Tạo dòng và biểu hiện enzyme trehalose synthase chịu nhiệt từ vi khuẩn meiothermus ruber phân lập từ suối nước nóng ở việt nam

ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN THÁI THIÊN MINH TẠO DÒNG VÀ BIỂU HIỆN ENZYME TREHALOSE SYNTHASE CHỊU NHIỆT TỪ VI KHUẨN MEIOTHERMUS RUBER PHÂN LẬP TỪ SUỐI NƯỚC NÓNG Ở VIỆT NAM Chuyên ngành: Vi sinh Mã số: 60 42 40 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS.ĐỖ MINH SĨ THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH – 2011 Lời cảm ơn Em xin gửi lời tri ân sâu sắc nhất đến cô, cố PGS.TS Trần Thu Hoa, đã luôn giúp đỡ, tạo điều kiện, tận tình hướng dẫn, truyền đạt những kiến thức quí báu trong quá trình nghiên cứu tại trường cho dù cô không có được sức khỏe tốt. Em xin chân thành cảm ơn đến TS .Đỗ Minh Sĩ đã hướng dẫn và giúp đỡ em hoàn thành luận văn này. Em xin gửi lời cảm ơn đến các thầy cô Khoa Sinh đã tậ n tình chỉ dạy trong suốt thời gian học tập ở trường. Xin gửi lời cảm ơn đến em Đỗ Xuân Hòa, đã giúp đỡ, hổ trợ rất nhiều trong quá trình thực hiện luận văn. Xin gửi lời cảm ơn đến các em Tố Nhi, Hà Giang, Quang Hữu, Bảo Quyên, Huyền Thanh và các em ở phòng thí nghiệm Vi sinh công nghệ dược, trường Đại học Y dược tp Hồ Chí Minh đã luôn quan tâm, động viên và giúp đỡ tôi trong suốt thờ i gian thực hiện luận văn. Con xin cảm ơn Mẹ, gia đình và bạn bè đã luôn ở bên cạnh và ủng hộ trong suốt thời gian qua. 1 MỞ ĐẦU 2 Các vi sinh vật chịu nhiệt được xếp trong nhóm vi sinh vật cực đoan phân bố nhiều ở các vùng suối nước nóng, các vùng địa nhiệt, miệng núi lửa Nhiệt độ cực thuận nhất cho sự hoạt động của các vi sinh vật chịu nhiệt này là từ 50 – 80°C. Một số vi sinh vật có thể hoạt động ở nhiệt độ 110°C hoặc cao hơn. Những enzyme của những chủng vi khuẩn này được gọi là nh ững enzyme chịu nhiệt. Các enzyme chịu nhiệt này có những đặc tính về cấu trúc, chức năng khác thường cho sự chịu nhiệt độ cao và hoạt động cực thuận của chúng. Vì vậy, việc phân lập các chủng vi khuẩn chịu nhiệt này đồng thời tìm hiểu các enzyme chịu nhiệt của chúng sẽ mở ra một hướng mới trong việc ứng dụng các enzyme này trong cách lĩnh vực sinh hóa, thực phẩm và đặc biệt là trong lĩ nh vực công nghệ sinh học phân tử. Trehalose là một trong những loại đường có nhiều công dụng đối với cuộc sống con người, đặc biệt đối với những người béo phì, những người mắc bệnh tiểu đường… Trehalose hiện nay đang được sử dụng như một loại đường thay thế trong công nghiệp sản xuất bánh kẹo, sữa…Trong khi đó việc tổng hợp trực tiếp trehalose r ất phức tạp. Do vậy việc tìm kiếm một phương pháp tổng hợp trehalose là hết sức cần thiết. Trehalose synthase là enzyme tổng hợp trehalose từ maltose. Trehalose synthase được tìm thấy trong nhiều loại vi khuẩn, trong đó có vi khuẩn Meiothermus ruber. Đây là một chủng vi khuẩn chịu nhiệt trung bình. Ở Việt Nam, chúng được tìm thấy ở hầu hết trong các suối nước nóng có nhiệt độ trung bình từ 45-75 o C. Phân lập chủng vi khuẩn này đồng thời tạo dòng đoạn gen mã hóa enzyme Trehalose synthase chịu nhiệt của chúng không chỉ có ý nghĩa khoa học mà còn có ý nghĩa kinh tế xã hội. Vì thế chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Tạo dòng và biểu hiện enzyme trehalose synthase chịu nhiệt từ vi khuẩn Meiothermus ruber phân lập từ vùng suối nước nóng ở Việt Nam” 3 NỘI DUNG CỦA ĐỀ TÀI  Phân lập các chủng vi khuẩn chịu nhiệt Meiothermus ruber từ suối nước nóng ở Bình Châu ( Bà Rịa - Vũng Tàu).  