 Vật liệu, Dụng cụ, Hóa chất .18 3.2.1 Vật liệu .18 3.2.2 Thiết bị và dụng cụ 19 3.2.3 Hoá chất 20 3.3 Phƣơng pháp nghiên cứu .20 3.3.1 Chuẩn bị cá 20 3.3.2 Chuẩn bị vacxin .20 3.3.3 Chuẩn bị huyền dịch vi khuẩn sống 21 3.3.4 Phƣơng pháp gây nhiễm thực nghiệm .22 3.3.5 Phƣơng pháp theo dõi cá sau khi gây nhiễm .22 3.3.6 Phƣơng pháp thu mẫu máu, mẫu vi khuẩn 22 3.3.7 Phƣơng pháp vi ngƣng kết xác định hiệu giá kháng thể .24 3.3.8 Phƣơng pháp xử lý thống kê .25 3.4 Bố trí thí nghiệm 25 3.4.1 Thí nghiệm 1: Xác định hiệu quả vacxin với chất bổ trợ nhũ dầu 25 3.4.2 Thí nghiệm 2: Xác định lại độc lực ba chủng vi khuẩn .27 3.4.3 Thí nghiệm 3: Xác định hiệu quả vacxin với chất bổ trợ phèn chua 27 viii Chƣơng 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN . 29 4.1 Kết quả thí nghiệm xác định hiệu quả của vacxin với chất bổ trợ nhũ dầu 29 4.2 Kết quả thí nghiệm xác định lại độc lực của ba chủng vi khuẩn .35 4.3 Kết quả thí nghiệm xác định hiệu quả vacxin với chất bổ trợ phèn chua .36 4.3.1 Kết quả theo dõi bệnh tích lâm sàng của cá 37 4.3.2 Kết quả phản ứng vi ngƣng kết xác định hiệu giá kháng thể 40 Chƣơng 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 44 5.1 Kết luận 44 5.2 Đề nghị .44 TÀI LIỆU THAM KHẢO . 46 1. Tài liệu tiếng Việt 46 2. Tài liệu tiếng nƣớc ngoài .47 3. Tài liệu từ internet 47 PHỤ LỤC ix DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT ĐBSCL : Đồng bằng sông Cửu Long TCB : Thức ăn chế biến TACN : Thức ăn công nghiệp Viện NC NTTS II : Viện Nghiên Cứu Nuôi Trồng Thủy Sản II NAVETCO : Công Ty Thuốc Thú Y Trung Ƣơng 3 TBVK, tbvk : Tế bào vi khuẩn CFU : Colony form unit LD50 : Lethal dose 50% ĐC : Đối chứng Nƣớc SL :Nƣớc muối sinh lí PBS : Phosphate buffered saline BSA : Bovine serum albumin x DANH SÁCH CÁC BẢNG BẢNG TRANG Bảng 3. 1. Ba chủng vi khuẩn Ed. ictaluri phân lập ở các thời điểm khác nhau . 19 Bảng 3. 2. Bố trí thí nghiệm xác định hiệu quả của vacxin dùng chất bổ trợ nhũ dầu Montanide ISA 70M-PG 26 Bảng 3. 3. Bố trí thí nghiệm xác định lại độc lực của ba chủng vi khuẩn 27 Bảng 3. 4. Bố trí thí nghiệm xác định hiệu quả của vacxin với chất bổ trợ phèn chua 28 Bảng 4. 1. Thí nghiệm 1: Tổng kết số lƣợng cá chết trong suốt thời gian thí nghiệm và tỉ lệ cá chết của từng nghiệm thức 29 Bảng 4. 2. Kết quả theo dõi biểu hiện bệnh lý của cá thí nghiệm 1 30 Bảng 4. 3. Kết quả thí nghiệm xác định lại độc lực ba chủng vi khuẩn . 35 Bảng 4. 4. Kết quả theo dõi biểu hiện bệnh lý của cá thí nghiệm 2 35 Bảng 4. 5. Kết quả thí nghiệm 3 - Tổng kết số lƣợng cá chết trong suốt thời gian thí nghiệm và tỉ lệ chết của từng nghiệm thức 36 Bảng 4. 6. Kết quả theo dõi biểu hiện bệnh lý của cá thí nghiệm 3 36 Bảng 4. 7. Kết quả giá trị hiệu giá kháng thể trung bình thí nghiệm 3 . 40 [...]... cứu và dần dần đƣa vào áp dụng trong thực tế Với mong muốn góp phần vào vi c ổn định nghề nuôi trồng thuỷ sản và do nhu cầu cấp thiết của thực tế chúng tôi tiến hành đề tài "Xác định tính sinh miễn dịch và hiệu quả của các loại vacxin từ vi khuẩn Edwardsiella ictaluri phân lập trên cá tra tại các vùng địa lý vào các thời điểm khác nhau thuộc ĐBSCL" 2 1.2 Mục đích và yêu cầu Xác định tính sinh miễn dịch. .. miễn dịch của các loại vacxin và hiệu quả của chúng đối với vi khuẩn Ed ictaluri đƣợc phân lập trên cá tra ở các vùng địa lí vào các thời điểm khác nhau:  Xác định hiệu quả của chất bổ trợ nhũ dầu Montanide ISA 70 M-PG và chất bổ trợ phèn chua về độ an toàn, khả năng tạo đáp ứng miễn dịch và khả năng bảo hộ trên cá tra đối với vi khuẩn Ed ictaluri  Sử dụng phƣơng pháp vi ngƣng kết xác định hiệu