TẠO DÒNG VÀ BIỂU HIỆN GEN CHITINASE TỪ NẤM TRICHODERMA

TẠO DÒNG VÀ BIỂU HIỆN GEN CHITINASE TỪ NẤM TRICHODERMA

1 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC HUẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC NGUYỄN BẢO HƯNG TẠO DÒNG VÀ BIỂU HIỆN GEN CHITINASE TỪ NẤM TRICHODERMA CHUYÊN NGÀNH: SINH HỌC THỰC NGHIỆM MÃ SỐ: 60.42.30 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC SINH HỌC 2 NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC PGS. TS NGUYỄN HOÀNG LỘC Huế, 2010 LỜI CAM ĐOAN Tôi cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu, kết quả nêu trong luận văn là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Người cam kết Nguyễn Bảo Hưng 3 Lời cảm ơn Trong suốt quá trình làm việc, ngoài sự nổ lực của bản thân, em đã nhận được sự giúp đở nhiệt tình của quý thầy cô, anh chị kỹ thuật viên ở Viện Tài nguyên Môi trường và Công Nghệ Sinh Học, em xin chân thành cảm ơn. Đặc biệt, em xin bày tỏ lời biết ơn chân thành nhất đến thầy PGS.TS Nguyễn Hoàng Lộc, người đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo, động viên, giúp em vững tin trên con đường mình đang đi. Cuối cùng, em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến gia đình, người thân của mình đã khích lệ, động viên tinh thần cho em trong suốt thời gian học tập và làm việc. Trong quá trình làm việc, bước đầu làm quen với chuyên môn có thể mắc nhiều sai sót, em sẽ cố gắng hoàn thiện mình để ngày một trưởng thành hơn. Em xin chân thành cảm ơn! Huế, tháng 11 năm 2010 Nguyễn Bảo Hưng 4 MỤC LỤC Trang phụ bìa Lời cam đoan Lời cảm ơn Mục Lục Danh mục các kí hiệu, các chữ viết tắt Danh mục các bảng Danh mục các hình vẽ, đồ thị Mở đầu Chương 1. Tổng quan 1.1. Tổng quan về chitinase 1.1.1. Giới thiệu chitinase 1.1.2. Tình hình nghiên cứu chitinase 1.1.3. Khả năng kiểm soát nấm bệnh và côn trùng gây hại thực vật của chitinase. 1.2. Tổng quan về nấm Trichoderma 1.2.1 Tình hình nghiên cứu nấm Trichoderma 1.2.2. Một số yếu tố ảnh hưởng đến sự phát triển của nấm Trichoderma 1.2.3. Khả năng kiểm soát các tác nhân gây bệnh cây trồng và cơ chế tác động của nấm đối kháng Trichoderma 1.2.3.1. Hiệu quả đối kháng của nấm Trichoderma đối với nấm gây bệnh cây trồng 5 1.2.3.2. Cơ chế tác động của nấm Trichoderma lên các tác nhân gây bệnh cây trồng 1.3. Tổng quan về công nghệ DNA tái tổ hợp 1.3.1. Giới thiệu chung 1.3.2. Ứng dụng công nghệ DNA tái tổ hợp trong sản xuất enzyme 1.4. Tình hình nghiên cứu về chitinase tái tổ hợp 1.5. Tạo dòng và biểu hiện gene trong E.coli 1.6. Tạo dòng và biểu hiện gen trong nấm men Chương 2. Đối tượng và phương pháp nghiên cứu 2.1. Đối tượng nghiên cứu 2.2. Phương pháp nghiên cứu 2.2.1.Xác định chủng Trichoderma sinh chitinase ngoại bào mạnh 2.2.2. Xác định hoạt tính chitinase 2.2.3. Tách chiết chitinase 2.2.4. Xác định khối lượng phân tử của chitinase 2.2.5. Định danh chủng nấm Trichoderma 2.2.5.1. Tách chiết genomic DNA 2.2.5.2. Tạo dòng trình tự ITS 2.2.5.3. Tạo dòng