TẠP CHÍ PHÁT TRIỂN KH&CN, TẬP 16, SỐ T1 - 2013 Tạo dòng biểu protein leptin người tái tổ hợp Escherichia coli • • • • Lê Mai Hương Xn Lê Đình Tố Đặng Thị Phương Thảo Trần Linh Thước Trường ĐH Khoa học Tự nhiên, ĐHQG-HCM (Bài nhận ngày 20 tháng 03 năm 2013, nhận đăng ngày 20 tháng năm 2013) TĨM TẮT Leptin hormone có chất protein tiết chủ yếu từ mơ mỡ, có vai trò quan trọng điều hòa lượng thức ăn q trình tiêu hao lượng thể. Leptin tái tổ hợp chứng minh có hiệu tốt việc điều trị bệnh béo phì người. Nhằm thu nhận protein leptin tái tổ hợp Escherichia coli, chúng tơi dòng hóa gene mã hóa cho protein leptin người (hob gene) vào vector biểu pET-28a. Khi khảo sát biểu protein tế bào chủ E. coli BL21(DE3), vector tái tổ hợp pET-hob cho thấy khả biểu vượt mức protein leptin tế bào chất, chủ yếu dạng thể vùi. Kết tiền đề cho nghiên cứu nhằm sản xuất protein leptin người tái tổ hợp. Từ khóa: tạo dòng, biển vượt mức protein, leptin, ob gene, vector biểu hiện. MỞ ĐẦU Ở người, protein leptin (h-leptin) mã hóa gene nằm vùng q31.3 nhiễm sắc thể 7. Vùng gene mã hóa dài khoảng 16352 nucleotide, bao gồm exon phân cách intron [2]. Leptin sau dịch mã có 167 amino acid với chuỗi tín hiệu tiết dài 21 amino acid, sau chuỗi peptide tiết bị thủy phân, protein leptin tuần hồn máu có 146 amino acid, lưu thơng hai dạng: dạng tự dạng phức hợp liên kết với protein mang [7]. h-leptin có khối lượng phân tử 16kD, khơng đòi hỏi glycosyl hóa, cấu trúc bậc ba gồm bốn chuỗi xoắn alpha đối song theo kiểu “up-updown-down”. Phân tử protein có vùng kị nước tạo thành từ tương tác kị nước amino acid chuỗi xoắn.Trong phân tử có hai cysteine tạo thành cầu nối disulfide Cys96-Cys146 [1]. Leptin có vai trò quan trọng điều hòa thể trọng. Thơng qua vùng đồi leptin điều chỉnh thái độ ăn uống, tiêu hao lượng thể. Thái độ ăn uống điều hòa peptide thần kinh vùng đồi NPY (Neuropeptide Y), AgRP (agouti-related peptide) MSH (alpha-melanocortin stimulating hormone) [5]. Khi chất béo thể tăng lên, lượng leptin tăng lên, dẫn đến ức chế biểu NPY AgRP, tăng cường biểu MSH. Điều dẫn đến q trình tiêu thụ thức ăn giảm xuống, gia tăng tiêu hao lượng. Từ đặc điểm hoạt động chức năng, leptin ngày quan tâm nghiên cứu sử Trang Science & Technology Development, Vol 16, No.T1 - 2013 dụng làm thuốc điều trị bệnh béo phì [6]. Tổ chức Y tế giới (WHO) định nghĩa béo phì tình trạng tích lũy mỡ q mức khơng bình thường vùng thể tồn thân đến mức ảnh hưởng đến sức khỏe. Người bị béo phì ngồi thân hình phì nộn, nặng nề, khó coi,… có nguy mắc nhiều bệnh rối loạn lipid máu, tăng huyết áp, tai biến mạch máu, sỏi mật, đái tháo đường, xương khớp ung thư. Theo nhận định WHO béo phì trở thành “bệnh dịch tồn cầu”, bệnh tăng lên với tốc độ báo động nước phát triển phát triển. Năm 2010, Việt Nam, bệnh béo phì đạt xấp xỉ 26% số lượng người trưởng thành. GeneDesiger, việc thay đổi codon nhằm