Các mẫu đƣợc ly trích từ gốc lông, tỷ số OD và hàm lƣợng DNA đƣợc trình bày trong Bảng 4.3.
N N N N G G G G G ĐC
655 bp 370 bp
21
Bảng 4.3. Tỷ số OD và hàm lƣợng DNA thu hồi từ 2 nguồn lông
Chỉ tiêu Lông bò Lông heo P
Tỷ số OD 1,82 0,08 1,69 0,11 0,07
Hàm lƣợng DNA (µg/ µl) 0,31 0,3 0,09 0,05 0,14
Số mẫu 5 5
Biểu đồ 4.3: Tỷ số OD của DNA ly trích từ mẫu gốc lông heo và lông bò
Tỷ số OD giữa DNA gốc lông của heo và bò không có sự khác biệt nhiều (P > 0,05). Sản phẩm PCR của DNA ly trích từ lông heo không cho băng nào. Có thể trong DNA ly trích từ lông heo vẫn còn tạp chất hoặc vì lý do khác, cần làm thêm vài thí nghiệm để giải thích rõ.
Hình 4.3: Kết quả PCR với DNA từ gốc lông heo và gốc lông bò H: heo, B: bò H H H H H B B B B B 370 bp 1.82 1.69 0.31 0.09 0 0.5 1 1.5 2
Lông bò Lông heo
Tỷ số OD Hàm lượng DNA (µg/µl)
22
Bảng 4.4. Tỷ số OD và hàm lƣợng DNA thu hồi từ việc sử dụng DTT
Chỉ tiêu Không DTT DTT P
Tỷ số OD 1,58 0,14 1,84 0,09 0,008
Hàm lƣợng DNA (µg/µl) 0,3 0,18 0,21 0,13 0,44
Số mẫu 5 5
Biểu đồ 4.4: So sánh DNA ly trích từ dung dịch đệm có DTT và không có DTT
Có sự khác biệt về tỷ số OD giữa việc sử dụng DTT và không sử dụng DTT (P < 0,05). Tỷ số OD của dung dịch đệm ly trích theo DTT đạt khoảng tinh sạch (1,8 – 2). Gen giới tính (2 mẫu) từ lông bò và gen halothane từ lông heo có bổ sung DTT không có dấu hiệu phản ứng. Kalbe và ctv (1988) chứng tỏ rằng sự hiện diện của DTT trong dung dịch đệm ly trích làm giảm rõ rệt lƣợng DNA ly trích, và điều này có thể làm giảm việc gắn kết giữa các deoxyribose nucleotides trong DNA và làm chúng không thể đƣợc nhận biết bởi Taq polymerase (McNevin và ctv, 2005). Đó có thể là một giả định để giải thích tại sao sản phẩm PCR không đƣợc thấy. Kết quả PCR xác định gen halothane âm tính trên 1 mẫu.
.
Hình 4.4: Kết quả PCR từ mẫu có DTT và không DTT
370 bp 1 1 2 2 1.58 1.84 0.3 0.21 0 0.5 1 1.5 2 Không DTT DTT Tỷ số OD Hàm lượng DNA (µg/µl) 1: DTT 2:Không DTT
23
4.5. Thí nghiệm 5: Khảo sát tác dụng của CTAB trong việc loại bỏ melanin Bảng 4.5. Tỷ số OD và hàm lƣợng DNA thu hồi từ 3 mẫu CTAB Bảng 4.5. Tỷ số OD và hàm lƣợng DNA thu hồi từ 3 mẫu CTAB
Chỉ tiêu CTAB P
0,0% 0,06% 0,2%
Tỷ số OD 1,84 0,09 1,6 0,04 1,3 0,03 0,001
Hàm lƣợng DNA (µg/µl) 0,17 0,04 0,16 0,06 0,1 0,02 0,46
Số mẫu 5 5 5
Biểu đồ 4.5: Tỷ số OD của DNA ly trích bởi dung dịch đệm có và không có CTAB
Có sự sai biệt giữa tỷ số OD và hàm lƣợng DNA từ quy trình ly trích DTT không sử dụng CTAB và quy trình có CTAB. Sử dụng CTAB ở nồng độ càng cao thì độ tinh sạch của DNA càng giảm. Theo Sambrook và ctv (2001), CTAB đƣợc loại ra khỏi dung dịch kết tủa DNA bằng hỗn hợp phenol. Tuy nhiên có lẽ hỗn hợp phenol chƣa thể loại hết đƣợc CTAB ra khỏi dung dịch kết tủa DNA, do đó cần phải tìm thêm chất nào đó để có khả năng loại bỏ CTAB hiệu quả hơn. DNA từ dung dịch đệm có bổ
xung CTAB 0,06% chạy PCR đối với gen giới tính và halothane đều không có dấu hiệu phản ứng.
