NGHIÊN CỨU PHƯƠNG PHÁP NUÔI CẤY NOÃN CHƯA THỊ TINH TRONG ỐNG NGHIỆM ĐỂ TẠO DÒNG NGÔ ĐƠN BỘI KÉP

NGHIÊN CỨU PHƯƠNG PHÁP NUÔI CẤY NOÃN CHƯA THỊ TINH TRONG ỐNG NGHIỆM ĐỂ TẠO DÒNG NGÔ ĐƠN BỘI KÉP

Bộ Giáo dục

vμ Đμo tạo

Bộ Nông nghiệp vμ phát triển nông thôn

Viện khoa học nông nghiệp việt nam

********

Nguyễn thị khánh vân

Nghiên cứu phương pháp nuôi cấy noãn

chưa thụ tinh trong ống nghiệm để tạo

Luận án sẽ được bảo vệ trước Hội đồng chấm luận án cấp Nhμ nước

tại Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam vμo hồi giờ ngμy

tháng năm 2007

Có thể tìm hiểu luận án tại thư viện:

1 - Thư viện Quốc gia

2 - Thư viện Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam

Danh mục công trình đã công bố liên quan đến luận án

1 Nguyễn Thị Khánh Vân, Lê Huy Hμm, Lưu Mỹ Dung, Đỗ Năng Vịnh

(2003) Nghiên cứu ảnh hưởng của một số chất điều hoμ sinh trưởng vμ thμnh phần muối khoáng đến phản ứng của noãn ngô chưa thụ tinh in vitro Tạp chí

Nông nghiệp vμ Phát triển nông thôn, tháng 7-2003, trang 832 – 835

2 Nguyễn Thị Khánh Vân, Lê Huy Hμm, Lưu Mỹ Dung, Lê Thu Về, Đỗ Năng

Vịnh (2003) Nghiên cứu sử dụng phương pháp nuôi cấy noãn chưa thụ tinh

để tạo dòng thuần ở ngô Báo cáo khoa học – Hội nghị Công nghệ sinh học

toμn quốc tháng 12-2003 – Nhμ xuất bản khoa học vμ kỹ thuật, trang 840 –

845

3 Nguyễn Thị Khánh Vân, Lê Huy Hμm, Lê Thu Về, Đỗ Năng Vịnh (2004) ứng dụng kỹ thuật đơn bội trong chọn tạo giống ngô ưu thế lai Tạp chí Nông

nghiệp vμ Phát triển nông thôn, tháng 3-2004, trang 317 – 319

4 Lê Huy Hμm, Nguyễn Thị Khánh Vân, Lưu Mỹ Dung, Lê Thu Về, Đỗ Năng

Vịnh (2005) Phát triển vμ ứng dụng kỹ thuật đơn bội trong chọn tạo giống ngô ưu thế lai Hội nghị khoa học công nghệ cây trồng, tháng 3 - 2005

5 Le Huy Ham, Nguyen Thi Khanh Van and C Jampatong Haploid Technique: an approach to improve maize adaptation to marginal environment Proceedings of the International Conference on Maize Adaptation

to Marginal Environments; March 6-9, 2005 – Nakhon Ratchasima, Thailand, pages 99 – 103

6 Nguyễn Thị Khánh Vân, Lê Huy Hμm, Lưu Mỹ Dung, Đỗ Năng Vịnh (2005) Bước đầu nghiên cứu nuôi cấy noãn ngô chưa thụ tinh thông qua mô nuôi Tạp

chí Nông nghiệp vμ Phát triển nông thôn, số 18-2005, trang 20 – 22.

