tạo dòng và biểu hiện enzymelipase từ bacillus subtilis trong tế bào chủ escherichia coli

Bộ giáo dục và đào tạo Trường Đại Học Mở Tp.HCM Khoa công nghệ sinh học   Bacillus subtilis  !Escherichia coli ĐT VN ĐÊ Enzyme Lipase được ứng dụng rộng rãi trong tất cả các ngành công nghiệp: chế biến thực phẩm, dược phẩm, hóa dầu Enzyme Lipase được tìm thấy ở một số loài thực vật, động vật, đặc biệt hiện diện ở nhiều loài vi sinh vật (Candida Sp, Aspergillus oryzae, Bacillus subtilis…). Giới thiệu về enzyme Lipase • Lipase: có trọng lượng phân tử từ 19-20 kDa, hoạt động thủy phân liên kết ester carboxyl của acylglycerols để giải phóng các axit béo và glycerol. • Phản ứng thủy phân triacylglycerol • Sự hoạt động của lipase phụ thuộc vào pH • Lipase không cần cofactor nhưng các cation hóa trị 2 như Ca 2+ thì kích thích lipase hoạt động. Lipase bị ức chế mạnh bởi CO 2+ , Ni 2+ , Hg 2+ và Sn 2+ và bị ức chế yếu bởi Zn 2+ , Mg 2+ , EDTA và SDS. • Hoạt động tối ưu của lipase khoảng 30-35 0 C • Ứng dụng của lipase: - Công nghệ chế biến thực phẩm: tăng hương vị trong sản phẩm sữa và các loại thực phẩm khác như thịt, rau, trái cây, sản phẩm sữa và bia. - Công nghiệp chất béo và dầu. - Trong dược phẩm, sản xuất dầu sinh học, sản xuất vật liệu sinh học, công nghiệp chất tẩy rửa, tổng hợp hữu cơ, công nghiệp giấy và bột giấy, sản xuất hóa chất nông nghiệp, và trong quản lí môi trường… Lipase được tìm thấy nhiều trong tự nhiên, nhưng lipase từ vi khuẩn thì có ý nghĩa thương mại hơn vì giảm chi phí sản xuất, ổn định cao, sẵn có hơn lipase thực vật và động vật. Aspergillus oryzae : Tổng hợp acid béo. Aspergillus sp: Tổng hợp hương vị. Bacillus subtilis: Sản xuất bánh mì. Candida rugosa: Tổng hợp hương vị.  Kĩ thuật tạo dòng:  Phương pháp xác định hoạt tính   !" #$ $" %& '()*+, /01/234 -5 6 7897: ; %<< 6 =>7?@) A7BCD=EF75G" ;) 1HI1) ; JBKBL 6 BM+7"M: ; $N"<:75)85 )OP@ ;">I$=QR7 F7>7?$ ; -75 6 ')IS(9 @ [...]... các chủng vi khuẩn phân lập từ đất thuộc giống Bacillus và có đặc điểm giống chính xác với B subtilis, bằng kỹ thuâ Ât PCR thu nhận đoạn gene mã hóa cho lipase, đạt được mục tiêu tạo protein tái tổ hợp lipase trong tế bào E .coli • Bài báo 2: Bằng kĩ thuật PCR thu nhâ Ân gen lipA và tạo dòng và biểu hiện gen lipA trong nhiều hệ thống tế bào chủ khác nhau: E .coli, S.cerevisiae, Bacillus subtilis. .. chủng B .subtilis: chủng chuẩn, chủng trong tự nhiên  Các bước thí nghiê Âm dự kiến – Tách chiết để thu nhận DNA bộ gen của B .subtilis, thu nhận vector – Sử dụng phương pháp PCR để khuếch đại DNA mục tiêu – Chuẩn bị enzyme cắt giới hạn, enzyme nối ligase – Tạo vector tái tổ hợp – Biến nạp vào tế bào chủ – Phát hiện dòng tế bào có mang vector tái tổ hợp, biểu hiện gen mục tiêu và kiểm tra hoạt... pRB473 [pSPO2-Lipa-T] và biến nạp vào các chủng B Subtilis khác Kết quả: b, Thảo luận Theo kết quả thu được, hoạt tính lipase lớn hơn 183 lần ở tế bào tái tổ hợp E Coli 5K/pBRLipA so với chủng gốc B subtilis MB216  Sự gia tăng hoạt tính lipase trong tế bào tái tổ hợp E coli 5K/pBRLipA là do có một số lượng lớn bản sao của gen mã hóa cho lipase được tạo trong tế bào chủ tái tổ hợp Bài báo... trình tự gen mã hóa cho enzyme lipase từ dầu oliu, chèn gen này vào plasmid Oli-pET26b và cho biến nạp vào tế bào chủ E .coli