4.6. Thí nghiệm 6: Sử dụng BSA trong phản ứng PCR
Bảng 4.6. Kết quả PCR tƣơng ứng với nồng độ BSA đƣợc bổ sung Nồng độ BSA (µg/µl) Số mẫu tiến hành Kết quả PCR *
0 4 Băng 370 bp 0,0005 1 Băng 370 bp 0,01 1 Băng 370 bp 1.84 1.6 1.3 0.17 0.16 0.1 0 0.5 1 1.5 2
CTAB 0,0% CTAB 0,06% CTAB 0,2%
Tỷ số OD Hàm lượng DNA (µg/µl)
24 * Chỉ phát hiện băng ngắn của gen giới tính, không có sản phẩm PCR của gen halothane.
Sản phẩm PCR từ DNA ly trích từ lông bò chỉ cho 1 băng dài 370 bp. Số mẫu có sản phẩm PCR là các mẫu có BSA ở các nồng độ 0,0005 µg/µl; 0,01 µg/µl; còn những mẫu dùng BSA ở các nồng độ 0,1 µg/µl; 0,5 µg/µl không cho sản phẩm PCR. Một mẫu DNA ly trích từ lông heo có bổ sung BSA ở 0,1 µg/µl; 0,5 µg/µl cho sản phẩm âm tính.
Nồng độ BSA càng nhỏ thì băng điện di càng sáng. Điều đó có thể cho thấy rằng lƣợng BSA thêm nhiều trong phản ứng PCR sẽ trở thành chất ức chế phản ứng.
Hình 4.6: Kết quả PCR từ mẫu sử dụng BSA và không sử dụng BSA
Qua 6 thí nghiệm, PCR xác định gen giới tính chỉ có 1 băng 370 bp; PCR xác định gen halothane không cho băng nào. Trong thí nghiệm về đánh giá sự ly trích từ lông rụng tự nhiên, Vigilant (1999) thấy rằng DNA ty thể có thể khuếch đại những đoạn lên tới 300 bp với tỷ lệ thành công là 80%, giảm xuống 60% đối với những đoạn 400 bp và 15% cho những đoạn 500 bp (McNevin và ctv, 2005). Cũng theo McNevin và ctv (2005), ngƣời ta nghĩ rằng DNA ty thể dễ dàng ly trích từ lông hơn vì nó hiện diện với số lƣợng lớn. Allen và ctv (1998) tìm thấy rằng sự khác nhau trong số lƣợng DNA đòi hỏi cho sự khuếch đại PCR thành công là sự phù hợp với số lƣợng copy của mỗi tế bào, DNA nhân (1 copy 1 tế bào) và DNA ty thể (103
– 104 mỗi tế bào). Do đó, chúng tôi nghĩ rằng quy trình ly trích lông chƣa đƣợc tối ƣu hoá nên không thể kéo dài băng 655 bp đối với gen giới tính và 586 bp đối với gen halothane.
