Xác định quy trình trích ly DNA từ lông heo.

Xác định quy trình trích ly DNA từ lông heo.

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP.HCM BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC ***000*** KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP XÁC ĐỊNH QUY TRÌNH LY TRÍCH DNA TỪ LÔNG HEO Ngành học: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Niên khóa: 2003 – 2007 Sinh viên thực hiện: NGUYỄN THỊ NHA TRANG Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 9/2007 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP.HCM BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ***000*** XÁC ĐỊNH QUY TRÌNH LY TRÍCH DNA TỪ LƠNG HEO Giáo viên hƣớng dẫn: Sinh viên thực hiện: PGS TS TRẦN THỊ DÂN KS NGUYỄN VĂN ÚT NGUYỄN THỊ NHA TRANG Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 9/2007 LỜI CẢM ƠN Kính dâng Bố Mẹ, ngƣời sinh thành, dạy dỗ ln động viên để có đƣợc kết hôm Cảm ơn Anh hai hỗ trợ động viên em suốt trình học tập Cảm ơn gia đình thân u tơi! iii LỜI CẢM ƠN Đặc biệt xin chân thành cảm ơn: * PGS TS Trần Thị Dân, KS Nguyễn Văn Út hƣớng dẫn tận tình cho em suốt trình thực tập giúp em hoàn thành luận văn tốt nghiệp Xin chân thành cảm ơn: * Ban giám hiệu trƣờng Đại Học Nơng Lâm TP Hồ Chí Minh, Bộ Mơn Công Nghệ Sinh Học Quý thầy cô tạo điều kiện tốt đẹp nhƣ truyền đạt kiến thức suốt trình học tập trƣờng * Ban giám đốc tập thể cán nhân viên Trung Tâm Phân Tích Thí Nghiệm trƣờng Đại Học Nơng Lâm TP Hồ Chí Minh tạo điều kiện thuận lợi suốt trình thực tập tốt nghiệp * Xin cảm ơn KS Lê Thị Thu Hà anh chị phịng Cơng Nghệ Sinh Học - Viện Khoa học Kỹ thuật Nơng nghiệp miền Nam tận tình bảo giúp đỡ thời gian làm quen với thao tác phịng thí nghiệm q trình làm đề tài * Tập thể cán thú y lị mổ tập trung huyện Dĩ An – Bình Dƣơng giúp đỡ tơi suốt trình lấy mẫu Sinh viên thực NGUYỄN THỊ NHA TRANG iv TÓM TẮT KHÓA LUẬN Đề tài “XÁC ĐỊNH QUY TRÌNH LY TRÍCH DNA TỪ LƠNG HEO” đƣợc tiến hành từ ngày 10 – 03 – 2007 đến ngày 10 – 07 – 2007 Trung Tâm Phân Tích Thí Nghiệm Trƣờng Đại Học Nơng Lâm Tp Hồ Chí Minh Hƣớng dẫn đề tài: PGS TS Trần Thị Dân KS Nguyễn Văn Út Việc ly trích DNA từ mẫu máu, mẫu da, mẫu trở nên quen thuộc thí nghiệm sinh học phân tử trƣớc Tuy nhiên, nhiều khơng thể có loại mẫu đó, ví dụ khoa học hình sự, khảo cổ học, hay nghiên cứu loài tiệt chủng hay lồi q hiếm, ta có đƣợc mẫu lơng hay tóc Do đó, việc lấy mẫu lơng hay tóc ly trích DNA từ loại mẫu trở nên cần thiết trƣờng hợp Ngoài ra, việc thu thập mẫu lông dễ dàng thu thập loại mẫu khác (nhƣ máu, da, cơ…) thú sống Chúng ta nhổ cắt vài lông thú cách dễ dàng mà giết mổ hay gây stress cho thú sống Việc ly trích DNA từ lơng mở rộng cho ly trích DNA từ cấu trúc tƣơng tự lơng nhƣ móng, mỏ, da, xƣơng… Với mục đích tìm quy trình tối ƣu cho ly trích DNA từ nhiều nguồn lơng, từ nhiều vị trí sợi lơng xác định xuất gen halothane, đề tài đƣợc tiến hành lơng heo Kết ly trích đƣợc đánh giá dựa vào tỷ số OD mẫu DNA hiệu suất thành công PCR với đoạn mồi phát gen halothane Kết đạt đƣợc nhƣ sau: Sử dụng buffer ly trích chứa proteinase K nồng độ 0,8 mg/ml, mg/ml 1,2 mg/ml cho chất lƣợng DNA tốt với tỷ số OD từ 1,75 – 1,84 DNA đƣợc ly trích với DTT nồng độ 50 mM tinh (OD = 1,65) thành công đƣợc dùng làm nguồn mẫu cho phản ứng PCR v Sử dụng CTAB 0,2% cho DNA tinh (tỷ số OD trung bình 1,80) phản ứng PCR khuếch đại đƣợc gen halothan nồng độ CTAB 0,2% Vị trí gốc lơng cho DNA ly trích tinh (OD = 2,05), vị trí thân lơng (OD = 1,84), sợi lông (OD = 1,75) vị trí lơng (OD = 1,4) Phản