BL21-SI • Kết quả: - Trình tự khuếch đại DNA của B.pumilis không có ORFs  thoái hóa mồi gây khó khăn cho việc thực hiện PCR - Đối với gen Oli-lipase, không dễ dàng tạo dòng vào vector tạo dòng PCR vì có tính độc với tế bào chủ E .coli Bài báo Cặp mồi sử dụng Bài báo... dạng biến thể từ lipase của B .subtilis Bài báo 2 • Phương pháp: - Gen LipA đưa vào EcoRV pBR322 tạo plasmid pBRLipA, và tạo dòng trong E .Coli 5K Gen kháng Ampicillin, nhạy cảm tetracycline được phân lập, lựa chọn - Gen LipA được tách ra từ pBRLipA chèn vào Ye [pACT1-T] tạo plasmid tái tổ hợp YE[pACT1-LipA-T], sau đó biến nạp vào E coli 5K và S cerevisiae - Các gen LipA chèn vào pRB473 [pSPO2-T]-SmaI,... khuếch đại dùng mồi L1 và L2 có chiều dài 371 bp • Kết quả: biểu hiện tối đa tương ứng với nhóm I.4 của enzyme lipase của bacillus với giá trị tin cậy nhất cho lipase từ chủng B .subtilis • PCR lần 2 :sản phẩm với kích thước tương ứng khoảng 600-700bp • Các sản phẩm khuếch đại PCR thứ 2 được tinh sạch từ gel và nối vào vector tạo dòng Các vector tái tổ hợp là pTZGHlip và có đoạn mồi promoter... hợp Bài báo 3 • Phương pháp: - Các chủng vi khuẩn: E .coli DH5a và BL21-SI - Khuếch đại các trình tự ribosome 16S từ DNA của vi khuẩn bằng cặp mồi: + Mồi xuôi PB36 - Mồi ngược PB38 - DNA được tách từ B.pumilis và dầu oliu có trong tự nhiên Cặp mồi khuếch đại vùng gene lipase từ B.pumilis : BPUM1F - BPUM1R - Cặp mồi khuếch đại vùng gene lipase gen lipase từ dầu ô liu: + Mồi xuôi OPL1- Mồi... tế bào chủ E .coli • Bài báo 3: Gene mã hóa cho enzyme lipase từ các nguồn sinh vật khác nhau có thể được tạo dòng nhưng hiệu suất thu hồi còn thấp và có thể gây độc Kết luâ n ô – Tham khảo trên NCBI các trình tự về enzyme lipase – Tìm hiểu các phần mềm sinh tin học để so sánh độ tương đồng với các trình tự tham khảo – Sử dụng phần mềm để thiết kế cặp mồi – Tự thiết kế lại – Tìm chủng B .subtilis: ... cấy thành công các chủng vi khuẩn đã phân lập được; tạo ra các khuẩn lạc đơn và khảo sát được khả năng phân giải lipid • Các chủng vi khuẩn phân lập có đặc điểm: Gram(+), nội bào tử, hình que như đặc điểm chung của vi khuẩn Bacillus • Trình tự aa được so sánh với trình tự protein trên NCBI cho thấy: 98% giống với lipase của các chủng B subtilis, 68% giống với esterase của B subtilis • GHlip được... 5'-cgcggatccattaattcgtattctggcc-3' Bài báo 2 -Cặp mồi thu nhận gen lipA từ B .subtilis 168 FWBSLA 5'-TCT AGA GGA GGA TAT TAT GAA ATT TG BKBSLA 5'-GCA TGC CAT TAA TTC GTA TTC TGG CC Bài báo 3 - Cặp mồi thu nhận gen lipase từ B.pumilis BPUM1F-GAGTCGTATAAGATGAATAAGGGGG AATG BPUM1R- TTAATTCGTATTTTGTCCTCCGCCGTTC - Cặp mồi thu nhận gen lipase từ dầu oliu Mồi xuôi OPL1F-GAATTTTTTTAGGAGGACACTAT GAGTG Mồi ngược OPL1RCCCTGCAGCTTATTTACCCCCA . Bộ giáo dục và đào tạo Trường Đại Học Mở Tp.HCM Khoa công nghệ sinh học    Bacillus subtilis   ! Escherichia coli ĐT VN ĐÊ Enzyme. thực vật và động vật. Aspergillus oryzae : Tổng hợp acid béo. Aspergillus sp: Tổng hợp hương vị. Bacillus subtilis: Sản xuất bánh mì. Candida rugosa: Tổng hợp hương vị.  Kĩ thuật tạo dòng:  Phương. sản phẩm sữa và bia. - Công nghiệp chất béo và dầu. - Trong dược phẩm, sản xuất dầu sinh học, sản xuất vật liệu sinh học, công nghiệp chất tẩy rửa, tổng hợp hữu cơ, công nghiệp giấy và bột giấy,