và biểu hiện gen chitinase 2.2.6. Các phương pháp thống kê sinh học Chương 3. Kết quả và thảo luận 3.1. Tuyển chọn các chủng nấm Trichoderma tiết chitinase ngoại bào mạnh 6 3.2. Xác định hoạt độ chitinase bằng phương pháp quang phổ 3.3. Xác định khối lượng phân tử của enzyme chtinase 3.4. Định danh chủng nấm 3.5. Tạo dòng và biểu hiện gen chitinase Chương 4. Kết luận TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC 7 BẢNG CHỮ VIẾT TẮT CS: cộng sự IPTG: Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside BMV: brome mossaic virus TMV: Tobacco mosaic virus RT-PCR: reverse transcription-polymerase chain reaction PCR: Polymerase Chain Reaction 8 DANH MỤC CÁC BẢNG VÀ HÌNH Hình 3.1. Vòng phân giải chitin của các chủng nấmTrichoderma spp. Hình 3.2. Điện di SDS và điện di cơ chất Hình 3.3. Phản ứng PCR với cặp mồi ITS1 và ITS4 Hình 3.4. So sánh trình tự ITS của chủng SH16 với chủng ZJPH0810 Hình 3.5. Phản ứng PCR với cặp mồi C42R và C42F Hình 3.6. So sánh trình tự các gen chitinase phân lập được và gen ech42. Dấu * thể hiện sự giống nhau trong trình tự của các gen. Hình 3.7. Vector pYES2/NT A có mang gen chi42-SH16 Hình 3.8. Kiểm tra sự hiện diện của gen chi42-SH16 trong nấm men tái tổ hợp Hình 3.9. Hoạt tính chitinase tái tổ hợp theo thời gian cảm ứng Danh mục bảng Bảng 3.1. Đường kính vòng phân giải chitin của Trichoderma trên môi trường cảm ứng Bảng 3.2.Hoạt độ chitinase của các chủng Trichoderma spp. 9 MỞ ĐẦU Cây trồng nông nghiệp bao gồm các loại rau và ngũ cốc như: rau ăn lá, ăn quả, củ, đậu đỗ, lúa, ngô, khoai, sắn… giữ vai trò quan trọng trong bữa ăn hàng ngày của từng gia đình và là nguồn hàng xuất khẩu có giá trị. Tuy nhiên, đây là loại cây trồng có những đặc điểm hình thái và sinh trưởng thuận lợi cho các loại sâu và nấm bệnh sống ký sinh. Sức tàn phá của các loại sâu và nấm bệnh này nhiều khi rất lớn, gây tổn thất nghiêm trọng về năng suất và chất lượng của cây trồng [15]. Việt Nam là nước có khí hậu nhiệt đới, vì thế thích hợp cho nhiều loại sâu và nấm bệnh gây hại cây trồng nông nghiệp phát triển. Các loại nấm bệnh gây hại thường gặp ở cây trồng như Rhizoctonia gây bệnh thối gốc (lở cổ rễ), Fusarium gây bệnh héo rũ, thối khô, Alternaria gây bệnh đốm vòng… Để hạn chế tác hại của nấm bệnh, một trong những phương pháp có hiệu quả là sử dụng hóa chất và thuốc trừ sâu bệnh. Tuy nhiên, việc làm này gây tác hại lâu dài với môi trường và sức khoẻ của cộng đồng [10]. Hiện nay, công nghệ sinh học ngày càng phát triển đã mở ra một hướng đi mới trong việc ngăn ngừa tác hại của sâu và bệnh hại cây trồng nhưng vẫn bảo vệ được môi trường như tạo ra các cơ thể tái tổ hợp có khả năng kháng lại các loại sâu bệnh [74], [75]. Công nghệ DNA tái tổ hợp (còn gọi là kỹ thuật di truyền hay kỹ thuật gen) là một bộ phận quan trọng và là công nghệ then chốt của lĩnh vực công nghệ sinh học. Công nghệ DNA tái tổ hợp ra đời trên cơ sở các thành tựu của sinh học phân tử và hiện nay đang đóng vai trò cách mạng trong sự phát triển của sinh học. Các kỹ thuật tái tổ hợp DNA cho phép phân lập và khuếch đại một gen đơn từ genome của một sinh vật để có thể nghiên cứu, biến đổi và chuyển nó vào trong một cơ thể sinh vật khác. Cải thiện hoạt tính và khả năng tổng hợp enzyme bằng kỹ thuật tái tổ hợp DNA hiện đang được ứng dụng rộng rãi [69], trong đó có tạo dòng và sản xuất chitinase [43], [64], [56]. 