Mở đầu

1 Tính cấp thiết của đề tμi

Công nghệ đơn bội, đặc biệt lμ các kỹ thuật nuôi cấy bao phấn, hạt phấn tách rời vμ noãn chưa thụ tinh có ý nghĩa quan trọng đối với nghiên cứu di truyền vμ chọn tạo giống (Bajaj, 1990; Khush vμ cs, 1996) Công nghệ nμy cho phép tạo ra hμng loạt các dòng thuần đơn bội kép có khả năng cố định

ưu thế lai vμ khả năng kết hợp cao trong tạo giống ưu thế lai F1 Công nghệ nμy còn cho phép rút ngắn thời gian tạo giống vμ đơn giản hoá quá trình chọn giống Ngoμi ra, công nghệ đơn bội còn cho phép tạo ra nguồn tế bμo mô sẹo đơn bội, đơn bμo hoặc nhị bội kép có khả năng tái sinh mạnh dùng trong chuyển gen (Khush vμ cs, 1996)

ở nước ta, ngô lμ cây lương thực quan trọng thứ hai sau lúa Năng suất ngô của Việt Nam đã tăng đáng kể trong những năm qua nhờ hμng loạt các giống ngô lai năng suất cao đã được đưa vμo sản xuất Tuy vậy, năng suất ngô trung bình của nước ta còn thấp (34,9 tạ /ha - số liệu của năm 2004) Theo tinh thần QĐ 09 của Chính phủ sản lượng ngô phải đạt 5 - 6 triệu tấn trong giai đoạn 2006 - 2010, trong đó cần tăng tỷ lệ diện tích ngô lai lên 85

Thực tiễn tạo giống ngô lai ở nước ta đang đòi hỏi phải có được nguồn dòng thuần đa dạng phong phú, có khả năng kết hợp cao để sử dụng trong chương trình phát triển giống ngô lai Để đạt được mục tiêu nμy việc nghiên cứu phát triển các phương pháp mới tạo dòng thuần lμ rất cần thiết

Trên cơ sở những phân tích trên chúng tôi đã tiến hμnh thực hiện đề tμi:

“Nghiên cứu phương pháp nuôi cấy noãn chưa thụ tinh trong ống

nghiệm để tạo dòng ngô đơn bội kép”

2 Mục tiêu của đề tμi

Xây dựng quy trình công nghệ nuôi cấy trong ống nghiệm noãn chưa thụ tinh ở ngô nhằm tạo dòng đơn bội kép từ đó đề xuất quy trình tạo dòng thuần phục vụ cho công tác chọn tạo giống ngô lai ở nước ta

3 ý nghĩa khoa học vμ thực tiễn của đề tμi

ý nghĩa khoa học: Kết quả nghiên cứu của đề tμi sẽ cung cấp các dẫn

liệu khoa học có giá trị về khả năng tạo dòng đơn bội kép bằng nuôi cấy noãn chưa thụ tinh ở một số giống ngô Việt Nam Kết quả nghiên cứu lμ tμi liệu tham khảo cho việc nghiên cứu vμ giảng dạy về phương pháp tạo dòng

đơn bội kép ở ngô bằng nuôi cấy noãn chưa thụ tinh

ý nghĩa thực tiễn: Xây dựng được quy trình tạo dòng đơn bội kép ở ngô

bằng phương pháp nuôi cấy noãn chưa thụ tinh vμ ứng dụng trong việc tạo giống ngô lai

4 Đối tượng vμ phạm vi nghiên cứu của đề tμi

Đề tμi tập trung nghiên cứu ở 25 giống ngô đại diện cho 5 nhóm giống

do Viện nghiên cứu ngô vμ Trung tâm khảo kiểm nghiệm giống cây trồng cung cấp

Nội dung nghiên cứu: tập trung nghiên cứu một số yếu tố ảnh hưởng

đến nuôi cấy noãn chưa thụ tinh ở ngô, đánh giá mức độ bội thể, độ thuần

vμ một số tổ hợp lai sử dụng dòng tạo ra từ nuôi cấy noãn chưa thụ tinh

5 Những đóng góp mới của luận án

Đề tμi đã nghiên cứu khả năng tạo dòng đơn bội kép của một số giống ngô bằng phương pháp nuôi cấy noãn chưa thụ tinh trong ống nghiệm Kết quả của đề tμi lμm cơ sở khoa học cho việc hoμn thiện vμ xây dựng quy trình tạo dòng đơn bội kép ở ngô bằng phương pháp nuôi cấy noãn chưa thụ tinh trong ống nghiệm cũng như ứng dụng các dòng đơn bội kép vμo công tác chọn tạo giống ngô lai

