Sử dụng một số hóa chất để cải thiện hiệu quả ly trích DNA từ lông

Sử dụng một số hóa chất để cải thiện hiệu quả ly trích DNA từ lông

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP.HCM BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ***000*** BÙI THỊ NGỌC BÍCH SỬ DỤNG MỘT SỐ HÓA CHẤT ĐỂ CẢI THIỆN HIỆU QUẢ LY TRÍCH DNA TỪ LÔNG Luận văn kỹ sƣ Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 9/2006 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP.HCM BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ***000*** SỬ DỤNG MỘT SỐ HÓA CHẤT ĐỂ CẢI THIỆN HIỆU QUẢ LY TRÍCH DNA TỪ LÔNG Luận văn kỹ sƣ Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Giáo viên hƣớng dẫn: Sinh viên thực hiện: PGS. TS. TRẦN THỊ DÂN BÙI THỊ NGỌC BÍCH KS. NGUYỄN VĂN ÚT Khóa: 2002 – 2006 Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 9/2006 MINISTRY OF EDUCATION AND TRAINING NONG LAM UNIVERSITY, HCMC DEPARTMENT OF BIOTECHNOLOGY ***000*** USE SOME CHEMICALS TO ENHANCE ABILITY OF EXTRACTING DNA FROM HAIR Graduation thesis Major: Biotechnology Professor: Student: Ph. D. TRAN THI DAN BUI THI NGOC BICH Ba. NGUYEN VAN UT Term: 2002 – 2006 HCMC 9/2006 iii LỜI CẢM ƠN Tôi xin chân thành cảm ơn: * Ban giám hiệu trƣờng Đại Học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh, ban chủ nhiệm Bộ Môn Công Nghệ Sinh Học cùng Quý thầy cô đã tạo điều kiện tốt đẹp cũng nhƣ truyền đạt kiến thức trong suốt quá trình học tập tại trƣờng. * Ban giám đốc cùng tập thể cán bộ nhân viên Trung Tâm Phân Tích Thí Nghiệm trƣờng Đại Học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh đã tạo điều kiện thuận lợi trong suốt quá trình thực tập tốt nghiệp. * Tập thể cán bộ thú y và các cô chú tại lò mổ tập trung huyện Dĩ An – Bình Dƣơng đã giúp đỡ tôi trong suốt quá trình lấy mẫu. * PGS. TS. Trần Thị Dân, KS. Nguyễn Văn Út đã hƣớng dẫn tận tình, để tôi hoàn thành tốt đề tài. * Bạn Lƣơng Quý Phƣơng đã giúp tôi lấy mẫu lông để thí nghiệm. * Các anh chị tại Trung tâm Phân Tích Thí nghiệm Trƣờng Đại Học Nông Lâm TP HCM đã tạo mọi điều kiện cơ sở vật chất, kỹ thuật để tôi làm tốt đề tài. * Xin cảm ơn bạn bè ở lớp CNSH 28 đã giúp đỡ tôi và cùng học tập trong suốt 4 năm đại học. Sinh viên thực hiện Bùi Thị Ngọc Bích iv TÓM TẮT KHÓA LUẬN BÙI THỊ NGỌC BÍCH, Đại Học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh, tháng 9/2006, “SỬ DỤNG MỘT SỐ HÓA CHẤT CẢI THIỆN HIỆU QUẢ LY TRÍCH DNA TỪ LÔNG”. Hƣớng dẫn khoa học: 1. PGS. TS. Trần Thị Dân 2. KS. Nguyễn Văn Út Đề tài đƣợc tiến hành từ ngày 14 – 02 – 2006 đến ngày 30 – 07 – 2006 tại Trung Tâm Phân Tích Thí Nghiệm Trƣờng Đại Học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh. Trong các thí nghiệm sinh học phân tử, ngƣời ta thƣờng sử dụng mẫu máu, da, cơ để ly trích DNA. Tuy nhiên, nhiều khi ta không thể có những loại mẫu đó, ví dụ trong khoa học hình sự hay khi nghiên cứu về những loài tiệt chủng hay loài quý hiếm. Ngoài ra, thu thập mẫu lông dễ dàng hơn thu thập các loại mẫu khác trên thú sống. Với