Phát hiện đột biến nhờ Xác định trình tự của DNA (DNA sequencing) docx

Phát hiện đột biến nhờ Xác định trình tự của DNA (DNA sequencing) Trong nhiều nghiên cứu di truyền, một mục tiêu chính là xác định cho được trình tự của các base trên toàn bộ hoặc một phần của gene. Việc xác định trình tự của ADN cho phép tìm hiểu bản chất của đột biến gene, chức năng của gene, mức độ tương tự của gene với các gene khác đã biết. Kỹ thuật xác định trình tự nucleotide của ADN bằng cách sử dụng phương pháp dideoxy Một kỹ thuật được sử dụng rộng rãi để xác định trình tự của ADN là phương pháp dideoxy (dideoxy method) do Frederick Sanger đưa ra. Phương pháp này được thực hiện bằng cách sử dụng các dide- oxynucleotide chấm dứt chuỗi (chain-terminating dideoxynucleotide). Đây là các nucleotide có cấu trúc tương tự như các deoxyribonucleotide bình thường khác chỉ khác ở chỗ chúng thiếu mất một nhóm hydroxyl trong cấu trúc. Sự khác biệt này trong cấu trúc làm cho phân tử này không thể tạo thêm liên kết phosphodiester với các nucleotide tự do. Như vậy mặc dù các dideoxynucleotide có thể gắn vào một chuỗi ADN đang được tổng hợp nhưng sau nó không có thêm nucleotide nào gắn vào thêm được nữa và chấm dứt quá trình nhân đôi ngay tại vị trí đó. Người ta sử dụng 4 loại dideoxynucleotide khác nhau, mỗi loại sẽ bổ sung với các deoxyribonucleotide A, T, G, hoặc C. Trình tự của một chuỗi đơn ADN nào cần đọc trình tự sẽ đựơc trộn với các primer được đánh dấu bằng các chất hoạt tính phóng xạ, ADN polymerase, các nucleotide thông thường và một loại dideoxynucleotide. Primer sẽ lai với một vị trí tương ứng trên chuỗi đơn ADN theo nguyên tắc bổ sung và ADN polymerase sẽ giúp bổ sung tiếp các nucleotide như trong kỹ thuật PCR. Dideoxynucleotide sẽ gắn vào chuỗi ADN đang được tổng hợp khi có nucleotide tương ứng theo nguyên tắc bổ sung. Tuy nhiên khi điều này xảy ra thì quá trình tổng hợp chuỗi ADN cũng bị ngừng lại. Ở bất kỳ một vị trí nhất định nào, hoặc sẽ có một nucleotide bình thường hoặc một dideoxynucleotide có thể được thêm vào một cách ngẫu nhiên. Quá trình này cho phép tạo nên các đoạn ADN với chiều dài khác nhau, mỗi đoạn đều kết thúc bời cùng một loại dideoxynucleotide. Những đoạn ADN có thể phân lập theo chiều dài bằng điện di như trình bày ở phần trên. Bốn loại phản ứng khác nhau được thực hiện cho 4 loại nucleotide, các đoạn thu được từ mỗi loại phản ứng sẽ được chạy điện di bên cạnh nhau trên cùng một gel để vị trí của các đoạn có thể so sánh được với nhau. Vì mỗi band ứng với một chuỗi ADN tận cùng bởi 1 loại base duy nhất nên trình tự của ADN có thể được đọc bằng cách quan sát thự tự của các band trên gel sau khi sử dụng kỹ thuật phóng xạ tự chụp (các primer có hoạt tính phóng xạ sẽ chỉ vị trí của các đoạn ADN trên phim). Trong mỗi quá trình phản ứng như vậy có thể đọc được trình tự của vài trăm cặp base. Tuy nhiên cách đọc trình tự của ADN theo cách này tương đối chậm, khó khăn và dễ sai sót. Gần đây kỹ thuật đọc trình tự ADN tự động (automated ADN sequenced) sử dụng hệ thống phát hiện màu huỳnh quang (fluorescent), hóa chất phát sáng (chemiluminescent) hoặc hệ thống đo màu (colorimetric) đang được phát triển. Việc sử dụng các primer hoặc dideoxynucleotide được gắn huỳnh quang giúp cho phương pháp này trở nên phổ biến. Một mạch khuôn ADN được đọc trình tự bằng cách sử dụng phương pháp tương tự bước kéo dài primer trong kỹ thuật PCR. Mỗi một trong 4 dideoxynucleotide khác nhau được gắn với một loại màu huỳnh quang cho phép phát ra một phổ ánh sáng riêng. Các đoạn ADN đã được gắn huỳnh quang sau phản ứng tổng hợp sẽ được điện di trên gel polyacrylamide rất mỏng rồi sau đó được kích thích bằng một chùm tia laser . Ánh sáng phát ra được ghi nhận qua một camera kỹ thuật số (digital camera) để chuyển thành các tín hiệu điện tử và chuyển thành ảnh. Ảnh này được phân tích để chuyển thành dạng đồ thị trong đó mỗi một loại nucleotide khác nhau được mô tả bằng một đỉnh màu khác nhau, trình tự của các đỉnh màu này trên đồ thị cho phép đọc trình tự của đoạn ADN. Một đoạn khoảng 500 bp của 64 người khác nhau có thể được phân tích trên cùng một gel trong vòng từ 2 đến 4 giờ. Phương pháp đọc trình tự tự động cũng được thực hiện cho việc đánh giá tính chất đa hình của các đoạn lặp ngắn (STRP), tính đa hình của đơn nucleotide (single-nucleotide polymorphism: SNP) và các dạng đa hình khác. Một hướng đọc trình tự tự động khác là các mẫu ADN được điện di trong các ống thuỷ tinh rất nhỏ được gọi là các ống mao dẫn (capillary) chứ không phải trên gel polyacrylamide. Vì những ống này rất mỏng và lượng nhiệt tỏa ra trong quá trình điện di rất ít nên việc đọc trình tự diễn ra rất nhanh, kỹ thuật này cho phép đọc trình tự của 600 bp của 96 mẫu chỉ trong vòng 15 phút. Ngoài ra một kỹ thuật mới là sử dụng sắc ký khối phổ (mass spectroscopy), đây là một kỹ thuât có độ phân giải cao trước đây dùng để phân tích protein. Sự phát triển của kỹ thuật MALDI-TOF (matrixassisted laser desorption/ionization time-of-flight) cho phép phân tích hàng trăm mẫu ADN trong vài phút. Hiện nay đây là kỹ thuật thu hút nhiều sự quan tâm trong việc sử dụng để đọc trình tự ADN. Bằng cách sử dụng vi tính và các kỹ thuật tự động đã làm tăng khả năng đọc trình tự của ADN và đã cho phép đọc được trình tự của toàn bộ 3 tỷ bp trong genome của người. . Phát hiện đột biến nhờ Xác định trình tự của DNA (DNA sequencing) Trong nhiều nghiên cứu di truyền, một mục tiêu chính là xác định cho được trình. trình tự của các base trên toàn bộ hoặc một phần của gene. Việc xác định trình tự của ADN cho phép tìm hiểu bản chất của đột biến gene, chức năng của gene,