giá... Xuân và ctv., 1994) 2.3 Giới thiệu về vacxin phòng bệnh 2.3.1 Hệ thống đáp ứng miễn dịch đặc hiệu Để hiểu rõ tác dụng của vacxin trƣớc hết chúng ta cần tìm hiểu về nguyên lí cơ bản của sự kích thích đối với hệ thống miễn dịch đặc hiệu Khả năng đáp ứng miễn dịch hay miễn dịch đặc hiệu gồm hai dạng: + Miễn dịch dịch thể: Khi có kháng nguyên vào cơ thể hai loại tế bào lympho T và B cùng tham gia vào quá... trị liệu tốn nhiều chi phí, hiệu quả của thuốc kháng sinh chỉ trong thời gian ngắn, nhiều vi khuẩn kháng kháng sinh và đồng thời với những hiểu biết rõ ràng hơn về hệ thống miễn dịch của cá và về yếu tố độc lực chuyên biệt của mầm bệnh cá, những điều đó thúc đẩy sự nghiên cứu và sản xuất vacxin Đầu tiên là những nghiên cứu về hệ thống đáp ứng miễn dịch của cá với các vi khuẩn Vibrio anguillarum, Pseudomonas... Nam Bộ (trực thuộc Vi n NC NTTS II) 2/ Vi khuẩn Ba chủng vi khuẩn Ed ictaluri phân lập tại ba địa điểm khác nhau xảy ra vào thời điểm dịch bệnh, cá thu mẫu có những dấu hiệu bệnh tích điển hình nhƣ bơi lờ đờ, bỏ ăn, xuất huyết các vây và gốc vây; bên trong gan, thận, lách có nhiều đốm trắng nhỏ Trong đó chủng vi khuẩn EI151 đã đƣợc phân lập, định danh (test sinh hoá, PCR) và xác định liều gây chết... hình ovan Vi khuẩn này có thể mọc đƣợc từ 8 – 44oC, nhiệt độ thích hợp nhất là 37 – 38oC (trích từ Trần Thị Minh Tâm và ctv., 2003) 8 + Vi khuẩn Ed ictaluri thuộc họ Enterobacteriacea phân lập từ cá tra là vi khuẩn gram âm (-), không di động, lên men, không oxy hoá Cho phản ứng catalase dƣơng tính, âm tính trong phản ứng oxidase (Từ Thanh Dung và ctv., 2003) Theo Plumb (1993) vi khuẩn Ed ictaluri phát... tiến hành phân lập, định danh vi khuẩn (Hình 3.3) Hình 3 3 Thao tác lấy mẫu vi khuẩn trên thận 24 3.3.7 Phƣơng pháp vi ngƣng kết xác định hiệu giá kháng thể Nguyên tắc: Phản ứng vi ngƣng kết là sự kết hợp giữa kháng nguyên và kháng thể đặc hiệu thể hiện dƣới dạng các hạt nhìn thấy đƣợc Phản ứng này đƣợc thực hiện trên phiến nhựa 96 giếng Pha loãng dung dịch kích thích ngay trên các dãy vi giếng của phiến... đục và đếm để xác định số lƣợng vi khuẩn Bất hoạt vi khuẩn: Vô hoạt huyền dịch này bằng dung dịch formol với tỉ lệ 0,4 % trong 48 giờ ở nhiệt độ 4oC Để kiểm tra lại vi khuẩn có hoàn toàn bị bất hoạt hay không, ta cấy vi khuẩn mới bất hoạt lên môi trƣờng thạch máu, nếu vi khuẩn không mọc, ta kết luận vi khuẩn đã bị bất hoạt 21 Thêm chất bổ trợ: Trộn dung dịch chất bổ trợ (theo hƣớng dẫn của nhà sản xuất)... quá trình bảo quản và sử dụng vacxin sống (Lê Văn Hùng, 2002) 2.3.2.3 Vacxin DNA Vacxin DNA đƣợc sản xuất dựa vào kỹ thuật DNA tái tổ hợp, vacxin này chứa gen mã hóa cho kháng nguyên bề mặt của nhiều loại vi sinh vật gây bệnh Trong thủy sản, vacxin DNA đƣợc tập trung nghiên cứu là vacxin phòng các bệnh virus (Gudding và ctv., 1999) 2.3.3 Tình hình sử dụng vacxin 2.3.3.1 Trên thế giới Vacxin cho cá... bằng trắc nghiệm F của phần mềm statgraphic 7.0 3.4 Bố trí thí nghiệm 3.4.1 Thí nghiệm 1: Xác định hiệu quả vacxin với chất bổ trợ nhũ dầu Mục tiêu của thí nghiệm này là nhằm xác định khả năng sử dụng của chất bổ trợ nhũ dầu Montanide ISA 70M-PG của Seppic - Bố trí sử dụng ba loại vacxin A, B, C tƣơng ứng với chủng vi khuẩn kí hiệu lần lƣợt là Ei-23, Ei-151, Ei-338 (Bảng 3.2) Mỗi loại vacxin gồm bốn nghiệm . NGHỆ SINH HỌC  XÁC ĐỊNH TÍNH SINH MIỄN DỊCH VÀ HIỆU QUẢ CỦA CÁC LOẠI VACXIN TỪ VI KHUẨN Edwardsiella ictaluri PHÂN LẬP TRÊN CÁ TRA TẠI CÁC. " ;Xác định tính sinh miễn dịch và hiệu quả của các loại vacxin từ vi khuẩn Edwardsiella ictaluri phân lập trên cá tra tại các vùng địa lý vào