1 2 3 4 ĐC ĐC 5 6 655 bp 370 bp 1,2: Không BSA 3: 0,0005 ng/µl BSA 4: 0,01 ng/µl BSA 5: 0,1 µg/µl BSA 6: 0,5 µg/µl BSA
25
PHẦN V. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
5.1. Kết luận
- Dung dịch đệm ly trích chứa proteinase K và Ca2+ ở các nồng độ 2 mM, 6 mM, 10 mM cho DNA với tỷ số OD khoảng 1,6 – 1,69. Trong đó, sản phẩm PCR từ DNA của gốc lông bò ly trích bởi dung dịch đệm 10 mM Ca2+ cho 1 băng dài 370 bp.
- DNA từ gốc lông bò (tỷ số OD trung bình 1,76) có độ tinh sạch và hàm lƣợng cao hơn DNA từ ngọn lông ( OD = 1,2).
- Mẫu gốc lông heo và gốc lông bò không khác nhau về tỷ số OD và hàm lƣợng DNA ly trích.
- DNA ly trích từ dung dịch đệm có DTT (tỷ số OD trung bình 1,84) tinh sạch hơn DNA từ dung dịch đệm không có DTT (1,58).
- Nồng độ CTAB trong quá trình ly trích ảnh hƣởng đến độ tinh sạch của DNA. - Sử dụng nồng độ BSA từ 0,0005 µg/µl đến 0,5 µg/µl trong phản ứng PCR vẫn không cải thiện đƣợc hiệu quả PCR khi dùng DNA từ mẫu lông.
- Quy trình ly trích với dung dịch đệm chứa proteinase K và Ca2+ hiệu quả trong ly trích DNA với những đoạn khuếch đại dƣới 400 bp.
Tóm lại, Ca2+ trong dung dịch đệm ly trích đã cải thiện tỷ số OD nhƣng chỉ cho sản phẩm PCR ngắn (370 bp) của gen giới tính và không có sản phẩm PCR của gen halothane.
5.2. Đề nghị
- Làm thêm thí nghiệm với nồng độ Ca2+ từ 10 – 40 mM để xác định nồng độ nào cho hiệu quả tối ƣu nhất.
26
PHẦN VI. TÀI LIỆU THAM KHẢO
*Tài liệu Tiếng Việt
1. Lê Thị Thu Phƣơng, 2004. Phát hiện gen halothane, gen thụ thể estrogen và mối liên quan giữa hai gen này đến năng suất sinh sản của heo nái. Luận văn thạc sỹ khoa học nông nghiệp, Trƣờng Đại Học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh, Việt Nam.
2. Nguyễn Văn Út, 2005. Xác định giới tính bằng kỹ thuật Multiplex PCR trên 3 giống bò. Luận văn tốt nghiệp, Trƣờng Đại học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh, Việt Nam.
*Tài liệu Tiếng Anh
3. Biorad, 2005. 2 - D electrophoresis for proteomics: A method and product manual.
4. Dale J. W., Schantz M. V., 2002. From genes to genomes: Concepts and applications of DNA technology. From genes to genomes. Copy right John Wiley Sons, Ltd.
5. Eggling S., 2001 - 2003. Structual protein. Clackamas Community College, Hal Bender. http://dl.clackamas.cc.or.us/ch106 - 08/structural proteins.htm.
6. Galan M., Baltzinger C., Hewison A. J. M., Cosson J., 2003. Deer species identification using DNA extracted from hair samples and the polymerase
chain reaction (PCR) method. Trends in Ecology and Evolution. 12: 223 – 227.
7. Haase A., Retzel E. F., Stakus K. A., 1990. Amplification arid detection of lentiviral DNA inside cells. Proc Natl Acad SC! USA . 87,4971 – 4975.
8. Hair handout, 2005. CHEM 107. http:// www.fbi.gov
9. James N. J., Mary V. A., 2004. Genetic variability and population differentiation in Captive Baird’s Tapirs (Tapirus bairdii). Zoo Biology. 23:521– 531.
