NGHIÊN cứu tạo DÒNG NGÔ đơn bội kép (DH) BẰNG PHƯƠNG PHÁP IN VIVO

Họ c viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 1 MỞ ĐẦU 1 Tính cấp thiết của đề tài Ngô (Zea mays L.) là một trong năm loại cây ngũ cốc quan trọng và là cây trồng có tiềm năng năng suất cao. Trên thế giới, ngô được xếp hàng thứ 2 về diện tích sản xuất và đứng thứ nhất về năng suất cũng như sản lượng cây trồng lấy hạt. Tại Việt Nam, ngô là cây lương thực đứng vị trí thứ hai sau cây lúa và có khả năng thích ứng rộng với nhiều vùng sinh thái khác nhau. Trong hạt ngô còn chứa hàm lượng dinh dưỡng cao đặc biệt như tinh bột, các axit amin không thay thế (Leusin, Isoleusin, Tyrosin, Threonin, Lyzin....) Những năm gần đây, nhu cầu sử dụng ngô cho công nghiệp thực phẩm và chế biến ngày càng tăng, đặc biệt là trong công nghiệp chế biến thức ăn chăn nuôi. Tuy nhiên, công tác sản xuất ngô chưa đáp ứng được nhu cầu tiêu thụ của cả nước. Một phần hạn chế là do năng suất, chất lượng ngô giống thấp và sâu bệnh hại. Để tạo được các giống ngô lai có năng suất cao, ổn định và thích nghi với các vùng sinh thái khác nhau thì yêu cầu số một phải là có bố mẹ có độ đồng hợp tử cao, khả năng kết hợp cao thể hiện ưu thế lai cao. Tuy nhiên theo phương pháp truyền thống thường đòi hỏi từ 68 thế hệ tự thụ để thu được mức đồng hợp tử mong muốn (Michael Morris và cs, 2003). Việc này yêu cầu một quá trình chọn tạo lâu dài và tốn kém. Hiện nay, nhờ những tiến bộ của khoa học kỹ thuật đặc biệt là công nghệ sinh học và di truyền phân tử, công tác chọn tạo dòng đơn bội kép có độ thuần cao trong thời gian rất ngắn (chỉ còn 1 thế hệ) (Lê Huy Hàm và cs, 2005). Trong khi, phương pháp nuôi cấy tạo dòng đơn bội kép in vitro nuôi cấy bao phấn, nuôi cấy noãn chưa thụ tinh không đạt được những kết quả khả quan. Thì việc tạo dòng đơn bội kép in vivo đã được chứng minh có hiệu quả cao hơn; các công trình nghiên cứu tạo dòng đơn bội kép nhờ sử dụng dòng kích tạo đơn bội và đa bội hóa bằng colchicines được công bố là cho các dòng đơn bội hoàn toàn. Chase (1952) nghiên cứu sự tự đơn bội ở nguồn gen ngô CornBelt của Mỹ cho thấy tỷ lệ cây đơn bội trong tự nhiên là 0,1%; một tỷ lệ quá thấp để áp dụng trong thương mại. Sau đó Coe (1959) tìm thấy dòng thuần gọi là Stock6 với tỷ lệ kích tạo 1 2%. Đây

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

HÀ NỘI – 2014

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan:

- Luận văn này là công trình nghiên cứu của tôi;

- Số liệu sử dụng trong luận văn được là trung thực;

- Thông tin trích dẫn trong luận văn đều đã được chỉ rõ nguồn gốc và có

độ chính xác cao nhất trong phạm vi hiểu biết của tôi

Hà Nội, ngày 22 tháng 12 năm 2014

Tác giả luận văn

Học viên

Nguyễn Thị Thu Hà

LỜI CẢM ƠN

Trước tiên, cho tôi xin được gửi lời cảm ơn chân thành đến tất cả quý thầy cô

giảng dạy và công tác tại Ban quản lý Đào tạo, Viện Nghiên cứu và phát triển cây

trồng, Bộ môn Sinh học, Khoa Công nghệ sinh học, Trường Đại học Nông nghiệp Hà

Nội đã luôn quan tâm, tạo điều kiện giúp đỡ và ủng hộ tôi trong quá trình học tập và

hoàn thành luận văn tốt nghiệp của mình

Để hoàn thành luận văn tốt nghiệp này, cho phép tôi được bày tỏ lòng biết ơn

và kính trọng sâu sắc tới TS Đồng Huy Giới – Phó trưởng khoa CNSH, Trưởng

bộ môn Sinh học – Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội; PGS.TS Vũ Văn Liết

– Giám đốc Viện Nghiên cứu và phát triển cây trồng đã tận tình hướng dẫn, chỉ

bảo, giúp đỡ và tạo điều kiện tốt nhất cho tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài,

đánh giá kết quả và hoàn thành luận văn đồng thời bồi dưỡng cho tôi những kiến

thức chuyên môn và kinh nghiệm quý báu

Với tình cảm sâu sắc, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới Ban lãnh đạo, Cán

bộ công nhân viên trong Bộ môn Sinh học - Khoa Công nghệ sinh học, Bộ môn

Cây trồng cạn - Viện Nghiên cứu và phát triển cây trồng, đặc biệt ThS Phạm

Quang Tuân và sinh viên Vũ Thị Quế đã tận tình giúp đỡ và tạo điều kiện cho tôi

trong suốt quá trình thực tập

Cuối cùng, tôi cũng xin gửi lời cảm ơn chân thành nhất đến toàn thể gia đình,

bạn bè, anh em, đồng nghiệp đã tạo mọi điều kiện thuận lợi và giúp đỡ tôi về mọi

mặt, động viên khuyến khích tôi hoàn thành luận văn này!