6 Cấu trúc của luận án

Luận án được trình bμy trong 141 trang với 34 bảng số liệu vμ 31 hình Luận án đã tham khảo 129 tμi liệu trong đó có 26 tμi liệu tiếng Việt, 103 tμi liệu tiếng Anh

Chương 1 Tổng quan tμi liệu nghiên cứu

1.1 Tình hình nghiên cứu về nuôi cấy noãn ngô chưa thụ tinh trên thế giới

Hiện nay chỉ có ba tμi liệu về nuôi cấy noãn ngô đã được công bố vμo

đầu những năm 80 (Andre, 1980; Ao, 1982; Truong Andres, 1984) Các tác giả đầu tiên đã tạo mô sẹo từ noãn ngô chưa thụ tinh, sau đó tái sinh cây

thông qua mô sẹo Nghiên cứu các dòng tạo thμnh bằng phương pháp sinh học phân tử vμ quan sát trên đồng ruộng đã chứng minh rằng cây được tái sinh bằng phương pháp nμy lμ do tế bμo trứng chưa thụ tinh tự lưỡng bội hoá tạo thμnh Tuy nhiên hiệu quả của quá trình nuôi cấy còn thấp Sau những công bố đầu tiên nμy mối quan tâm của cộng đồng thế giới lại hướng tới một phương pháp tạo dòng thuần khác ở ngô - phương pháp nuôi cấy bao phấn Phương pháp nμy đã thu được những kết quả rất hứa hẹn Trong khoảng những năm 80 - 90 các nghiên cứu tập trung vμo cải tiến quy trình vμ phương pháp nuôi cấy bao phấn Trong một số trường hợp đã

đạt được nhiều kết quả khả quan Tuy vậy phương pháp nμy chưa thể được ứng dụng rộng rãi bởi tính phụ thuộc vμo giống của nuôi cấy bao phấn Vì vậy mối quan tâm lại quay trở về nuôi cấy tế bμo sinh dục cái với hy vọng phương pháp nμy có thể khắc phục được những tồn tại của kỹ thuật nuôi cấy bao phấn Gần đây các nhμ khoa học Trung Quốc đã tiến hμnh nghiên cứu nuôi cấy noãn chưa thụ tinh trên mô nuôi vμ đã thu được nhiều kết quả quan trọng Họ đã xác định được môi trường nuôi cấy cho tỷ lệ tạo hạt vμ cây cao nhất Họ cũng đã đi sâu nghiên cứu nguồn gốc của những cây tạo ra từ nuôi cấy noãn chưa thụ tinh trên mô nuôi vμ xác định những cây nμy có nguồn gốc từ túi phôi Từ đó họ đã thu được dòng đơn bội kép vμ sử dụng thμnh công trong chọn tạo giống ngô lai (Yming vμ cs, 2000)

1.2 Tình hình nghiên cứu về nuôi cấy noãn ngô chưa thụ tinh ở nước ta

Các nghiên cứu về nuôi cấy noãn chưa thụ tinh ở ngô mới chỉ được tiến hμnh ở Viện nghiên cứu ngô vμ Viện Di truyền Nông nghiệp Các kết quả ban đầu cho thấy có thể tạo dòng đơn bội kép bằng phương pháp nuôi cấy noãn chưa thụ tinh (Ngô Hữu Tình vμ cs, 1997; Khuất Hữu Trung vμ cs, 1997; Đỗ Năng Vịnh, 2002)

Kỹ thuật đơn bội có tầm quan trọng lớn trong công tác chọn tạo giống cây trồng nói chung vμ ở ngô nói riêng Kỹ thuật nμy cho phép rút ngắn thời gian tạo ra dòng thuần, từ đó rút ngắn thời gian tạo giống Trong các hướng đơn bội ngô, nuôi cấy bao phấn đã được nghiên cứu kỹ vμ có thể

đưa ra áp dụng cho chọn tạo giống Tuy vậy, việc nghiên cứu hoμn thiện các kỹ thuật khác nhằm hỗ trợ cho phương pháp nuôi cấy bao phấn lμ rất cần thiết Căn cứ vμo yêu cầu thực tiễn vμ những thμnh tựu đã đạt được trên thế giới cũng như trong nước, chúng tôi đã lựa chọn đề tμi vμ các phương pháp nghiên cứu phù hợp