mục đích tìm một quy trình tối ƣu cho ly trích DNA từ nhiều nguồn lông, đề tài đƣợc tiến hành trên lông bò và lông heo. Kết quả ly trích đƣợc đánh giá dựa vào tỷ số OD của mẫu DNA và hiệu suất thành công của PCR với đoạn mồi phân biệt giới tính và đoạn mồi phát hiện gen halothane. Kết quả đạt đƣợc nhƣ sau: 1. Dung dịch đệm ly trích chứa proteinase K và Ca2+ ở các nồng độ 2 mM, 6 mM và 10 mM cho DNA với tỷ số OD đạt khoảng 1,6 – 1,69. Trong đó, sản phẩm PCR từ DNA của gốc lông bò khi ly trích với dung dịch đệm có 10 mM Ca2+ cho 1 băng dài 370 bp của gen giới tính. 2. DNA ly trích từ mẫu gốc lông heo và gốc lông bò không có sự khác biệt nhau về tỷ số OD và hàm lƣợng . 3. DNA từ gốc lông bò (tỷ số OD trung bình 1,76) tinh sạch và có hàm lƣợng cao hơn DNA từ ngọn lông (1,2). 4. DNA ly trích từ dung dịch đệm có DTT (tỷ số OD trung bình 1,84) tinh sạch hơn DNA từ dung dịch đệm không có DTT (1,58). v 5. Nồng độ CTAB trong quá trình ly trích có ảnh hƣởng đến độ tinh sạch của DNA. Không bổ sung CTAB cho tỷ số OD cao nhất (1,84 ); 0,06% CTAB cho OD = 1,6; 0,2% CTAB cho OD = 1,3. 6. Sử dụng BSA cũng không có tác dụng trong việc cải thiện kết quả PCR vì không nhân đƣợc đoạn DNA 655 bp của gen giới tính. Nhìn chung, các hoá chất đƣợc bổ sung vào quy trình ly trích DNA và hỗn hợp PCR chỉ cho đoạn sản phẩm PCR ngắn (370 bp) mà không có đoạn DNA dài (655 bp) của gen giới tính. Đồng thời, các thí nghiệm đều không cho kết quả mong muốn khi PCR phát hiện gen halothane trên 5 mẫu lông heo. vi MỤC LỤC TRANG Lời cảm ơn . 1 Tóm tắt khóa luận .iv Mục lục .vi Danh sách các chữ viết tắt . viii Danh sách các bảng ix Danh sách các hình và biểu đồ x PHẦN I. MỞ ĐẦU 1 1.1. Đặt vấn đề . 1 1.2. Mục tiêu và yêu cầu 1 1.2.1. Mục tiêu . 1 1.2.2. Yêu cầu 2 PHẦN II. TỔNG QUAN TÀI LIỆU . 3 2.1. Cấu trúc tổng quan của lông . 3 2.2. Cấu trúc của lông bò và lông heo . 3 2.3. Cấu trúc của melanin 4 2.4. Cấu tạo của keratin . 5 2.5. Những công trình tách chiết DNA từ lông . 5 2.6. Nguyên tắc của PCR . 7 2.7. Nguyên tắc xác định gen giới tính và gen halothane 9 2.7.1. Nguyên tắc xác định gen giới tính . 9 2.7.2. Nguyên tắc xác định gen halothane . 9 PHẦN III. NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 11 3.1. Nội dung nghiên cứu 11 3.2. Địa điểm và thời gian tiến hành 11 3.3. Vật liệu . 11 3.3.1. Nguồn mẫu chiết xuất DNA 11 3.3.2. Đoạn mồi . 11 3.3.2.1. Đoạn mồi của gen xác định giới tính 11 vii 3.2.2.2. Đoạn mồi của gen halothane 12 3.4. PHƢƠNG PHÁP TIẾN HÀNH . 12 3.4.1. Lấy và trữ mẫu . 12 3.4.2. Tách chiết DNA . 12 3.4.3. Đánh giá độ tinh sạch và hàm lƣợng DNA ly trích . 15 3.4.4. Thực hiện phản ứng PCR 15 3.4.4.1. Multiplex PCR xác định giới tính 15 3.4.4.2. PCR xác định gen halothane . 16 3.4.5. Điện di và quan sát kết quả 17 3.4.5.1. Chuẩn bị gel agarose 17 3.4.5.2. Kết quả điện di PCR . 17 3.5 Xử lý số liệu 17 PHẦN IV. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN . 18 4.1. Thí nghiệm 1: Khảo sát nồng độ Ca2+ trong dung dịch đệm ly trích DNA 18 4.2. Thí nghiệm 2: So sánh DNA ly trích từ gốc và ngọn lông bò . 