Hà Nội, ngày 22 tháng 12 năm 2014

Học viên

Nguyễn Thị Thu Hà

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN i

LỜI CẢM ƠN ii

MỤC LỤC iii

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT vi

DANH MỤC BẢNG vii

DANH MỤC HÌNH ix

MỞ ĐẦU 1

1 Tính cấp thiết của đề tài 1

2 Mục tiêu nghiên cứu 2

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Vai trò của cây ngô trong nền kinh tế 3

1.2 Tình hình sản xuất và sử dụng ngô trên thế giới và trong nước 4

1.2.1 Tình hình sản xuất và sử dụng ngô trên thế giới 4

1.2.2 Tình hình sản xuất và sử dụng ngô trong nước 7

1.3 Hiện tượng ưu thế lai và ứng dụng trong chọn tạo giống ngô 9

1.3.1 Hiện tượng ưu thế lai 9

1.3.2 Ý nghĩa của ưu thế lai 9

1.3.3 Cơ sở di truyền của ưu thế lai 9

1.3.4 Ưu thế lai - lịch sử nghiên cứu và ứng dụng trong chọn tạo giống ngô 11

1.4 Dòng thuần và những nghiên cứu phát triển dòng thuần 12

1.4.1 Dòng thuần 12

1.4.2 Những nghiên cứu phát triển dòng thuần ở ngô 12

Chương 2 VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 24

2.1 Vật liệu nghiên cứu 24

2.2 Nội dung nghiên cứu 25

2.3 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 25

2.3.1 Thời gian nghiên cứu: 25

2.3.2 Địa điểm nghiên cứu: 25

2.4 Phương pháp nghiên cứu 26

2.4.1 Thí nghiệm 1: Đánh giá đặc điểm nông sinh học, chống chịu và năng suất của dòng UH400 trong điều kiện trồng tại Gia Lâm - Hà Nội 26

2.4.2 Thí nghiệm 2: Lai và xác định tỷ lệ kích tạo đơn bội 28

2.4.3 Thí nghiệm 3: Đa bội hóa bằng Colchicine với tất cả các hạt được cho là đơn bội (Hạt có màu ở nội nhũ và phôi không màu) 29

2.4.4 Thí nghiệm 4: Đánh giá đặc điểm nông sinh học, khả năng chống chịu và năng suất của các dòng đơn bội kép trong điều kiện vụ Xuân 2014 tại Gia Lâm, Hà Nội 31

2.5 Phương pháp tính và xử lý số liệu 31

Chương 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 32

3.1 Đánh giá đặc điểm nông sinh học, khả năng chống chịu và năng suất của dòng kích tạo đơn bội UH400 trong điều kiện vụ xuân 2013 tại Gia Lâm, Hà Nội 32

3.1.1 Tỷ lệ nảy mầm và các giai đoạn sinh trưởng của dòng kích tạo đơn bội UH400 32

3.1.2 Đặc điểm nông sinh học 34

3.1.3 Khả năng chống chịu đồng ruộng 37

3.1.4 Các chỉ tiêu về năng suất 38

3.2 Đặc điểm của các dòng ngô dùng làm mẹ và khả năng kích tạo đơn bội của dòng UH400 39

3.2.1 Đặc điểm nông sinh học của các dòng mẹ tự phối 39

3.2.2 Đánh giá khả năng kích tạo đơn bội của dòng UH400 trên các dòng mẹ 45

3.3 Tạo dòng đơn bội kép bằng colchicine 50

3.4 Đánh giá đặc điểm nông sinh học, khả năng chống chịu và năng suất của các dòng đơn bội kép trong điều kiện vụ Xuân 2014 tại Gia Lâm, Hà Nội 58