Chương 2 Nội dung, vật liệu vμ phương pháp nghiên cứu

2.1 Nội dung nghiên cứu

Đề tμi nghiên cứu tập trung vμo các nội dung chính sau: Nuôi cấy noãn chưa thụ tinh tách rời; Nuôi cấy noãn chưa thụ tinh trên mô nuôi; Đánh giá mức độ bội thể vμ một số đặc điểm nông sinh học của dòng tạo ra từ nuôi cấy noãn chưa thụ tinh; Đánh giá một số đặc điểm nông sinh học của một

số tổ hợp lai sử dụng dòng tạo ra từ nuôi cấy noãn chưa thụ tinh

2.2 Vật liệu nghiên cứu

Nguồn vật liệu sử dụng cho nghiên cứu lμ 25 giống ngô thuộc các nhóm: Nhóm giống thụ phấn tự do: Q2, CV1, MSB 49; Nhóm ngô đường: VN3; Nhóm giống lai đơn: MX1, P30A38, G5460, SC98-5, 3012, 9698, LVN32, TC96-1, DK888, LVN4, LVN24, LVN25, LVN29, LVN10; Nhóm lai kép: DC98-5, DX9801, DC98-2, LVN31; Nhóm lai ba: TC5910, LVN17 Các dòng tạo ra từ nuôi cấy noãn chưa thụ tinh cũng được đưa vμo lμm vật liệu nghiên cứu, ký hiệu các dòng nμy từ G1 đến G25 Các dòng G nμy tạo ra từ mô sẹo, trực tiếp từ mô nuôi

2.3.1 Thu mẫu vμ xử lý mẫu: Các bắp được bao cách ly ngay sau khi

xuất hiện Mẫu được thu vμo các buổi sáng, khi bắp có chiều dμi râu đạt 2

- 10 cm tuỳ theo giống Sau khi thu, mẫu được xử lý lạnh ở các chế độ nhiệt vμ thời gian khác nhau tùy theo mục đích của mỗi thí nghiệm Trong một số trường hợp mẫu được sử dụng lμm thí nghiệm ngay sau khi thu

2.3.2 Môi trường vμ điều kiện nuôi cấy: Môi trường nuôi cấy được

chuẩn bị trên nền khoáng đa lượng vμ vi lượng theo công thức của môi trường MS, B5, N6, YP, bổ sung các vitamin, các chất điều hoμ sinh trưởng, đường, phụ gia hữu cơ, thạch khác nhau tuỳ theo mục đích của mỗi

thí nghiệm

Mẫu sau cấy được nuôi tối ở nhiệt độ 250C trong 10 ngμy, sau đó chuyển ra nuôi trong điều kiện chiếu sáng 8 giờ/ ngμy

2.3.3 Tạo cây hoμn chỉnh: Cây sau khi tái sinh từ mô sẹo được cấy vμo

môi trường tạo rễ: RN (MS/2 + 6g/l thạch + 30 g/l đường + (0 - 3) mg/l NAA) để tạo cây hoμn chỉnh Hạt tạo ra từ nuôi cấy mô nuôi được tách khỏi bắp vμ cấy vμo môi trường MS/2 + 6g/l thạch + 30 g/l đường

α-2.3.4 Xác định mức bội thể của cây tái sinh từ noãn chưa thụ tinh

2.3.4.1 Kỹ thuật tế bμo học xác định số lượng nhiễm sắc thể vμ mức bội thể của cây ngô tạo ra từ nuôi cấy noãn chưa thụ tinh Các bước xác định

số lượng nhiễm sắc thể vμ mức bội thể được tiến hμnh theo phương pháp

của B Kindiger, 1994

2.3.4.2 Kiểm tra độ bội thể bằng máy đo độ bội thể (Flow Cytometry) Các

bước xác định mức bội thể của cây tái sinh từ nuôi cấy noãn chưa thụ tinh

được tiến hμnh theo phương pháp của Laat vμ cs, (1987)