Định danh chủng vi khuẩn này dựa vào trình tự gen 16S rRNA.  Ly trích DNA bộ gen của chủng vi khuẩn Meiothermus ruber.  Phân lập đoạn gen mã hóa cho enzyme Trehalose synthase.  Tái tổ hợp đoạn gen này vào chủng E.coli và biểu hiện chủng E.coli tái tổ hợp. vii DANH MỤC CÁC BẢNG Trang Bảng 1.1. Hàm lượng Trehalose và lượng thực phẩm tiêu thụ mỗi ngày 10 Bảng 2.1. Thành phần gel tách polyacrylamide 12% 36 Bảng 2.2. Thành phần gel gom polyacrylamide 4.5% 37 Bảng 3.1. Bảng tổng hợp các trình tự blast trên NCBI 49 vi DANH MỤC CÁC HÌNH Trang Hình 1.1. Công thức cấu tạo của Trehalose 7 Hình 1.2. Độ ngọt của đường trehalose so với maltose, glucose, sucrose 9 Hình 1.3. Độ hòa tan trong nước của trehalose so với sucrose 9 Hình 1.4. Sự phân bố các con đường sinh tổng hợp Trehalose trong tự nhiên 15 Hình 1.5. Các con đường tổng hợp Trehalose 16 Hình 1.6. Cơ chế sản xuất Trehalose từ tinh bột 19 Hình 2.1. Kích thước của thang MassRuler ladder Mix 28 Hình 2.2. Kích thước thang Multicolor Broad Range Protein Ladder 29 Hình 2.3. Vector Pjet1.2 blunt 33 Hình 2.4. Vector pET-22b 34 Hình 3.1. Khuẩn lạc (A) và hình dáng tế bào (B) vi khuẩn Meiothermus ruber 41 Hình 3.2. Điện di trên gel agarose sản phẩm PCR 42 Hình 3.3. Điện di trên gel agarose sản phẩm PCR colony các mẫu plasmid pJet-TreS ( 44 Hình 3.4. Vị trí cắt của Vsp 1 trên vector pJet1.2/blunt 42 Hình 3.5. Điện di trên gel agarose sản phẩm PCR các mẫu plasmid pET-TreS 46 Hình 3.6. Điện di trên gel agarose sản phẩm cắt plasmid pET-TreS 47 Hình 3.7. Vị trí các mồi giải trình tự 47 Hình 3.8. Điện di SDS-PAGE các dòng mang plasmid tái tổ hợp 50 Hình 3.9. Kết quả phân tích Western blot 51 Hình 3.10. Kết quả điện di SDS-PAGE plasmid pET-TreS với 2 chất cảm ứng 52 Hình 3.11. Kết quả điên di SDS-PAGE mẫu plasmid tái tổ hợp với các nồng độ IPTG khác nhau 53 Hình 3.12. Điện di SDS-PAGE thời giam cảm ứng 54 Hình 3.13. Điện di SDS-PAGE vận tốc lắc cảm ứng 55 Hình 3.14. Điện di SDS-PAGE nhiệt độ cảm ứng 56 Hình 3.15. Điện di SDS-PAGE điều kiện cảm ứng tối ưu 57 v DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT BLAST Basic Local Alignment Search Tool bp base pair (cặp base) cDNA Complementary deoxyribonucleotide acid DNA Deoxyribonucleotide acid dNTP Deoxyribonucleotide triphosphate LB Luria-Bertani MCS Multiple coding sequence (vùng tạo dòng) OD Optical density (mật độ quang) SDS-PAGE Sodium dodecyl sulfate - Polyacrylamid gel electrophoresis (điện di trên gel polyacrylamide) PCR Polymerase Chain Reaction (phản ứng chuỗi polymerase) RE Restriction Enzym (enzym cắt giới hạn) rpm Rotation per minute (vòng/ phút) TreS Trehalose synthase i MỤC LỤC Trang Trang phụ bìa MỤC LỤC i DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT v DANH MỤC CÁC HÌNH vi DANH MỤC CÁC BẢNG vii MỞ ĐẦU 1 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 