mục đích biểu gene hệ thống vi khuẩn Escherichia coli. Gene hob chúng tơi thiết kế đặt tổng hợp gắn vào vector mang pITDSmart (pIDSmart-hob). Đồng thời, chúng tơi thiết kế cặp mồi đặc hiệu 5’-NcoI-hob (TTG TAA TGC CCA TGG TGC CGA) 3’-XhoI-hob (ACG CAT CTC GAG TTA GCA GCC) nhằm thu nhận gene mục tiêu phản ứng PCR. Leptin thể ưu điều trị béo phì hợp chất sinh học, sản xuất cơng nghệ DNA tái tổ hợp, từ cho giá thành rẻ thân thiện với người loại thuốc tổng hợp hóa học khác. Nhằm mục đích tạo nguồn leptin dồi có chất lượng cao để phục vụ cho việc nghiên cứu phát triển thành dược phẩm, chúng tơi thực bước đề tài tạo dòng, biểu protein leptin người tái tổ hợp hệ thống Escherichia coli. Cấu trúc vector tái tổ hợp pET-hob VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP Chủng chủ plasmid - Chủng Escherichia coli DH5α [F , Ø80lacZ∆M15, recA1, endA1, hsdR17 (rk-, mk+), phoA, supE44, λ-, thi-1, gyrA96, relA1] dùng làm tế bào chủ để nhân plasmid. Chủng Escherichia coli BL21(DE3) [F- ompThsdS (rBmB) gal dcm (DE3)] dùng để biểu protein. Vector pET-28a có kích thước 5369bp, chứa T7 promoter kiểm sốt biểu gene thơng qua IPTG sử dụng để thiết kế vector tái tổ hợp biểu protein h-leptin. Thiết kế thu nhận gene hob mã hóa cho protein leptin người Gene mã hóa cho protein leptin người phân tích tối ưu số codon phần mềm Trang Chương trình PCR thu nhận gene hob: chu kỳ: 95oC – phút; 30 chu kỳ: 94oC – 45 giây, 55oC – 45 giây, 72oC – 45 giây; chu kỳ: 72oC – 10 phút. Đoạn gene khuếch đại kiểm tra gel agarose 1%. Gene hob vector pET-28a xử lý hai enzyme cắt hạn chế NcoI XhoI, sau tinh chế kit Gel Extraction Kit (Biobasic, Canada). Gene hob nối vào vector pET-28a cắt mở vòng nhờ enzyme T4 DNA ligase để tạo plasmid tái tổ hợp pEThob. Dung dịch phản ứng nối biến nạp vào tế bào E. coli DH5α phương pháp hóa biến nạp sàng lọc bước đầu mơi trường LB có chứa kháng sinh kanamycin nồng độ 30µg/ml. Các thể biến nạp thu nhận kiểm tra phương pháp PCR khuẩn lạc với cặp mồi 5’-NcoI-hob, 3’-XhoI-hob phương pháp sử dụng enzyme cắt hạn chế với enzyme NcoI XhoI. Ngồi ra, thể biến nạp kiểm tra chiều phương pháp PCR với cặp mồi 5’NcoI-hob T7ter. Các sản phẩm điện di kiểm tra gel agarose 1%. Kết tạo dòng khẳng định phương pháp giải trình tự với mồi T7pro. Tạo dòng E. coli BL21(DE3) có mang vector tái tổ hợp pET-hob Vector tái tổ hợp pET-hob thu nhận hóa biến nạp vào tế bào E. coli BL21(DE3). Dòng vi khuẩn BL21(DE3) có mang vector tái TẠP CHÍ PHÁT TRIỂN KH&CN, TẬP 16, SỐ T1 - 2013 hợp khuẩn lạc sinh trưởng mơi trường LB có bổ sung kanamycine 30µg/ml PCR với cặp mồi 5’-NcoI-hob, 3’-XhoIhob cho vạch khuyếch đại khoảng 441bp, với kích thước gene hob. với protein leptin phát kháng thể thứ cấp anti-IgG dê đánh dấu HRP (Abcam, Anh). Q trình phim thực kit ECL (Amersham Bioscience, Anh). Cảm ứng biểu phân tích SDSPAGE Tạo dòng vector mang biểu gene