(Nguồn: Lê Thị Thu Phƣơng, 2004)
3.4.5. Điện di và quan sát kết quả 3.4.5.1. Chuẩn bị gel agarose 3.4.5.1. Chuẩn bị gel agarose
Nồng độ agarose dùng cho điện di sản phẩm PCR xác định giới tính là 1,5%; 2% đối với sản phẩm PCR xác định gen halothane. Ví dụ để chuẩn bị 1,5% ta làm nhƣ sau: cân 0,225 g agarose hoà tan trong 15 ml TBE 0,5 X lắc đều. Đun agarose trong lò viba ở 650 w trong 2 phút. Để gel nguội đến khoảng 50oC, đổ vào khuôn có gắn lƣợc. Chờ gel đông và rút lƣợc ra.
3.4.5.2. Kết quả điện di PCR
Dùng 7,5 µl sản phẩm PCR trộn với 1,5 µl loading dye 6 X. Điện di 30 phút trong TBE 0,5 X với dòng điện 100 V, 250 mA. Vớt gel ra khỏi buồng diện di và cho vào thùng nhuộm ethidium bromide 0,1% trong 30 phút. Đặt gel lên bàn chụp UV, quan sát kết quả.
3.5. Xử lý số liệu
Xử lý số liệu với các hàm thống kê trong Excel và phần mềm Statgraphics 7.0.
Tên giai đoạn Nhiệt độ (oC) Thời gian
Biến tính hoàn toàn 94 3 phút
35 chu kỳ Biến tính Bắt cặp Kéo dài 94 54 72 45 giây 90 giây 90 giây
Kéo dài cuối cùng 72 5 phút
18
PHẦN IV. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1. Thí nghiệm 1: Khảo sát nồng độ Ca2+ trong dung dịch đệm ly trích DNA DNA lông bò đƣợc ly trích từ các nồng độ Ca2+, kết quả đo OD và hàm lƣợng DNA lông bò đƣợc ly trích từ các nồng độ Ca2+, kết quả đo OD và hàm lƣợng DNA đƣợc trình bày ở Bảng 4.1.
Bảng 4.1. Tỷ số OD và hàm lƣợng DNA tƣơng ứng với các nồng độ Ca2+
Chỉ tiêu Nồng độ Ca 2+ P 2 mM 6 mM 10 mM Tỷ số OD (X± SD) 1,6 0,08 1,62 0,12 1,69 0,15 0,49 Hàm lƣợng DNA (X± SD) (µg/µl) 0,51 0,22 0,24 0,13 0,3 0,3 0,19 Số mẫu 5 5 5 1.6 1.62 1.69 0.51 0.24 0.3 0 0.5 1 1.5 2 2 mM 6 mM 10 mM Tỷ số OD Hàm lượng DNA (µg/µl)
Biểu đồ 4.1: Tỷ số OD và hàm lƣợng DNA ly trích tƣơng ứng với các nồng độ Ca2+
Sự khác biệt về tỷ số OD và nồng độ DNA không nhiều (P > 0,05). Trong thí nghiệm của McNevin và ctv (2005), ông ta đã đề nghị một dung dịch đệm ly trích có sử dụng Proteinase K và bổ sung 40 mM Ca2+. Do đó, có thể bố trí thêm nhiều thí nghiệm ở các nồng độ Ca2+
từ 10 mM đến 40 mM để xác định nồng độ Ca2+ nào cho hiệu quả tối ƣu nhất. Trong các kết quả ly trích trên, dung dịch đệm ly trích chứa 10 mM Ca2+ có tỷ số OD cao nhất nên lấy DNA để chạy PCR. Phản ứng PCR từ lông bò chỉ khuếch đại đƣợc 1 băng dài 370 bp nên không đạt yêu cầu. Kết quả PCR xác định gen halothane cũng âm tính trên 2 mẫu.
La Ca Ca Ca Ca ĐC
655 bp 370 bp
19
Hình 4.1: Kết quả PCR từ mẫu có 10 mM Ca2+
La: ladder, Ca: 10mM Ca2+, ĐC: đối chứng là sản phẩm PCR với DNA ly trích từ cơ vân
4.2. Thí nghiệm 2: So sánh DNA ly trích từ gốc và ngọn lông bò
DNA đƣợc ly trích từ mẫu gốc lông dài khoảng 5 cm tính từ gốc và mẫu ngọn
lông dài khoảng 5 cm ở phần đuôi của thân lông. Kết quả đo OD và hàm lƣợng DNA đƣợc trình bày trong bảng 4.2a.