3.4.1 Tỷ lệ nảy mầm và các giai đoạn sinh trưởng của các dòng đơn bội kép 58

3.4.2 Đặc điểm nông sinh học của các dòng đơn bội kép 59

3.4.3 Khả năng chống chịu đồng ruộng của các dòng ngô đơn bội kép trong

điều kiện vụ Xuân 2014 tại Gia Lâm, Hà Nội 62

3.4.4 Các chỉ tiêu về năng suất của các dòng đơn bội kép trong điều kiện trồng vụ Xuân 2014 tại Gia Lâm, Hà Nội 64

KẾT LUẬN 66

1 Kết luận 66

2 Đề nghị 66

TÀI LIỆU THAM KHẢO 67

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

2 CHLB Cộng hòa liên bang

3 CIMMYT Trung tâm cải tiến giống ngô và lúa mì Quốc tế

9 FAO Tổ chức lương thực và nông nghiệp liên hiệp quốc

10 G-PR Thời gian từ gieo đến phun râu

11 G-TP Thời gian từ gieo đến tung phấn

12 KNKH Khả năng kết hợp

13 NN&PTNT Nông nghiệp và phát triển nông thôn

14 NSLT Năng suất lý thuyết

15 P100 Trọng lượng 100 hạt

17 TCN Tiêu chuẩn ngành

18 TGST Thời gian sinh trưởng

19 TL CĐB/CC Tỷ lệ cao đóng bắp/cao cây

20 TP-PR Khoảng cách tung phấn – phun râu

DANH MỤC BẢNG

1.1 Thành phần hóa học của hạt ngô so với gạo phân tích trên 100g 3

1.2 Diện tích, năng suất, sản lượng sản xuất ngô một số năm trên thế giới 5

1.3 Diện tích, năng suất và sản lượng của 3 cây lương thực chính (ngô, lúa

nước, lúa mỳ) trên thế giới năm 2013 5

1.4 Phân bố diện tích, năng suất và sản lượng ngô theo vùng năm 2013 6

1.5 Một số dòng kích tạo đơn bội và tỉ lệ kích tạo đơn bội của chúng 19

2.1 Nguồn gốc và một số đặc điểm đặc trưng của dòng kích tạo đơn bội

UH400 24

2.2 Nguồn gốc vật liệu ngô dùng làm dòng mẹ trong thí nghiệm 24

3.1 Tỷ lệ nảy mầm và thời gian sinh trưởng của dòng kích tạo đơn bội

UH400 trong điều kiện trồng tại Gia Lâm, Hà Nội 33

3.2 Một số đặc điểm nông sinh học của dòng kích tạo đơn bội UH400 35

3.3 Khả năng chống đổ và mức độ nhiễm sâu bệnh hại của dòng kích tạo

đơn bội UH400 trong điều kiện vụ Xuân tại Gia Lâm, Hà Nội 37

3.4 Năng suất và các yếu tố cấu thành năng suất của dòng kích tạo UH400

trong điều kiện vụ Xuân tại Ga Lâm - Hà Nội 38

3.5: Tỉ lệ mọc và thời gian qua các giai đoạn sinh trưởng của các dòng ngô

tự phối dùng làm dòng mẹ trong điều kiện vụ Xuân năm 2013 tại Gia

Lâm, Hà Nội 40

3.6: Đặc điểm nông sinh học của các dòng ngô tự phối dùng làm dòng mẹ

trong điều kiện vụ Xuân năm 2013 tại Gia Lâm, Hà Nội 42

3.7 Khả năng chống chịu sâu bệnh hại của các dòng ngô tự phối dùng làm

dòng mẹ trong vụ Xuân năm 2013 tại Gia Lâm, Hà Nội 44

3.8 Tỉ lệ kích tạo đơn bội của UH400 với các dòng mẹ tự phối 46

3.9 Đánh giá khả năng kết hợp của các dòng mẹ tự thụ với dòng bố kích

tạo đơn bội UH400 49

3.10 Tỷ lệ nảy mầm và khả năng tạo đơn bội kép sau xử lý với colchicine hạt đơn bội của các phép lai kích tạo 513.11 Tỷ lệ nảy mầm và thời gian sinh trưởng của các dòng đơn bội kép trong điều kiện trồng tại Gia Lâm, Hà Nội 583.12 Một số đặc điểm nông sinh học của các dòng đơn bội kép trong điều kiện vụ Xuân 2014 tại Gia Lâm, Hà Nội 603.13 Mức độ nhiễm sâu bệnh hại của các dòng đơn bội kép trong điều kiện

vụ Xuân 2014 tại Ga Lâm - Hà Nội 623.14 Năng suất và các yếu tố cấu thành năng suất của các dòng đơn bội kép trong điều kiện vụ Xuân 2014 tại Gia Lâm, Hà Nội 64