hob E. coli Các dòng BL21(DE3)/pET-hob cấy hoạt hóa mơi trường LB có chứa kháng sinh kanamycin 30µg/ml. Sau 16-18 ni cấy, tiến hành cấy chuyền dịch vi khuẩn qua ống nghiệm chứa 5ml mơi trường LB có bổ sung kanamycin 30µg/ml, tỉ lệ cấy chuyền 1/10 (v/v), lắc 250rpm 37°C. Đến dịch vi khuẩn đạt OD600 = 0.8-1.0 cảm ứng IPTG 0.5mM, tiếp tục lắc 250rpm 37°C. Sau cảm ứng, tiến hành thu sinh khối tế bào. Điện di SDSPAGE để kiểm tra biểu vượt mức protein sử dụng phần mềm Quantity One 4.2.1 để đánh giá tỉ lệ protein tái tổ hợp mẫu protein tổng số. Với mục đích biểu gene hob thu nhận protein leptin tái tổ hợp tế bào chủ E. coli, chúng tơi sử dụng vector pET-28a làm vector mang gene. Các kết phân tích trình tự gene hob cho thấy trình tự gene khơng mang vị trí cắt enzyme vùng multiple cloning site (MCS) vector pET-28a. Chúng tơi chọn sử dụng cặp enzyme NcoI XhoI cắt mở vòng vector nhằm đảm bảo gene chèn chiều. Song song đó, chúng tơi tiến hành thu nhận gene mã hóa cho protein h-leptin (gene hob) từ vector pIDTSmart-hob phản ứng PCR với mồi đặc hiệu cho gene. Cặp mồi đặc hiệu có gắn thêm vị trí cắt enzyme cắt hạn chế NcoI (mồi xi) XhoI (mồi ngược). Gene thu nhận từ phản ứng PCR kiểm tra điện di gel agarose. Kết phân tích cho thấy chúng tơi thu nhận đoạn gene có kích thước 441bp (Hình 1A, giếng 2), với kích thước gene hob. Sau thu nhận gene hob chúng tơi tiến hành xử lý gene với enzyme NcoI XhoI nhằm tạo đoạn gene hob với hai đầu dính, đoạn gene tinh chế nối vào vector pET-28a cắt mở vòng hai enzyme nói trên. Hỗn hợp sản phẩm nối biến nạp vào E. coli DH5α (Hình 1B). Sau đó, tiến hành phá màng tế bào sóng siêu âm để thu protein pha tổng, tủa, tan phân tích biểu protein điện di SDS-PAGE. Thực đồng thời hai mẫu đối chứng âm mẫu dịch nội bào BL21(DE3)/pEThob khơng cảm ứng IPTG mẫu dịch nội bào BL21(DE3) khơng mang vector tái tổ hợp. Xác nhận diện protein h-leptin Western Blot Sau điện di, vạch protein chuyển lên màng lai nitrocellulose. Màng lai lai với kháng thể kháng leptin bắt đặc hiệu KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Trang Science & Technology Development, Vol 16, No.T1 - 2013 XhoI NcoI Hình 1A. Thu nhận gene hob. Hình 1B. Sơ đồ tạo dòng plasmid tái tổ hợp pET-hob Vector tái tổ hợp pET-hob mang gene chọn lọc gene kháng kháng sinh kanamycin, chúng tơi sàng lọc thể biến nạp E. coli dự đốn dựa vào khả sinh trưởng mơi trường LB có bổ sung kanamycine, sau thu nhận dịch chiết tế bào từ thể biến nạp sử dụng làm khn phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu cho gene hob nhằm xác định diện gene hob thể biến nạp. Đối với thể biến nạp cho phản ứng dương tính, chúng tơi tiến hành ni cấy thu nhận plasmid. Các plasmid kiểm tra diện, chiều gene hob, kiểm tra trình tự đồng khung dịch mã. Chúng tơi kiểm tra diện gene hob vector pET-28a cách PCR plasmid thu với cặp mồi đặc hiệu cho gene. Kết