4 1.1. ĐẶC ĐIỂM CỦA VI KHUẨN CHỊU NHIỆT 5 1.1.1. Sự phân bố của vi khuẩn chịu nhiệt 5 1.1.2. Phát sinh loài 5 1.1.3. Vi khuẩn Meiothermus ruber 6 1.2. TREHALOSE 6 1.2.1. Cấu trúc của Trehalose 6 1.2.2. Bản chất sinh học của trehalose 7 1.2.3. Đặc tính hóa học của trehalose 9 1.2.4. Ảnh hưởng của Trehalose lên cơ thể vi sinh vật 10 1.2.4.1. Là một nguồn dự trữ năng lượng và carbon 10 1.2.4.2. Là một chất ổn định và bảo vệ của các protein và màng 11 1.2.5. Ảnh hưởng của Trehalose lên cơ thể con người 12 1.2.5.1. Ảnh hưởng của Trehalose đến sự chuyển hóa hydratcacbon 12 1.2.5.2. Vai trò thúc đẩy quá trình hấp thụ canxi của Trehalose 13 1.2.5.3. Ảnh hưởng của Trehalose đến hệ vi sinh vật trong khoang miệng . 13 1.2.6. Con đường tổng hợp trehalose 14 1.2.7. Ứng dụng của trehalose 17 1.2.8. Sản xuất trehalose 18 1.2.9. Tình hình nghiên cứu enzyme trehalose synthase trên thế giới 19 ii 1.3. KỸ THUẬT TẠO DÒNG 21 1.3.1. Chọn và xử lý vector 21 1.3.2. Xử lý DNA cần tạo dòng 21 1.3.3. Tạo vector tái tổ hợp 21 1.3.4. Chuyển vector tái tổ hợp vào tế bào chủ 22 1.3.4.1. Hóa biến nạp 22 1.3.4.2. Điện biến nạp 22 1.3.5. Chọn lọc dòng tái tổ hợp: 22 Chương 2: VẬT LIỆU - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 24 2.1. VẬT LIỆU 25 2.1.1. Đối tượng nghiên cứu 25 2.1.2. Thiết bị, dụng cụ 25 2.1.3. Môi trường làm thuần và cấy chuyền vi khuẩn ưa nhiệt 25 2.1.4. Hóa chất dùng cho tách chiết DNA 26 2.1.5. Hóa chất dùng cho phản ứng PCR: 27 2.1.6. Mồi dùng cho giải trình tự 27 2.1.7. Hóa chất dùng cho các phản ứng cắt, nối DNA 27 2.1.8. Hóa chất dùng cho điện di trên gel agarose 27 2.1.9. Môi trường, hóa chất dùng cho biến nạp và biểu hiện 28 2.1.10. Hóa chất dùng cho điện di trên gel polyacrylamide 28 2.1.11. Hóa chất dùng cho tinh chế DNA từ thạch agarose 29 2.1.12. Hóa chất dùng cho tinh chế plasmid 29 2.1.13. Hóa chất dùng cho phương pháp Western blot 29 2.2. PHƯƠNG PHÁP 30 2.2.1. Phương pháp thu mẫu 30 2.2.2 Phương pháp làm giàu và phân lập vi khuẩn Meiothermus ruber 30 2.2.3. Phương pháp định danh vi khuẩn Meiothermus ruber 30 2.2.3.1. Khảo sát hình thái tế bào 30 2.2.3.2. Giải trình tự gen 31 [...]... nhiệt và chịu nhiệt cực đoan được tìm thấy ở cả 2 nhóm cổ khuẩn và vi khuẩn Các vi sinh vật chịu nhiệt cực đoan chiếm vị trí cơ bản nhất trong cây phát sinh loài Ở vi khuẩn, chỉ 2 loài Thermotoga và Aquifex là chịu nhiệt cực đoan 1.1.3 Vi khuẩn Meiothermus ruber Vi khuẩn Meiothermus ruber là vi khuẩn hiếu khí, hình que, gram âm, không di động Vi khuẩn này được phân lập ở hầu hết các suối nước nóng có nhiệt. .. được báo cáo ở vi khuẩn Pimelobacter sp Tsusaki và cộng sự đã tạo dòng gen trehalose synthase từ chủng vi khuẩn Pimelobacter Sp phân lập được từ đất [34] Vi c phân tích trình tự đã cho thấy gen trehalose synthase tạo dòng ở vi khuẩn này dài 1719bp và chứa khoảng 573 acid amin Sau đó, Tsujisaka và cộng sự đã tinh sạch và khảo sát một số hoạt tính, các yếu tố ảnh hưởng của enzyme đã được tạo dòng này Kết... xuất công nghiệp trehalose từ maltose [32] Thành công trong vi c tạo dòng enzyme trehalose synthase từ vi khuẩn Pimelobacter