10 Chitinase là một enzyme glycosyl hydrolase xúc tác thủy phân chitin, có trong nhiều loại cơ thể sống khác nhau bao gồm vi khuẩn, nấm, động vật không xương sống, thực vật và động vật có xương sống. Chitinase thực vật là các enzyme xúc tác thủy phân chitin của nấm bệnh. Tuy nhiên, không phải cây trồng nào cũng có khả năng sản xuất chitinase, hoặc hoạt tính chitinase của chúng đủ cao để kháng lại nấm bệnh, vì vậy việc tạo ra một chủng sinh vật có khả năng sản xuất enzyme này với lượng lớn và hoạt tính cao là có ý nghĩa rất lớn [46]. Đến nay, đã có nhiều công trình nghiên cứu về tạo dòng và biểu hiện gen chitinase trong Escherichia coli, Saccharomyces cerevisiea và các loại vi khuẩn khác đã được công bố, như nghiên cứu của Boer và cộng sự (2007) về biểu hiệu gen chit33 và chit42 của Trichoderma harzianum trong E. coli [32], biểu hiện gen chitinase của Serratia marcescens trong các chủng Sinorhizobium fredii USDA191 và S. meliloti RCR2011 (Krishnan và cs 1999), biểu hiện gen chitinase của T. aureoviride trong nấm men S. cerevisiae (Jinzhu và cs 2005) . Xuất phát từ nhu cầu thực tiễn, chúng tôi thực hiện đề tài: “Tạo dòng và biểu hiện gen chitinase từ nấm Trichoderma ” nhằm mục đích sản xuất enzyme này với hiệu suất cao hơn các sinh vật truyền thống, từ đó áp dụng vào sản xuất nông nghiệp phòng trừ nấm bệnh trên một số cây trồng kinh tế như rau, quả hoặc các loại ngũ cốc. [...]... Việc tạo dòng và biểu hiện gen này trong một đối tượng khác nhằm khai thác tối đa hiệu suất của gen chitinase đã được nghĩ tới từ lâu Các vật chủ thường được các nhà nghiên cứu chọn để biểu hiện gen này là các vi sinh vật có khả năng sinh trưởng và phát triển nhanh như E coli, nấm men (Saccharomyces, Pichia) [30], [64], [56] Ping và cs (2008) đã tạo dòng, phân tích trình tự và biểu hiện gen endochitinase... chậm hơn Shapira (1991) đã tạo dòng gen chitinase từ S 14 marcescens và nhận thấy trong điều kiện nhà kính chitinase tạo ra có tác dụng kìm hãm sự phát triển của bệnh do nấm S rolfsii gây ra trên cây đậu và nấm R solani trên cây bông 1.2 TỔNG QUAN VỀ NẤM TRICHODERMA 1.2.1 Tình hình nghiên cứu nấm Trichoderma Khái niệm sử dụng nấm Trichoderma đối với nấm gây bệnh hại cây trồng có từ những năm 1930, người... loài nấm gây bệnh như Rhizotonia solani, Fusarium solani [59] Hai enzyme CHIT42 và CHIT33 từ nấm T harzianum là yếu tố cơ bản trong quá trình đối kháng với các loại nấm khác Hệ thống gen mã hóa cho chitinase từ các loài Trichoderma đã được giải mã, tạo dòng và chuyển vào cây trồng [60] Theo Jollès và Muzzarelli (1999), các