Hình 2, giếng bảng điện di có vạch có kích thước khoảng 441bp, với vạch kích thước gene hob (giếng 7). Song song đó, chúng tơi tiến hành phản ứng cắt plasmid thu hai enzyme dùng để tạo dòng NcoI XhoI, kết giếng có hai vạch: vạch kích thước lớn khoảng 5231bp với kích thước vector pET-28a cắt hai enzyme tương ứng (giếng 6), vạch kích thước nhỏ khoảng 441bp với kích thước gene hob Trang (giếng 7). Như vậy, chúng tơi chèn gene hob vào vector pET-28a. Hình 2. Kết kiểm tra plasmid tái tổ hợp. 1: Thang DNA 1kb plus; 2: Sản phẩm PCR plasmid tái tổ hợp với cặp mồi đặc hiệu 5’-NcoI-hob 3’-XhoI-hob; 3: Sản phẩm PCR plasmid tái tổ hợp với cặp mồi 5’NcoI-hob T7ter; 4: Plasmid tái tổ hợp pET-hob; 5: Plasmid tái tổ hợp xử lý hai enzyme NcoI XhoI; 6: Plasmid pET-28a xử lý với hai enzyme NcoI XhoI; 7: Gene hob xử lý với hai enzyme NcoI XhoI. Chiều gene hob vector pET-28a khẳng định phương pháp PCR plasmid với cặp mồi đối chiều mồi xi 5’NcoI-hob mồi T7ter. Nếu gene chèn TẠP CHÍ PHÁT TRIỂN KH&CN, TẬP 16, SỐ T1 - 2013 chiều cho vạch khuyếch đại có kích thước khoảng 519bp, ngược lại gene khơng chèn chiều khơng có sản phẩm khuyếch đại (Hình 3). Kết thể giếng 3, hình 2, có xuất vạch kích thước khoảng 519bp mong đợi. Như gene hob chèn vào vector pET-28a chiều. Hình 3. Vị trí mồi 5’-NcoI-hob, T7ter vector tái tổ hợp pET-hob. Đoạn gene hob plasmid tái tổ hợp pEThob sau giải trình tự mồi T7pro so sánh với trình tự gene mã hóa protein h-leptin thiết kế cho thấy có độ tương đồng 100% đồng khung dịch mã. Tuy nhiên, đề tài q trình nghiên cứu nhằm phát triển hleptin tái tổ hợp thành dược phẩm nên chúng tơi chưa cơng bố trình tự gene hob đây. Tạo dòng BL21(DE3) có mang vector tái tổ hợp pET-hob Sau cấu trúc thành cơng vector tái tổ hợp pET-hob, chúng tơi biến nạp vector pET-hob vào tế bào E. coli BL21(DE3) trải mơi trường LB có bổ sung kanamycin. Những khuẩn lạc mọc mơi trường sàng lọc lựa chọn ngẫu nhiên để PCR kiểm tra diện vector tái tổ hợp, sử dụng cặp mồi đặc hiệu gene hob. Kết cho thấy Hình 4, giếng xuất vạch khuyếch đại tương ứng với kích thước gene hob. Như vậy, chúng tơi tạo dòng thành cơng chủng E. coli BL21(DE3)/pET-hob. Hình 4. Kết PCR khuẩn lạc với cặp mồi đặc hiệu. 1: Thang DNA kb plus; 2: Chứng dương (khn pIDTSmart-hob); 3: Chứng âm; 4, 5: PCR khuẩn lạc với cặp mồi đặc hiệu. Biểu protein h-leptin Escherichia coli Điều kiện cảm ứng biểu protein h-leptin mơ tả phần phương pháp. Sinh khối vi khuẩn thu nhận xử lý mẫu nhằm kiểm tra bước đầu biểu vượt mức protein tái tổ hợp phương pháp SDS-PAGE. Kết thể bảng điện di SDS-PAGE (Hình 5A) cho thấy dòng E. coli BL21(DE3)/pET-hob kiểm tra có biểu protein tái tổ hợp tốt. Khi phân tích mức độ biểu protein mẫu phần mềm Quantity One (Hình 5B) cho thấy dòng BL21(DE3)/pET-hob giếng có tỉ lệ biểu protein tái tổ hợp cao dòng kiểm tra (khoảng 29% tổng số protein). Trang Science & Technology Development, Vol 16, No.T1 - 2013 Hình 5. Kết kiểm tra biểu vượt mức protein leptin tái tổ hợp. A. Kiểm tra biểu protein. B. Phân tích mức độ biểu protein. 