2.3.5 Đánh giá một số đặc tính nông sinh học của các dòng tạo thμnh

từ nuôi cấy noãn chưa thụ tinh: Khảo sát đánh giá một số đặc tính nông

sinh học của dòng tạo ra từ nuôi cấy noãn chưa thụ tinh trên đồng ruộng (theo 10TCN)

Số liệu được xử lý bằng các phương pháp thống kê, sử dụng chương trình Excel 5.0 vμ biện luận kết quả theo Nguyễn Đình Hiền, 1998; Chu Văn Mẫn, 2003

Chương 3 kết quả vμ thảo luận

3.1 Nuôi cấy noãn chưa thụ tinh tách rời

3.1.1 Nghiên cứu phản ứng của noãn ngô chưa thụ tinh trên các môi trường nuôi cấy khác nhau

12 môi trường nuôi cấy khác nhau chia lμm 3 nhóm bao gồm:

- Nhóm 1: bao gồm các môi trường khoáng MS, B5, N6, YP bổ sung 2mg/l 2,4D, 2 mg/l BAP vμ 5 mg/l adenin sulphat (công thức 1, 2, 3, 4)

- Nhóm 2: bao gồm các môi trường khoáng MS, B5, N6, YP bổ sung 0,5mg/l α-NAA, 2 mg/l kinetin (công thức 5, 6, 7, 8)

- Nhóm 3: bao gồm các môi trường khoáng MS, B5, N6, YP bổ sung các axit amin (công thức 9, 10, 11,12)

Quan sát sự phát sinh hình thái cho thấy phản ứng của noãn trong môi trường nuôi cấy gồm 3 dạng chính: Phản ứng tạo cấu trúc tương tự mô sẹo (callus like structure = CS): hạt có cấu trúc giống như mô sẹo, mμu trắng trong hoặc hơi vμng, xốp mềm Tiến hμnh giải phẫu cấu trúc tương tự mô sẹo nμy vμ cấy chuyển vμo môi trường mới chúng có khả năng hình thμnh mô sẹo vμ tái sinh thμnh cây Phản ứng tạo mô sẹo: trên môi trường nuôi cấy một số hạt tạo mô sẹo Phản ứng tạo cây trực tiếp: sau 4- 5 tuần nuôi cấy ở một số ít noãn hình thμnh cây Kết quả quan sát phản ứng tạo CS của noãn trong môi trường nuôi cấy được thể hiện ở bảng 3.3

Bảng 3.3 ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến tỷ lệ tạo cấu trúc

tương tự callus của noãn chưa thụ tinh (tính theo %)

Công thức môi trường Nhóm

Ghi chú: TB1: giá trị trung bình tỷ lệ tạo CS của 1 giống ở 12 công thức môi trường

TB2: giá trị trung bình tỷ lệ tạo CS của các giống ở 12 công thức môi trường thuộc

cùng một nhóm (thụ phấn tự do, đường, lai đơn, lai kép, lai ba) TB3: giá trị trung bình

tỷ lệ tạo CS của các giống trong cùng một môi trường nuôi cấy TB4: giá trị trung bình tỷ lệ tạo CS của các giống ở cùng một nhóm môi trường (nhóm bổ sung 2,4D+BAP+adenin sulphat; nhóm bổ sung kinetin, α-NAA vμ nhóm bổ sung các axit amin)

Kết quả bảng 3.3 cho thấy trên các môi trường nuôi cấy khác nhau, tỷ

lệ tạo CS rất khác nhau Xét ảnh hưởng của các chất điều hoμ sinh trưởng

Xét phản ứng của các giống trên môi trường nuôi cấy: ở 25 giống

được nghiên cứu về phản ứng của noãn chưa thụ tinh trên các môi trường nuôi cấy trong ống nghiệm, hầu hết đều tạo CS (100%) tuy nhiên tỷ lệ tạo

CS ở các giống, các nhóm giống có sự khác nhau đáng kể Các giống thuộc nhóm thụ phấn tự do có tỷ lệ tạo CS thấp nhất (7,2%), tỷ lệ CS cao nhất thu