DANH MỤC HÌNH

1.1 Nhận biết hạt đơn bội thông qua chỉ thị hình thái 21

3.1 Hình thái hạt dòng CUA sau khi kích tạo đơn bội với dòng UH400 47

3.2 Hình thái hạt của dòng D56 sau khi kích tạo đơn bội với dòng UH400 (ký hiệu là trong thí nghiệm là UA) 47

3.3 Hình thái phôi và nội nhũ hạt của 3 dạng hạt sau khi kích tạo đơn bội với dòng UH400 47

3.4 Tủ thúc nảy mầm hạt đơn bội 52

3.5 Hạt nảy mầm 52

3.6 Cắt đỉnh mầm để xử lý Colchicine 52

3.7 Chuẩn bị xử lý colchicine 52

3.8 Rửa hạt bằng nước sạch 52

3.9 Hạt đơn bi sau khi được xử lý colchicine được trồng ra khay ươm trong nhà lưới 53

3.10 Cây sống sau khi xử lý colchicine 53

3.11 Cây chết sau khi xử lý cochicine 53

3.12 Cây đơn bội kép giai đoạn từ 5-7 lá 53

3.13 Cây đơn bội và cây đơn bội kép sau khi xử lý Colchicine được đưa ra ngoài đồng ruộng 56

3.14 Ruộng thí nghiệm cây sau khi đã xử lý colchicine 56

3.15 Cây đơn bội sau khi xử lý cochicine 56

3.16 Cây đơn bội kép sau xử lý colchicine 56

3.17 Bông cờ hữu dục của cây đơn bội kép 56

3.18 Cây đơn bội và cây đơn bội kép ở giai đoạn trổ bông 56

3.19 Bông cờ tung phấn của cây đơn bội kép sau khi xử lý colchicine 57

3.20 Bông cờ bất dục của dòng đơn bội sau khi xử lý colchicine 57

3.21 Các dòng ngô đơn bội kép giai đoạn 7-9 lá thật 61

MỞ ĐẦU

1 Tính cấp thiết của đề tài

Ngô (Zea mays L.) là một trong năm loại cây ngũ cốc quan trọng và là cây

trồng có tiềm năng năng suất cao Trên thế giới, ngô được xếp hàng thứ 2 về diện tích sản xuất và đứng thứ nhất về năng suất cũng như sản lượng cây trồng lấy hạt Tại Việt Nam, ngô là cây lương thực đứng vị trí thứ hai sau cây lúa và có khả năng thích ứng rộng với nhiều vùng sinh thái khác nhau Trong hạt ngô còn chứa hàm lượng dinh dưỡng cao đặc biệt như tinh bột, các axit amin không thay thế (Leusin, Isoleusin, Tyrosin, Threonin, Lyzin )

Những năm gần đây, nhu cầu sử dụng ngô cho công nghiệp thực phẩm và chế biến ngày càng tăng, đặc biệt là trong công nghiệp chế biến thức ăn chăn nuôi Tuy nhiên, công tác sản xuất ngô chưa đáp ứng được nhu cầu tiêu thụ của cả nước Một phần hạn chế là do năng suất, chất lượng ngô giống thấp và sâu bệnh hại

Để tạo được các giống ngô lai có năng suất cao, ổn định và thích nghi với các vùng sinh thái khác nhau thì yêu cầu số một phải là có bố mẹ có độ đồng hợp tử cao, khả năng kết hợp cao thể hiện ưu thế lai cao Tuy nhiên theo phương pháp truyền thống thường đòi hỏi từ 6-8 thế hệ tự thụ để thu được mức đồng hợp tử mong muốn (Michael Morris và cs, 2003) Việc này yêu cầu một quá trình chọn tạo lâu dài và tốn kém Hiện nay, nhờ những tiến bộ của khoa học kỹ thuật đặc biệt là công nghệ sinh học và di truyền phân tử, công tác chọn tạo dòng đơn bội kép có độ thuần cao trong thời gian rất ngắn (chỉ còn 1 thế hệ) (Lê Huy Hàm và cs, 2005)

Trong khi, phương pháp nuôi cấy tạo dòng đơn bội kép in vitro nuôi cấy bao

phấn, nuôi cấy noãn chưa thụ tinh không đạt được những kết quả khả quan Thì việc

tạo dòng đơn bội kép in vivo đã được chứng minh có hiệu quả cao hơn; các công

trình nghiên cứu tạo dòng đơn bội kép nhờ sử dụng dòng kích tạo đơn bội và đa bội hóa bằng colchicines được công bố là cho các dòng đơn bội hoàn toàn Chase (1952) nghiên cứu sự tự đơn bội ở nguồn gen ngô Corn-Belt của Mỹ cho thấy tỷ lệ cây đơn bội trong tự nhiên là 0,1%; một tỷ lệ quá thấp để áp dụng trong thương mại Sau đó Coe (1959) tìm thấy dòng thuần gọi là Stock6 với tỷ lệ kích tạo 1 - 2% Đây

là dòng kích tạo đơn bội tổ tiên của các dòng kích tạo phát triển sau này Một số dòng kích tạo hiệu quả hiện nay là RWS và UH400 do Đại học Hohenheim phát triển (Rober và cs., 2005) Đây là dòng lai thích nghi với khí hậu ôn đới của Châu

Âu nhưng cũng thích hợp với môi trường nhiệt đới (Rober và cs, 2005; Geiger và

cs, 2009; Ming-Tang Chang, Edward H Coe Jr, 2009)

Năm 2012, trường Đại học Hohenheim (CHLB Đức) đã cung cấp cho Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội (nay là Học Viện Nông Nghiệp Việt Nam) cây kích tạo đơn bội UH400 sử dụng để phát triển dòng ngô đơn bội kép Từ những

thực tiễn trên, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Nghiên cứu tạo dòng ngô đơn bội kép (DH) bằng phương pháp In vivo”

2 Mục tiêu nghiên cứu

+ Tạo dòng đơn bội kép (DH) bằng colchicine và đánh khả năng sinh trưởng, phát triển của các dòng đơn bội kép (DH) mới chọn tạo

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

Cây ngô (Zea mays L.) thuộc chi Zea, họ Hòa thảo (Poaceae), bộ Hòa thảo

(Poales), lớp một lá mầm (Monocots) và có bộ nhiễm sắc thể 2n = 20 Cây ngô là cây hàng năm với hệ thống rễ chùm phát triển, là loài cây giao phấn có hoa đơn tính cùng gốc