19 4.3. Thí nghiệm 3: So sánh DNA ly trích từ lông heo và lông bò 20 4.4. Thí nghiệm 4: Khảo sát tác dụng của DTT trong việc phân cắt keratin khi ly trích DNA . 21 4.5. Thí nghiệm 5: Khảo sát tác dụng của CTAB trong việc loại bỏ melanin 23 4.6. Thí nghiệm 6: Sử dụng BSA trong phản ứng PCR 23 PHẦN V. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 25 5.1. Kết luận . 25 5.2. Đề nghị . 25 VI. TÀI LIỆU THAM KHẢO . 26 PHỤ LỤC 28 viii DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT bp base pair ctv cộng tác viên DNA deoxyribonucleic acid NST nhiễm sắc thể OD optical density DTT Dithiothreitol CTAB Cetyltrimetylamonium bromide BSA bovine serum albumine PCR polymerase chain reaction Taq thermus aquaticus Tỷ số OD tỷ số OD260 nm /OD280 nm UI unit UV ultra violet W wave ix DANH SÁCH CÁC BẢNG TRANG Bảng 3.1 Trình tự các đoạn mồi của gen xác định giới tính 12 Bảng 3.2 Thành phần hỗn hợp PCR xác định giới tính . 15 Bảng 3.3 Chu kỳ nhiệt trong PCR xác định giới tính . 16 Bảng 3.4 Thành phần hỗn hợp PCR xác định gen halothane . 16 Bảng 3.5 Chu kỳ nhiệt trong PCR xác định gen halothane 17 Bảng 4.1 Tỷ số OD và hàm lƣợng DNA thu hồi tƣơng ứng với các nồng độ Ca2+ 18 Bảng 4.2a Tỷ số OD và hàm lƣợng DNA thu hồi từ 2 vị trí lông bò 19 Bảng 4.2b Kết quả PCR từ 2 vị trí lông bò . 19 Bảng 4.3 Tỷ số OD và hàm lƣợng DNA thu hồi từ 2 nguồn lông 21 Bảng 4.4 Tỷ số OD và hàm lƣợng DNA thu hồi từ việc sử dụng DTT 22 Bảng 4.5 Tỷ số OD và hàm lƣợng DNA thu hồi từ 3 mức CTAB 23 Bảng 4.6 Kết quả PCR tƣơng ứng với nồng độ BSA đƣợc bổ sung . 24 [...]... Kết quả PCR từ ngọn lông và gốc lông bò N: ngọn, G: gốc, ĐC: đối chứng là sản phẩm PCR với DNA ly trích từ cơ vân 4.3 Thí nghiệm 3: So sánh DNA ly trích từ lông heo và lông bò Các mẫu đƣợc ly trích từ gốc lông, tỷ số OD và hàm lƣợng DNA đƣợc trình bày trong Bảng 4.3 21 Bảng 4.3 Tỷ số OD và hàm lƣợng DNA thu hồi từ 2 nguồn lông Chỉ tiêu Lông bò Lông heo P Tỷ số OD 1,82 0,08 1,69 0,11 0,07 Hàm lƣợng DNA. .. quả PCR từ mẫu có 10 mM Ca2+ .19 Hình 4.2 Kết quả PCR từ ngọn lông và gốc lông bò .20 Hình 4.3 Kết quả PCR với DNA từ gốc lông heo và gốc lông bò 21 Hình 4.4 Kết quả PCR từ mẫu có DTT và không DTT 22 Hình 4.6 Kết quả PCR từ mẫu sử dụng và không sử dụng BSA 24 Biểu đồ 4.1 Tỷ số OD và hàm lƣợng DNA ly trích tƣơng ứng với các nồng độ Ca2+ 18 Biểu đồ 4.2 Tỷ số OD của DNA ly trích. .. 0,31 0,3 0,09 0,05 0,14 Số mẫu 5 5 2 1.82 1.69 1.5 Tỷ số OD 1 Hàm lượng DNA (µg/µl) 0.31 0.5 0.09 0 Lông bò Lông heo Biểu đồ 4.3: Tỷ số OD của DNA ly trích từ mẫu gốc lông heo và lông bò Tỷ số OD giữa DNA gốc lông của heo và bò không có sự khác biệt nhiều (P > 0,05) Sản phẩm PCR của DNA ly trích từ lông heo không cho băng nào Có thể trong DNA ly trích từ lông heo vẫn còn tạp chất hoặc vì lý do khác,... đó, sản phẩm PCR từ DNA của gốc lông bò ly trích bởi dung dịch đệm 10 mM Ca2+ cho 1 băng dài 370 bp - DNA từ gốc lông bò (tỷ số OD trung bình 1,76) có độ tinh