loài nấm mốc như Trichoderma, Gliocladium cho hàm lượng chitinase cao Nấm Trichoderma. .. Trình tự gen pCA8 tương đồng 30% với chitinase II của Aeromonas sp mã số 10S-24 và tương đồng 29% với chitinase của Saccharopolyspora erythraea [67] 1.5 TẠO DÒNG VÀ BIỂU HIỆN GEN TRONG E coli Theo Baneyx (1999), E coli là một trong những vật chủ được sử dụng rộng rãi để biểu hiện các sản phẩm protein ngoại lai từ các sinh vật khác [17] Hiện nay việc tạo dòng và biểu hiện gen trong E coli được rất nhiều... thế giới thực hiện, Guang và cs (2004) đã tạo dòng gen B7-H3 vào vector pGEX-5X-3 và biến nạp vào E coli để nghiên cứu chức năng sinh học của protein B7-H3 trong việc hoạt hóa tế bào lympho T [28] Human betadefensin-4 (hBD4) là một protein có tác dụng chống nhiễm khuẩn ở người, Zhinan và cs (2006) đã thành công trong việc tạo dòng và biểu hiện gene này vào E coli, sử dụng vector biểu hiện pET32-smhBD4,... coli BL21 pLysS Sau khi phân tích sự biểu hiện của protein này bằng Western blot và xem khả năng gây đáp ứng miễn dịch ở chuột bằng thử nghiệm in vivo trên chuột, kết quả cho thấy lượng kháng thể thuộc loại IgG2a và IgG1 đều tăng lên, có tác dụng chống lại sự có mặt của TRX-GRA2 [52] 1.6 TẠO DÒNG VÀ BIỂU HIỆN GEN TRONG NẤM MEN Trong việc tạo dòng và biểu hiện gen vào một đối tượng khác thì vật chủ là... nghiên cứu khác tạo dòng và biểu hiện gen chitinase từ vi khuẩn sống trong môi trường nước, nhưng ở công trình này Tsujibo và cs (1993) đã phân lập gen từ vi sinh vật sống ở môi trường biển, gen chitinase của chủng Alterromonas sp mã số 0-7 đã được tạo dòng trong E coli JM109 sử dụng vector pUC18, ở nghiên cứu này enzyme không tiết trực tiếp ra môi trường nuôi cấy mà tiết vào chu chất Đoạn gen mã hóa cho... β) được tạo dòng và biểu hiện vào E coli BL21 (DE3) pLysS sử dụng vector pET-3c Protein tái tổ hợp 27 được phát hiện bằng phương pháp Western blot, sau khi phân tích hoạt tính cho thấy nó chiếm 10% protein tổng số [70] Gen gdhA mã hóa cho hexaneric glutamate dehydrogenase (GDH) của Pyrococcus furiosus được tạo dòng bằng vector pET11-d và biểu hiện vào E coli Ở hệ thống này enzyme này biểu hiện với... lại, hoặc một gen người có thể được đưa vào nhiễm sắc thể vi khuẩn [7] Mục đích việc tạo dòng và biểu hiện các gen là nhằm tạo ra các sản phẩm đúng như trong cơ thể với số lượng lớn và có giá trị thương mại Sự biểu hiện của các gen trong tế bào vi khuẩn nhiều khi gặp trở ngại, do đó cần phải thiết kế các vector biểu hiện thích hợp cho phép gen ngoại lai biểu hiện ở mức độ cao [49] Ở Việt Nam, gần đây... cứu của Rashed và cs (2010) đã biểu hiện endochitinase, cht2 của Trichoderma virens UKM1 và nấm men Pichia pastoris, gen cht2 và trình tự cDNA của nó được tạo dòng và giải trình tự, kết quả có thể gen cht2 dài 1169 bp, mã hóa cho protein dài 321 amino acid, sau đó trình tự cDNA được tạo dòng vào vector biểu hiện pPICZαC và biến nạp vào nấm men P pastoris X33 sử dụng promoter cảm ứng methanol, protein