1.1 Vai trò của cây ngô trong nền kinh tế

Trên thế giới, ngô là một trong những cây ngũ cốc quan trọng, ngô đứng hàng thứ 2 về diện tích sản xuất và đứng thứ nhất về năng suất cũng như sản lượng cây trồng lấy hạt Các quốc gia đứng đầu về diện tích gieo trồng và sản lượng ngô trên thế giới là Mỹ, Trung Quốc và Braxin

Tại Việt Nam, ngô là cây lương thực quan trọng thứ hai sau cây lúa và là cây màu quan trọng nhất được trồng ở nhiều vùng sinh thái khác nhau, đa dạng về mùa

vụ gieo trồng và hệ thống canh tác Cây ngô không chỉ cung cấp lương thực, thực phẩm cho con người, ngoài ra tất cả các bộ phận của cây ngô từ hạt đến thân lá đều

có thể sử dụng để làm thức ăn cho gia súc, gia cầm; làm nguyên liệu cho ngành công nghiệp (rượu ngô, sản xuất ethanol để chế biến xăng sinh học…) Đặc biệt, ngô còn là cây trồng xóa đói giảm nghèo tại các tỉnh có điều kiện kinh tế khó khăn

- Ngô làm lương thực cho con người: Ngô là cây lương thực nuôi sống gần 1/3 số dân trên toàn thế giới Toàn thế giới sử dụng 21% sản lượng ngô làm lương thực Chất dinh dưỡng trong ngô phong phú hơn lúa mì và gạo (bảng 1.1)

Bảng 1.1 Thành phần hóa học của hạt ngô so với gạo phân tích trên 100g

Thành phần hóa học Gạo trắng Ngô vàng

Tinh bột (g) Chất đạm (g) Chất béo (g) Vitamin A (mg) Vitamin B1 (mg) Vitamin B2 (mg) Vitamin C (mg) Năng lượng (calo)

65.00 8.00 2.50 0.00 0.20 0.00 0.00

340

68.2 9.60 5.20 0.03 0.28 0.08 7.70

350

- Ngô làm thực phẩm: Các sản phẩm từ ngô như ngô bao tử, hạt ngô non được sử dụng như một loại thực phẩm cao cấp, chúng rất được ưa chuộng do hàm lượng dinh dưỡng cao, chế biến đơn giản và có độ an toàn cao Ngoài ra, ngô còn được sử dụng để ăn tươi (như luộc, nướng) hoặc có thể sử dụng làm thực phẩm đóng hộp thuận tiện cho bảo quản và xuất khẩu

- Ngô làm thức ăn gia súc: Hạt ngô là nguồn thức ăn giàu dinh dưỡng đối với động vật Thành phần chất tinh trong thức ăn tổng hợp có nguồn gốc từ ngô chiếm đến 70% Ngoài cung cấp chất tinh, thân lá cây ngô còn là thức ăn xanh và ủ chua lý tưởng cho đại gia súc, đặc biệt là bò sữa

- Ngô cung cấp nguyên liệu cho công nghiệp: Ngoài cung cấp nguyên liệu chính cho các nhà máy thức ăn gia súc tổng hợp, ngô còn là nguyên liệu cho các nhà máy sản xuất rượu cồn, tinh bột, dầu, glucose, bánh kẹo…

- Ngô là nguồn hàng hóa xuất khẩu: Ngô là nguồn hàng hóa xuất khẩu có giá trị kinh tế lớn Trên thế giới, hàng năm lượng ngô được xuất khẩu đạt trên 70 triệu tấn Đây có thể được coi là một nguồn lợi cho các quốc gia xuất khẩu ngô như Mỹ, Pháp, Trung Quốc, Thái Lan…

1.2 Tình hình sản xuất và sử dụng ngô trên thế giới và trong nước

1.2.1 Tình hình sản xuất và sử dụng ngô trên thế giới

Ngành sản xuất ngô thế giới tăng liên tục từ đầu thế kỷ 20 đến nay, nhất là trong hơn 40 năm trở lại đây, ngô là cây trồng có tốc độ tăng trưởng về năng suất cao nhất trong các cây lương thực chủ yếu Theo số liệu thống kê của FAOSTAT, năm 1961 năng suất ngô trung bình của thế giới mới đạt 19,4 tạ/ha, năm 2000 năng suất ngô đã đạt 43,2 tạ/ha, đến năm 2013 năng suất ngô đã tăng trên 55,2 tạ/ha Bên cạnh đó, diện tích trồng ngô cũng đã tăng nhanh qua các năm từ 105,6 triệu ha (năm 1961) lên 184,2 triệu ha (năm 2013) Sản lượng ngô năm 2013 đạt 1016,7 triệu tấn, tăng gấp 5 lần so với năm 1961 (205,0 tấn) (FAOSTAT, 2014) Như vậy diện tích, năng suất và sản lượng của cây ngô ngày càng tăng và đã đạt được nhiều thành tựu đáng kể Trong hơn mười năm gần đây, từ năm 2000 đến năm 2013, diện tích gieo trồng ngô đã tăng 47,2 triệu ha, sản lượng tăng 424,2 triệu tấn Việc tăng sản lượng ngô, ngoài nguyên nhân tăng diện tích canh tác còn do việc đưa giống mới có năng

suất cao vào sản xuất và năng suất đã tăng 12 tạ/ha trong giai đoạn 2000-2013 với tốc độ tăng trưởng năng suất bình quân là 2,1%/năm Sản lượng thu hoạch ngô hàng năm đã đóng góp một phần đáng kể trong việc đảm bảo an ninh lương thực, giúp xóa đói, giảm nghèo ở nhiều quốc gia trên thế giới