1: E. coli BL21(DE3)/pET-hob (-)IPTG; 2-9: Các dòng khác E. coli BL21(DE3)/pET-hob (+)IPTG. C. Tỉ lệ chủng biểu vượt mức protein. Kết khảo sát thể biến nạp E. coli BL21(DE3)/pET-hob cho thấy có 62.5% thể biến nạp có tỉ lệ biểu vượt mức protein từ 12.5% đến 15% protein tổng số; 12.5% thể biến nạp biểu protein từ 16% đến 20% tổng số protein tế bào; 25% thể biến nạp có tỉ lệ biểu protein chiếm 25% đến 30% protein tổng số (Hình 5C). Tuy mức độ biểu vượt mức protein tái tổ hợp khác thể biến nạp hình thái q trình tăng trưởng chủng khơng có khác biệt, thể đường cong tăng trưởng chủng thu khơng có khác mặt phân tích thống kê (kết khơng trình bày đây). Kết khảo sát cho thấy bên cạnh kiểu gene chủng chủ, biểu protein tái tổ hợp tế bào chủ nhiều phụ thuộc vào tương tác vector biểu chủng chủ, trạng thái sinh lý tế bào chủ sau q trình biến nạp. protein to, đậm, giếng tương ứng với mẫu protein pha tan khơng thấy xuất protein này. Các vạch protein tổng (giếng 3) protein pha tủa (giếng 4) xác nhận Western blot với kháng thể kháng leptin (Hình 6). Chúng tơi tiến hành chọn dòng E. coli BL21(DE3)/pET-hob có mức độ biểu leptin tái tổ hợp mức cao để tiến hành phân tích biểu protein phương pháp SDSPAGE xác nhận biểu Western blot (WB). Kết phân tích SDS-PAGE (Hình 6) cho thấy giếng tương ứng với mẫu protein tổng số, có vạch protein to, đậm, kích thước khoảng 16 kDa, đó, hai chứng âm giếng giếng khơng có diện vạch protein này. Mặc khác, giếng tương ứng với mẫu protein pha tủa, thu vạch Hình 6. Kết kiểm tra biểu protein h-leptin E. coli BL21(DE3). 1: Thang protein phân tử lượng thấp; 2: E. coli BL21(DE3)/pET-hob (-)IPTG; 3: E. coli BL21(DE3)/pET-hob (+)IPTG (pha tổng); 4: E. coli BL21(DE3)/pET-hob (+)IPTG (pha tủa); 5: E. coli BL21(DE3)/pET-hob (+)IPTG (pha tan); 6: E. coli BL21(DE3) (+)IPTG. Trang 10 Với kết chúng tơi khẳng định protein h-leptin biểu vượt mức, protein tồn hầu hết dạng thể vùi. Sự biểu protein leptin tái tổ hợp dạng thể vùi tạo ưu thu nhận lượng lớn protein mục tiêu từ tế bào chủ. Kết phân tích SDS-PAGE TẠP CHÍ PHÁT TRIỂN KH&CN, TẬP 16, SỐ T1 - 2013 cho thấy dễ dàng thu nhận phân đoạn protein mục tiêu lượng protein tạp diện phân đoạn protein thu (giếng 4, Hình 6). Tuy nhiên, để thu nhận protein leptin có hoạt tính từ dạng thể vùi cần phải trải qua nhiều cơng đoạn nhằm tái gấp cuộn protein mục tiêu. KẾT LUẬN Hiện nay, bệnh béo phì phát triển với tốc độ nhanh, nhu cầu nghiên cứu sử dụng h-leptin tái tổ hợp trở nên cấp thiết. Vì vậy, việc sản xuất protein h-leptin tái tổ hợp hệ thống E. coli hứa hẹn cung cấp sản phẩm protein tái tổ hợp chất lượng cao, giá thành hợp lý nhằm phục vụ cho nhu cầu sử dụng thuốc Việt Nam. Chúng tơi thiết kế cấu trúc thành