27 10. McNevin D., Wilson - Wilde L., Robertson J., Kyd J., Lennard C., 2005. Short tandem repeat (STD) genotyping of keratinised hair. Forensic Science International.153 : 237 – 259.
11. Morel G., Berger M., Ronsin B., Recher S., Richard- Blum S., Mertani H.C. , Lobie P. E., 1998. In situ reverse transcription - polymerase chain reaction. Applications for light and electron microscopy. Biology of the Cell. 90: 137 - 154.
12. Nozawa H.D., Yanamoto T., Uchihi R., Yoshimoto T., Tamoaki K., Hayash S., Ozawa T., KatsumataY., 1999. Purification of nuclear DNA from single hair shafts for DNA analysis in forensic sciences. Legal Med. 1: 61 – 67.
13. Rees J. L., 2003. Genetics of hair and skin colour. Annu. Rev. Genet. 37: 67 – 90.
14. Sake R. K., Scharf S., Faloona F., Mullis K. B., Horn Mullis K.B., Horn G., Erlich H.A., Amheim N., 1985. Enzymatic amplification of globin genomic sequences and restriction site.analysis for diagnosis of sickle cell anemia.
Science. 230,1350 – 1355.
15. Sauer S., Lechner D., Berlin K., Plancon C., Heuermann A., Lehrach H., and Gut G. I., 2000. Ful flexibility genotyping of single nucleotide polymorphisms by the good assay. Nucleic Acids Research. 28: 23.
16. Schnabel R. D., Ward T. J., Derr J. N., 2000. Validation of 15 microsatellites for parentage testing in North American bison, Bison bison and domestic cattle.
Animal Genetics. 31: 360 – 366.
17. Vigilant L., 1999. An evaluation of techniques for the extraction and amplification of DNA from naturally shed hairs. Bio. Chem. 390 : 1329 – 1321.
18. Wagner M, Bailey D.G.,1993. Structure of bovine and hair root-A scanning electron microscope investigation. Superior systems service. 13: 61 – 78.
28
PHỤ LỤC
* Hoá chất dùng trong đề tài - Hoá chất ly trích DNA KCl 500 mM NaCl 20 mM Tris HCl pH 8 50 mM, 100 mM SDS 1% + Proteinase K 0,5 mg/ml
+ Phenol: chloroform: isoamy alcohol 25:24:1
+ TE buffer 1X Tris HCl 100 mM EDTA( pH 8) 1 mM + Ethanol 70%; 95% + Tris base (pH 8) 2 M + Sodium acetate 0,2 M; 2 M + DTT 70 mM + CTAB 0,06%, 0,2% - Hoá chất phản ứng PCR PCR buffer 1 X MgCl2 2 mM Mỗi dNTP 200 µM Mồi xuôi 0,5 µM Mồi ngƣợc 0,5 µM
Taq DNA polymerase 1 UI
- Hoá chất chạy điện di sản phẩm PCR
+ Agarose 1,5%
+ TBE (Tris Borate EDTA) (pH = 8,3) 1 X
Tris base 89 mM
Acid boric 89 mM
29 + Loading dye Bromophenol blue 0,3% Sucrose 40% TE 1X vừa đủ 100% + Ethidium bromide 10 mg/ml * Dụng cụ dùng trong đề tài - Pipetman loại 100 – 1000 µl; 10 – 100 µl; 0,5 – 10 µl - Đầu tip tƣơng ứng với các loại pipet man
- Eppendorf loại 0,2 ml và 1,5 ml - Các chai lọ đựng hoá chất, vật mẫu - Dụng cụ kéo, kẹp, chày, cối
* Thiết bị dùng trong đề tài - Máy Vortex - Máy ly tâm - Máy PCR - Bộ điện di - Máy chụp gel - Tủ ấm - Tủ trữ mẫu - Tủ trữ hoá chất - Microwave - Cân - Tủ sấy - Máy cất H2O, khử ion - Autoclave - Máy đo OD - Bình N2 lỏng