được ở các giống thuộc nhóm lai đơn (16,5%) Như vậy, trong cùng điều kiện nuôi cấy như nhau mức phản ứng tạo CS của các giống khác nhau lμ khác nhau

Ngoμi phản ứng tạo CS, trên các môi trường l, 2, 3, 4 có thμnh phần muối khoáng MS, B5, N6, YP bổ sung: 2mg/l 2,4D, 2 mg/l BAP, 5 mg/l adenin sulphat, các noãn còn tạo mô sẹo Kết quả được trình bμy ở bảng 3.5

Bảng 3.5 ảnh hưởng của môi trường vμ giống đến tỷ lệ (%) tạo mô sẹo

trong nuôi cấy noãn chưa thụ tinh

Công thức môi trường

Q2 0,80 0,40 0,00 0,00 0,30 CV1 0,47 0,00 0,23 0,00 0,18

Trong số 25 giống thí nghiệm, 17 giống thuộc cả 5 nhóm giống có phản ứng tạo mô sẹo với tỷ lệ dao động từ 0,18% (giống CV1) đến 1,6% giống LVN29 Tỷ lệ tạo mô sẹo của nhóm giống ngô thụ phấn tự do đạt thấp nhất (0,26%) Nhóm giống ngô lai kép có phản ứng tạo mô sẹo cao nhất (0,69%) Với cùng thμnh phần chất điều hoμ sinh trưởng, trên các môi trường khoáng khác nhau, tỷ lệ tạo mô sẹo cũng không có sự khác nhau

đáng kể (0,66; 0,58; 0,5; 0,54%) ứng với các thμnh phần khoáng MS, B5, N6, YP

*Phản ứng tạo cây trực tiếp: Ngoμi phản ứng tạo CS vμ mô sẹo, các

noãn chưa thụ tinh còn hình thμnh cây trực tiếp Kết quả thí nghiệm cho thấy khi nuôi cấy noãn chưa thụ tinh, cây tái sinh trực tiếp từ mẫu nuôi cấy

có tỷ lệ rất thấp (từ 0,07 đến 0,13%), chỉ có 5 giống thuộc 4 nhóm giống ngô thụ phấn tự do, ngô đường, lai đơn vμ lai ba có phản ứng nμy

Từ các kết quả nghiên cứu trên có thể đi đến kết luận rằng:

- Phản ứng của noãn ngô chưa thụ tinh trong môi trường nuôi cấy có 3 kiểu phát sinh hình thái: tạo cây trực tiếp, tạo mô sẹo vμ tạo CS

- Kỹ thuật nuôi cấy noãn chưa thụ tinh có tính phụ thuộc vμo giống, nhóm giống

- Trên các môi trường nuôi cấy khác nhau, phản ứng nuôi cấy noãn chưa thụ tinh rất khác nhau Môi trường nuôi cấy cho tỷ lệ tạo CS, mô sẹo

vμ tái sinh cây trực tiếp cao nhất lμ môi trường khoáng MS bổ sung 2 mg/l 2,4D, 2 mg/l BAP vμ 5 mg/l adenin sulphat

3.1.2 Nhân mô sẹo từ cấu trúc tương tự mô sẹo vμ tái sinh cây

Để nâng cao hiệu quả tái sinh cây từ CS vμ mô sẹo tạo ra từ các thí nghiệm trên, chúng tôi sử dụng môi trường khoáng MS bổ sung 60 g/l

đường, 15 mg/l L- asparagine, 125 mg/l L- glutamine vμ các chất điều hoμ sinh trưởng khác nhau Kết quả được trình bμy ở bảng 3.8

Bảng 3.8 ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến tỷ lệ (%) tạo

mô sẹo vμ tái sinh cây

Trong đó môi trường tạo mô sẹo có thμnh phần như trên bổ sung 2,4D ở các nồng độ khác nhau (0,5 - 3 mg/l) phối hợp với 0,5 mg/l kinetin (ký hiệu: A1 - A5) Môi trường tái sinh bổ sung 2 mg/l BAP với tổ hợp α-NAA nồng độ thay đổi (0,5 - 2 mg/l) (ký hiệu: A6 - A10)