cơng vector tái tổ hợp mang gene mã hóa cho protein leptin người (pET-hob), đưa vector tái tổ hợp vào chủng E. coli biểu BL21(DE3) cảm ứng biểu thành cơng protein h-leptin dạng thể vùi. Những kết tiền đề cho nghiên cứu nhằm sản xuất hleptin tái tổ hợp phát triển thành dược phẩm. Cloning and expression of recombinant human leptin in Escherichia coli • • • • Le Mai Huong Xuan Le Dinh To Dang Thi Phuong Thao Tran Linh Thuoc University of Science, VNU-HCM ABSTRACT Leptin, a peptide hormone, is produced by mature adipocytes and functions primarily in the hypothalamus to reduce food intake and body weight. Recombinant h-leptin has been shown to be effective in obesity treatment. To overexpression of recombinant human leptin in Escherichia coli, the human leptin gene (hob gene) was cloned into the vector pET-28a. When analysis expression of human leptin in E. coli BL21(DE3) strain, it was found that recombinant vector pET-hob expressed h-leptinproteins in cytoplasm, and mainly as insoluble inclusion bodies. This result will be the premise for researching to produce recombinant human leptin protein. Key word: cloning, gene expression, leptin, ob gene, vector. Trang 11 Science & Technology Development, Vol 16, No.T1 - 2013 TÀI LIỆU THAM KHẢO [1]. A. D. Kline, G. W. Becker, L. M. Churgay et al., Leptin is a four-helix bundle: secondary structure by NMR, FEBS Letters, 407, 239242 (1997). [2]. D.-W. Gong, S. Bi, R. E. Pratley et al., Geneomic Structure and Promoter Analysis of the Human obese Gene, Journal of Biological Chemistry, 271, 3971-3974, (1996). [3]. F. Baneyx, Recombinant protein expression in Escherichia coli, Current Opinion in Biotechnology, 10, 411-421 (1999). [4]. F. J. M. Mergulhão, D. K. Summers, G. A. Monteiro, Recombinant protein secretion in Trang 12 Escherichia coli, Biotechnology Advances, 23, 177-202 (2005). [5]. J. M. Friedman, The function of leptin in nutrition, weight, and physiology, Nutr Rev, 60, 10 Pt 2, S1-14; discussion S68-84, 85-7 (2002). [6]. R. L. Leibel, The role of leptin in the control of body weight, Nutr Rev, 60, 10 Pt 2, S15-9, discussion S68-84, 85-7 (2002). [7]. Y. Zhang, R. Proenca, M. Maffei et al., Positional cloning of the mouse obese gene and its human homologue, Nature, 372, 425432 (1994). . định protein h -leptin đã được biểu hiện vượt mức, và protein tồn tại hầu hết ở dạng thể vùi. Sự biểu hiện protein leptin tái tổ hợp ở dạng thể vùi tạo ưu thế thu nhận một lượng lớn protein. biểu hiện vượt mức protein từ 12.5% đến 15% protein tổng số; 12.5% các thể biến nạp biểu hiện protein từ 16% đến 20% trên tổng số protein của tế bào; 25% thể biến nạp có tỉ lệ biểu hiện protein. nhận protein leptin tái tổ hợp trong Escherichia coli, chúng tơi đã dòng hóa gene mã hóa cho protein leptin của người (hob gene) vào vector biểu hiện pET-28a. Khi khảo sát sự biểu hiện protein