sạch và hàm lƣợng cao hơn DNA từ ngọn lông ( OD = 1,2) - Mẫu gốc lông heo và gốc lông bò không khác nhau về tỷ số OD và hàm lƣợng DNA ly trích - DNA ly trích từ dung dịch đệm có DTT (tỷ số OD trung bình 1,84) tinh sạch hơn DNA từ dung dịch đệm... trong quá trình ly trích ảnh hƣởng đến độ tinh sạch của DNA - Sử dụng nồng độ BSA từ 0,0005 µg/µl đến 0,5 µg/µl trong phản ứng PCR vẫn không cải thiện đƣợc hiệu quả PCR khi dùng DNA từ mẫu lông - Quy trình ly trích với dung dịch đệm chứa proteinase K và Ca2+ hiệu quả trong ly trích DNA với những đoạn khuếch đại dƣới 400 bp Tóm lại, Ca2+ trong dung dịch đệm ly trích đã cải thiện tỷ số OD nhƣng chỉ cho... PCR từ mẫu có 10 mM Ca2+ La: ladder, Ca: 10mM Ca2+, ĐC: đối chứng là sản phẩm PCR với DNA ly trích từ cơ vân 4.2 Thí nghiệm 2: So sánh DNA ly trích từ gốc và ngọn lông bò DNA đƣợc ly trích từ mẫu gốc lông dài khoảng 5 cm tính từ gốc và mẫu ngọn lông dài khoảng 5 cm ở phần đuôi của thân lông Kết quả đo OD và hàm lƣợng DNA đƣợc trình bày trong bảng 4.2a Bảng 4.2a Tỷ số OD và hàm lƣợng DNA thu hồi từ 2... trí lông bò Chỉ tiêu Gốc lông Thân lông P Tỷ số OD 1,76 0,09 1,2 0,07 0,0001 Hàm lƣợng DNA (µg/µl) 0,34 0,28 0,07 0,03 0,04 Số mẫu 5 6 2 1.76 1.5 Tỷ số OD 1.2 1 0.5 Hàm lượng DNA (µg/µl) 0.34 0.07 0 Gốc lông Thân lông Biểu đồ 4.2: Tỷ số OD của DNA ly trích từ gốc lông và ngọn lông bò 20 Bảng 4.2b Kết quả PCR từ 2 vị trí lông bò Số mẫu tiến Số mẫu có sản Tỷ lệ mẫu có hành phẩm PCR sản phẩm PCR Gốc lông. .. dõi là tỷ số OD, hàm lƣợng DNA và sản phẩm PCR 14 của gen xác định giới tính * Thí nghiệm 3: So sánh DNA ly trích từ lông heo và lông bò Với mục đích đánh giá quy trình ly trích trên nhiều mẫu lông khác nhau chúng tôi sử dụng mẫu lông heo và lông bò Thí nghiệm đƣợc bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên một yếu tố để so sánh chất lƣợng DNA từ 2 nguồn Các mẫu đều đƣợc nghiền trong N2 lỏng, sử dụng dung... lông của nai đỏ và hoẵng bằng sử dụng phƣơng pháp PCR - Mẫu lông đƣợc lấy ở mông Nhú lông đƣợc cắt khoảng 2 mm tính từ điểm gốc của lông Họ sử dụng đồng thời hai tiến trình ly trích, Dneasy Tissue Kit dùng cho ly trích DNA từ móng và lông của QIAamp và phƣơng pháp dựa trên Chelex -100 của Biorad - Trong giai đoạn kiểm tra sơ bộ, họ ly trích DNA từ những mẫu lông tƣơi từ những con vật đã biết về loài... dịch đệm ly trích không có EDTA chứa proteinase K và Ca2+ Nồng độ Ca2+ nào trong thí nghiệm 1 cho tỷ số OD cao nhất đƣợc sử dụng trong thí nghiệm 3 Số mẫu theo dõi là 5 mẫu cho mỗi loại Mẫu là gốc lông đƣợc cắt dài khoảng 5 cm tính từ gốc Chỉ tiêu theo dõi là tỷ số OD và hàm lƣợng DNA thu hồi Một số mẫu có tỷ số OD cao đƣợc sử dụng trong phản ứng PCR để xác định giới tính với DNA ly trích từ lông bò . SINH HỌC ***000*** BÙI THỊ NGỌC BÍCH SỬ DỤNG MỘT SỐ HÓA CHẤT ĐỂ CẢI THIỆN HIỆU QUẢ LY TRÍCH DNA TỪ LÔNG Luận văn kỹ sƣ. BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ***000*** SỬ DỤNG MỘT SỐ HÓA CHẤT ĐỂ CẢI THIỆN HIỆU QUẢ LY TRÍCH DNA TỪ LÔNG Luận văn kỹ sƣ Chuyên