sp đã tạo tiền đề cho các nhà khoa học trong vi c tạo dòng enzyme này ở các chủng vi khuẩn khác Enzyme Trehalose synthase của Pseudomonas stutzeri CJ38, Torridus Picrophilus, Thermobifida fusca, Mycobacterium smegmatis, Grifola frondosa… đã được tạo dòng và biểu hiện trong E.coli... chia làm 3 loại: các loài vi sinh vật chịu nhiệt trung bình phát triển ở trên 65oC, chịu nhiệt độ cao ở trên 75oC và chịu nhiệt cực đoan ở trên 90oC Những vi sinh vật này, chủ yếu là vi khuẩn và cổ khuẩn, được phân lập ở hầu hết các môi trường trên cạn có chứa nước, các môi trường biển tự nhiên cũng như ở các môi trường nhân tạo Các môi trường trên cạn bao gồm các suối nước nóng và các khu vực núi lửa... CHỦNG VI KHUẨN MEIOTHERMUS RUBER Từ SUỐI NƯỚC NÓNG 41 3.2.THU NHẬN GEN MÃ HÓA ENZYME TREHALOSE SYNTHASE TỪ CHỦNG VI KHUẨN MEIOTHERMUS RUBER 42 3.3.TẠO DÒNG GEN MÃ HÓA ENZYME TREHALOSE SYNTHASE VÀO VECTOR pET- 22b 43 3.3.1 Chèn gen TreS vào pJet1.2 blunt 43 3.3.2 Chèn gen TreS vào pET-22b 44 3.4.BIỂU HIỆN TRÊN E.COLI BL21(DE3) 49 iv 3.4.1.Chọn lọc dòng. .. khoa học Trung Quốc đã tạo dòng thành công Trehalose synthase từ chủng vi khuẩn chịu nhiệt trung bình Meiothermus ruber phân lập từ các vùng suối nước nóng [35],[37] Những thành công này không Tổng quan 21 chỉ có ý nghĩa khoa học mà còn được được chứng minh là phù hợp cho vi c sản xuất trehalose ở qui mô công nghiệp Ngày nay, mối quan hệ giữa cấu trúc và chức năng của Trehalose synthase cũng đã được... thấy enzyme này ổn định ở dãy pH từ 6.0 đến 9.0 ở 30oC trong 60 phút [22] Tốc độ biến đổi maltose thành trehalose không phụ thuộc vào nồng độ maltose Năm 1997, Tsusaki và cộng sự đã tiếp tục tạo dòng thành công enzyme trehalose synthase từ chủng vi khuẩn Thermusaquaticus ATCC33923 chịu nhiệt Enzyme này đã cho thấy khả năng ổn định ở nhiệt độ đến 80oC trong 60 phút Sự ổn định nhiệt này thích hợp cho vi c... động và tính ổn định của enzyme có thể được gia tăng Ở Vi t Nam, hiện vẫn chưa có một nghiên cứu chính thức nào về Trehalose và enzyme trehalose synthase cũng như tác động của đường này lên cơ thể con người 1.3 KỸ THUẬT TẠO DÒNG [1],[4] Kỹ thuật tạo dòng ra đời trên cơ sở các thành tựu của sinh học phân tử và hiện nay đóng vai trò là một bộ phận quan trọng của lĩnh vực công nghệ sinh học Kỹ thuật tạo dòng. .. trên phân tử rRNA16S ở prokayote và kết quả là sự hình thành cây phát sinh loài prokayote và sự hình thành một nhóm Tổng quan 6 vi sinh vật mới: cổ khuẩn Và cho đến bây giờ, cây phát sinh loài được cấu tạo bởi các trình tự rRNA 16S ở prokayote và rRNA 18S ở eukaryote đã phân sinh giới ra làm 3 nhóm chính: Vi khuẩn (Bacteria), Cổ khuẩn (Archaea) và sinh vật nhân thật (Eukarya) Các vi sinh vật chịu nhiệt. .. Okayama, Nhật Bản, đã phát hiện ra một phương pháp không tốn kém sản xuất trehalose đại trà từ tinh bột Họ đã nghiên cứu các hệ thống enzym mới và đã thành công trong vi c cô lập một hệ thống enzyme mới từ một dòng vi khuẩn thuộc chi Arthrobacter sp Q36 phân lập từ đất Hệ thống này đã được tìm thấy bao gồm hai loại enzyme mới: malto-oligosyltrehalose synthase (MTSase) và malto-oligosyltrehalose trehalohydorolase