Bảng 1.2 Diện tích, năng suất, sản lượng sản xuất ngô một số năm trên thế giới

Năm Diện tích (triệu ha) Năng suất (tạ/ha) Sản lượng (triệu tấn)

mỳ với 713,18 triệu tấn (FAOSTAT, 2014)

Bảng 1.3 Diện tích, năng suất và sản lượng của 3 cây lương thực chính (ngô,

lúa nước, lúa mỳ) trên thế giới năm 2013

Cây trồng Diện tích

(triệu ha) Năng suất (tạ/ha)

Sản lượng (triệu tấn)

và nâng cao các biện pháp kỹ thuật trong canh tác Đặc biệt, từ 10 năm trở lại đây,

cùng với những thành tựu mới trong chọn tạo giống ưu thế lai nhờ kết hợp phương

pháp truyền thống với công nghệ sinh học thì việc ứng dụng công nghệ cao trong

canh tác cây ngô đã góp phần đưa năng suất và sản lượng ngô thế giới vượt lên trên

lúa mỳ và lúa nước

Bảng 1.4 Phân bố diện tích, năng suất và sản lượng ngô

theo vùng năm 2013

Vùng Diện tích

(triệu ha)

Năng suất (tạ/ha)

Sản lượng (triệu tấn)

Theo thống kê của FAOSTAT năm 2014, Châu Mỹ là châu lục sản xuất ngô

lớn nhất thế giới, đứng đầu cả về diện tích với 70,703 triệu ha (chiếm 38,4% diện

tích ngô toàn thế giới), năng suất đạt 73,92 tạ/ha (gấp 1,3 lần năng suất ngô trung

bình của thế giới) và sản lượng đạt 522,628 triệu tấn (chiếm 51,4% tổng sản lượng

ngô thế giới) Với trên 50% diện tích gieo trồng bằng giống được chọn tạo nhờ công

nghệ sinh học, năng suất ngô của nước Mỹ đã đạt 99,70 tạ/ha trên diện tích 35,48

triệu ha đã đưa Mỹ trở thành một trong những quốc gia sản xuất ngô lớn nhất thế

giới với sản lượng thu được năm 2013 là 353,70 triệu tấn (chiếm 34,70% tổng sản

lượng thế giới) Trung Quốc cũng là một trong những quốc gia có diện tích trồng

ngô lớn nhất thế giới với diện tích gieo trồng là 35,28 triệu ha, sản lượng thấp hơn

Mỹ nhưng cao hơn sản lượng trung bình thế giới với 61,75 tạ/ha và sản lượng đạt

217,83 triệu tấn (chiếm 21,42% tổng sản lượng thế giới) (FAOSTAT, 2014)

1.2.2 Tình hình sản xuất và sử dụng ngô trong nước

Ở Việt Nam, cây ngô là cây trồng có từ lâu đời, với nhiều đặc điểm quý, khả năng thích ứng rộng nên cây ngô sớm được người dân chấp nhận nhờ đó trở thành một trong những cây lương thực chính với diện tích và năng suất ngày càng tăng

Năm Diện tích

(nghìn ha)

Năng suất (tạ/ha)

Sản lượng (nghìn tấn)

2013, diện tích ngô cả nước ta đạt 1.170,9 nghìn ha (trong đó có trên 90% diện tích trồng ngô lai) Nhờ việc ứng dụng tiến bộ khoa học kỹ thuật và việc áp dựng các giống ngô lai trong công tác sản xuất năng suất ngô của nước ta đã tăng lên nhanh chóng Công tác nghiên cứu và phát triển ngô lai ở nước ta đã được trung tâm cải tạo ngô và lúa mì Quốc tế (CIMMYT), tổ chức lương thực và nông nghiệp liên hiệp quốc (FAO) cũng như các nước trong khu vực đánh giá rất cao Trong vòng 8 năm, bắt đầu năm 1993 nước ta đã đưa ngô lai vào sản xuất đại trà với 12% diện tích, đến năm 2013 diện tích ngô lai nước ta đã đạt trên 90% Trong những năm qua nhờ vào

sự phát triển của khoa học kỹ thuật, việc áp dụng những công nghệ mới vào sản xuất mà tình hình sản xuất ngô ở nước ta có những thay đổi rõ rệt Năng suất ngô đã liên tục tăng nhanh với tốc độ cao hơn tốc độ trung bình của thế giới, từ 11,2 tạ/ha năm 1961 (bằng 57,7% năng suất ngô trung bình của thế giới) lên đến 44,4 tạ/ha năm 2013 (bằng 80,4% năng suất ngô trung bình của thế giới) Sản lượng từ đó cũng tăng theo từ 292,2 nghìn tấn năm 1961 lên đến 5190,9 nghìn tấn năm 2013 (FAOSTAT, 2014)