ứng PCR khuếch đại gen halothane cho tỷ lệ thành công cao mẫu gốc lông (70%), mẫu thân lông (60%) sợi lông (50%) Phản ứng PCR không thành công mẫu lông vi MỤC LỤC TRANG Lời cảm ơn iii Tóm tắt khóa luận v Mục lục vii Danh sách chữ viết tắt .x Danh sách bảng xi Danh sách hình biểu đồ xii PHẦN I MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục tiêu yêu cầu 1.2.1 Mục tiêu .2 1.2.2 Yêu cầu PHẦN II TỔNG QUAN TÀI LIỆU .3 2.1 Cấu trúc lông 2.1.1 Cấu trúc tổng quan .3 2.1.2 Cấu trúc melanin 2.1.3 Cấu trúc keratin 2.1.4 Các liên kết lông 2.1.4.1 Liên kết cuộn xoắn A .5 2.1.4.2 Liên kết protein keratin 2.1.4.3 Liên kết hydrogen .6 2.1.4.4 Liên kết muối 2.1.4.5 Liên kết cystine 2.1.4.6 Liên kết đƣờng 2.1.5 Chu kỳ phát triển lông heo 2.2 Những cơng trình tách chiết DNA từ lơng .7 2.2.1 Những cơng trình tách chiết DNA từ lơng nƣớc ngồi vii 2.2.2 Những cơng trình tách chiết DNA từ lông nƣớc 2.3 Phản ứng PCR (polymerase chain reaction) 10 2.3.1 Nguyên tắc PCR 10 2.3.2 Những thành phần tham gia vào phản ứng PCR .10 2.4 Gen halothane 11 2.4.1 Khái quát gen halothane .11 2.4.2 Ảnh hƣởng gen halothane 12 2.4.2.1 Ảnh hƣởng gen halothane đến suất sinh sản 12 2.4.2.2 Ảnh hƣởng gen halothane đến sinh trƣởng phẩm chất thịt 13 2.5 Những công trình nghiên cứu halothane 13 2.5.1 Nguyên tắc xác định gen halothane 13 2.5.2 Những cơng trình nghiên cứu halothane nƣớc ngồi 14 2.5.3 Những cơng trình nghiên cứu halothane nƣớc .14 PHẦN III NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16 3.1 Nội dung nghiên cứu 16 3.2 Địa điểm thời gian tiến hành 16 3.3 Vật liệu 16 3.3.1 Nguồn mẫu chiết xuất DNA 16 3.3.2 Đoạn mồi 16 3.3.3 Hóa chất 16 3.3.4 Dụng cụ thiết bị dùng đề tài 17 3.3.4.1 Dụng cụ 17 3.3.4.2 Thiết bị 17 3.4 Phƣơng pháp tiến hành 18 3.4.1 Lấy trữ mẫu 18 3.4.2 Tách chiết DNA .19 3.4.2.1 Thiết lập quy trình ly trích DNA từ lơng heo 19 3.4.2.2 Áp dụng quy trình ly trích DNA lên vị trí khác lông heo 20 3.4.3 Định lƣợng DNA quang phổ kế 21 viii 3.4.4 Thực phản ứng PCR 21 3.4.5 Điện di quan sát kết 22 3.4.5.1 Chuẩn bị gel agarose .22 3.4.5.2 Đọc kết 22 3.5 Xử lý số liệu 22 PHẦN IV KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 23 4.1 Thí nghiệm 1: Khảo sát nồng độ proteinase K .23 4.2 Thí nghiệm 2: Khảo sát nồng độ DTT 26 4.3 Thí nghiệm 3: Khảo sát nồng độ CTAB 27 4.4 Thí nghiệm 4: Áp dụng quy trình ly trích DNA lên vị trí lơng heo 29 PHẦN V KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 30 5.1 Kết luận 30 5.2 Đề nghị 30 VI TÀI LIỆU THAM KHẢO .31 ix DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT bp base pair cs cộng DNA deoxyribonucleic acid OD optical density DTT Dithiothreitol CTAB Cetyltrimetylamonium bromide PCR polymerase chain reaction PSE Pale, soft, exudative Taq Thermus aquaticus Tỷ số OD tỷ số OD260 nm /OD280 nm UI unit international UV ultra violet W wave KAP keratin associated proteins HP halothane positive HN halothane negative x ... hành đề tài “ Xác định quy trình ly trích DNA từ lơng heo” 1.2 Mục tiêu yêu cầu 1.2.1 Mục tiêu - Xác định quy trình tách chiết DNA từ lơng heo - Tìm vị trí tốt sợi lơng heo để ly trích DNA 1.2.2... hoá chất để cải tiến quy trình ly trích DNA từ lơng heo - Kiểm tra hiệu quy trình ly trích thơng qua đo OD phản ứng PCR - Áp dụng quy trình ly trích DNA lên vị trí khác sợi lông heo 3 PHẦN II... thú sống Việc ly trích DNA từ lơng mở rộng cho ly trích DNA từ cấu trúc tƣơng tự lơng nhƣ móng, mỏ, da, xƣơng… Với mục đích tìm quy trình tối ƣu cho ly trích DNA từ nhiều nguồn lơng, từ nhiều vị