Kết quả bảng 3.8 cho thấy trong số các môi trường đã nghiên cứu môi trường A5 lμ môi trường bổ sung 2 mg/l 2,4D, 0,5 mg/l kinetin, 15% nước dừa tốt hơn cả để tạo vμ nhân mô sẹo, môi trường A6 lμ môi trường MS bổ sung 2 mg/l kinetin, 0,5 mg/l dicamba tốt cho việc tái sinh cây Cây tái sinh từ mô sẹo hầu như không có rễ, nên khi cây có l - 2 lá thật, cần chuyển những cây nμy sang môi trường tạo rễ có thμnh phần khoáng MS/2

bổ sung 1mg/l α-NAA Trên môi trường nμy cây có độ dμi rễ vừa phải vμ

số rễ trung bình/ cây thích hợp cho việc đưa cây ra đất

Khi nuôi cấy noãn tách rời, cây được hình thμnh theo hai con đường: hoặc tái sinh trực tiếp từ mẫu nuôi cấy, hoặc tái sinh qua mô sẹo, EC Trong tổng số 25 giống tiến hμnh thí nghiệm, 5 giống có phản ứng tạo cây trực tiếp; 17 giống có phản ứng tạo mô sẹo với tỷ lệ: 0,2 - 3%; 6 giống có phản ứng tạo mô sẹo, tái sinh cây từ CS vμ hiệu quả tái sinh từ mô sẹo thấp Nhiều cây tái sinh từ mô sẹo có hình thái không bình thường: lá cuộn tròn không mở, giòn, dễ gãy, thân xốp, bộ rễ phát triển mạnh, không cân đối với

sự phát triển của thân lá Tổng hợp các kết quả nghiên cứu nuôi cấy noãn chưa thụ tinh tách rời được trình bμy trên bảng 3.10

Bảng 3.10 Tổng hợp kết quả nuôi cấy noãn chưa thụ tinh kiểu tách rời

tỷ lệ 22,2%

Kết quả ở bảng 3.10 vμ những nghiên cứu nuôi cấy noãn tách rời cho thấy quy trình nuôi cấy noãn tách rời khá phức tạp, hiệu quả nuôi cấy không cao thể hiện ở các chỉ số tỷ lệ cây tái sinh, cây sống vμ cây phát

triển bình thường đều thấp Vì thế, chúng tôi tiếp tục nghiên cứu phương pháp nuôi cấy khác để tạo dòng ngô đơn bội kép, đó lμ phương pháp nuôi cấy noãn chưa thụ tinh trên mô nuôi

3.2 Tạo hạt đơn bội từ nuôi cấy noãn chưa thụ tinh trên mô nuôi

Mô nuôi lμ mô của thịt bắp được đưa vμo môi trường nuôi cấy cùng với noãn mμ không có sự phân tách Dinh dưỡng từ môi trường sẽ được noãn hấp thu thông qua mô nuôi Trong trường hợp nμy tác dụng của các thμnh phần môi trường lên noãn phần lớn sẽ xảy ra thông qua mô nuôi Do vậy, môi trường nuôi cấy cũng như các tác động vật lý như xử lý nhiệt độ lạnh trước hoặc sau nuôi cấy lμ một trong những yếu tố quan trọng ảnh hưởng

đến quá trình hình thμnh cây vμ hạt đơn bội trong nuôi cấy noãn chưa thụ

tinh trên mô nuôi

3.2.1 ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến phản ứng tạo hạt

3.2.1.1 ảnh hưởng của một số chất điều hoμ sinh trưởng đến khả năng hình thμnh hạt trong ống nghiệm

Môi trường nuôi cấy được sử dụng lμ môi trường khoáng N6 bổ sung các chất điều hoμ sinh trưởng: 2,4D, BAP, kinetin, dicamba Kết quả thí nghiệm được trình bμy ở bảng 3.11a vμ 3.11b

Bảng 3.11a ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến tỷ lệ tạo cấu trúc tương tự mô sẹo (nuôi cấy noãn trên mô nuôi) (tính theo %)