Mặc dù đã đạt được những kết quả quan trọng, nhưng sản xuất ngô nước ta vẫn còn nhiều vấn đề đặt ra: 1) Năng suất ngô nước ta vẫn thấp hơn so với năng suất trung bình thế giới (chỉ bằng 80,4%) và rất thấp so với năng suất thí nghiệm; 2) Giá thành sản xuất còn cao; 3) Sản lượng chưa đáp ứng đủ nhu cầu trong nước đang tăng nhanh, hàng năm nước ta vẫn phải nhập khẩu từ khoảng 3 triệu tấn ngô hạt làm nguyên liệu cho chế biến thức ăn chăn nuôi; 4) Sản phẩm ngô còn đơn điệu; 5) Công nghệ sau thu hoạch chưa được chú ý đúng mức, dẫn đến thiệt hại lớn hàng năm

Những năm gần đây, Nhà nước đã có nhiều cơ chế chính sách hỗ trợ giống đã khuyến khích các doanh nghiệp trong và ngoài nước sản xuất, cung cấp giống, giới thiệu các giống ngô lai mới có năng suất cao, chất lượng tốt vào sản xuất, nhiều tiến

bộ khoa học kỹ thuật về sản xuất ngô đã được chuyển giao đến người nông dân Tuy nhiên, do bộ giống ngô lai trong nước còn thiếu cộng với việc áp dụng các tiến bộ kỹ thuật vào sản xuất vẫn còn nhiều hạn chế, với địa hình phức tạp, ít đầu tư thâm canh nên năng suất ngô vẫn còn thấp so với tiềm năng của giống Năm 2013, năng suất trung bình cả nước đạt 44,4 tạ/ha, sản lượng trên 5,1 triệu tấn so với năng suất ngô thâm canh là 70 - 80 tạ/ha

Theo báo cáo của Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn (NN&PTNT), trong 9 tháng đầu năm 2014 kim ngạch nhập khẩu ngô làm nguyên liệu chính để sản xuất thức ăn chăn nuôi tăng mạnh cả về lượng và giá trị Ước tính khối lượng ngô nhập khẩu trong tháng 9/2014 đạt 230 nghìn tấn với giá trị đạt 63 triệu USD, đưa khối lượng nhập khẩu mặt hàng này trong 9 tháng đầu nâm 2014 đạt gần 3,15 triệu tấn, giá trị nhập khẩu đạt 820 triệu USD, tăng gấp 2,4 lần về lượng và 1,9 lần về giá trị so với cùng kỳ năm 2013 (Bộ NN&PTNT, 2014) Do đó, cần đẩy mạnh hơn nữa công tác nghiên cứu tạo cơ cấu giống mới để tạo ra nguồn nguyên liệu thức ăn chăn nuôi nhiều hơn, đáp ứng nhu cầu trong nước

Theo chiến lược nghiên cứu và phát triển cây ngô của Việt Nam đến năm 2020

đã xác định cần đẩy mạnh nghiên cứu về cây ngô góp phần đưa diện tích ngô của cả nước đến năm 2015, phấn đấu đạt 1,3 triệu ha ngô; năng suất đạt trên 50 tạ/ha; sản lượng đạt 6,5 triệu tấn, đến năm 2020 đạt 1.500,000 ha với năng suất bình quân 60 tạ/ha và sản lượng 9,0 triệu tấn, nhầm đảm bảo cung cấp nguyên liệu cho chế biến

thức ăn chăn nuôi và các nhu cầu khác trong nước, từng bước tham gia xuất khẩu

1.3 Hiện tượng ưu thế lai và ứng dụng trong chọn tạo giống ngô

1.3.1 Hiện tượng ưu thế lai

Ưu thế lai (heterosis) là thuật ngữ để chỉ hiệu quả lai có biểu hiện vượt trội

về sức sinh trưởng, sinh sản, tính chống chịu, năng suất và phẩm chất của con lai ở thế hệ thứ nhất so với các dạng bố mẹ của chúng Hiện tượng này thể hiện rất rõ ở những con lai thu được từ sự giao phối giữa các dòng tự phối với nhau (Hoàng Trọng Phán và cs, 2008)

1.3.2 Ý nghĩa của ưu thế lai

Khi lai hai vật liệu với nhau, có thể thu được 3 cây lai với 3 mức biểu hiện khác nhau: (1) tốt hơn hẳn so với bố mẹ, (2) đạt mức trung gian giữa hai bố mẹ và (3) kém hơn so với bố mẹ Theo nghiên cứu của các nhà khoa học cho thấy chỉ có 37% số tổ hợp lai cho năng suất cao hơn bố mẹ, 46% số tổ hợp lai bằng mức trung gian của bố mẹ và 17% số tổ hợp thấp hơn bố mẹ

Ưu thế lai ở ngô thể hiện rất rõ khi lai giữa các giống và khi lai giữa các dòng tự phối thuần Kết quả nghiên cứu ở nhiều nước cho thấy trong điều kiện tương tự, ngô lai giữa các giống tăng 10-20%, ngô lai giữa các dòng tự phối thuần tăng 20-30% và hơn nữa so với các giống địa phương tốt nhất

Ứng dụng ưu thế lai là phương pháp chủ yếu, quan trọng nhất trong chọn tạo giống mới Việc sử dụng các giống có ưu thế lai cao đã làm cho cây trồng có bước nhảy vọt về năng suất cũng như chất lượng, người ta gọi đó là cuộc “cách mạng xanh” trong sản xuất nông nghiệp

1.3.3 Cơ sở di truyền của ưu thế lai

1.3.3.1 Giả thuyết về tác dụng tương hỗ giữa nhiều gene trội (thuyết tính trội)

Giả thuyết về tính trội do Jones đề xướng năm 1917 Tuy nhiên, những ý kiến đầu tiên đưa ra sự xác nhận về tác dụng bổ sung của các gene trội có lợi đối với hiện tượng ưu thế lai lại thuộc về Bruce (1910) rút ra từ các công trình thực nghiệm

ngược lại Quá trình tự phối dẫn dến sự đồng hợp tử hoá của hai loại gene này Sự đồng hợp tử hoá các gene lặn dẫn đến sự suy thoái về sức sinh trưởng Trong một dòng tự phối không chỉ tích luỹ hoàn toàn các gene trội có lợi Kiểu gene của các dòng tự phối khác nhau sẽ không giống nhau Khi đem giao phối chúng với nhau thì

ở con lai xuất hiện nhiều gene trội tại các locus khác nhau, trong đó các gene trội lấn

át sự biểu hiện của các gene lặn Kết quả là xuất hiện hiện tượng ưu thế lai và có tính đồng đều ở con lai F1.

1.3.3.2 Giả thuyết về tính siêu trội

Theo giả thuyết này, chính bản thân tính dị hợp tử là nguyên nhân quan trọng

của hiện tượng ưu thế lai Vì vậy nó còn được là giả thuyết về tính dị hợp tử

Giả thuyết này cho rằng, trong một số sự kết hợp, mối tác động tương hỗ giữa hai allele trong một locus có thể dẫn đến thể dị hợp tử Aa có sức mạnh vượt qua cả hai thể đồng hợp tử AA và aa Nhiều thực nghiệm về đột biến thực nghiệm ở lúa mì và lúa mạch đã xác nhận điều này Người ta giả thiết rằng, ở trạng thái dị hợp tử thì hai allele hoàn thành một số chức năng khác nhau và bổ sung cho nhau Bởi vậy, khi có hiện tượng đa allele thì tính siêu trội chỉ xuất hiện ở những cặp allele rất khác nhau Trong trường hợp siêu trội, người ta nói đến mối tương tác giữa các allele trong giới hạn một locus Mỗi locus không phải chỉ có hai trạng thái trội và lặn mà còn có thể phân thành nhiều trạng thái trung gian nữa, khác nhau về cấu trúc và chức năng sinh lí

Ví dụ, một dòng tự phối có kiểu gene a1a1 giao phối với một dòng tự phối khác có kiểu gene a2a2 thì F1 sẽ có trạng thái dị hợp tử a1a2 Do giữa a1và a2 phát sinh tác dụng lẫn nhau mà mỗi sản phẩm do con lai tạo ra đều có hiệu quả cao hơn trạng thái đồng hợp tử a1a1 và a2a2 của bố mẹ Kết quả là xuất hiện ưu thế lai Ở đây giữa a1 và a2 không có quan hệ trội-lặn mà ngược lại, tác dụng bổ sung giữa chúng

sẽ vượt qua hiệu ứng của tính trội hay tính siêu trội

1.3.3.3 Thuyết cân bằng di truyền

Thuyết cân bằng di truyền, mà người đề xướng là Turbin (1961), được coi là một giả thuyết có khả năng liên kết được các luận điểm trong việc giải thích hiện tượng ưu thế lai Thuyết này cho rằng ưu thế lai là một hiện tượng về tính ưu thế của con lai đối với mức độ phát dục tính trạng này hay tính trạng khác so với bố mẹ

Mức độ biểu hiện của tính trạng, tức kết quả của sự phát dục là đặc trưng cho quá trình này về mặt số lượng Sự sai lệch trong quá trình phát dục của con lai so với bố

mẹ có thể theo hướng tăng lên hoặc giảm đi (ưu thế lai dương hoặc âm) Thông thường ta chỉ nói đến ưu thế lai dương là do ý nghĩa thực tiễn của nó

Tóm lại, từ ba giả thuyết trên cho thấy rằng, những phân tích về mặt lí luận

di truyền học của hiện tượng ưu thế lai chứng tỏ tính chất phức tạp và mối liên quan nhiều mặt của nó với những vấn đề khác của di truyền học Các giả thuyết nói trên không loại trừ nhau mà ngược lại, bổ sung cho nhau Cho đến nay, vẫn chưa có một giả thuyết nào chứng tỏ rằng nó được thừa nhận làm lí luận chung cho hiện tượng

ưu thế lai Tuy nhiên, như đã nói, hai giả thuyết đầu khá phù hợp với nhiều sự kiện thực tế và có cơ sở khoa học khá chắc chắn

1.3.4 Ưu thế lai - lịch sử nghiên cứu và ứng dụng trong chọn tạo giống ngô

Hiện tượng ưu thế lai được nhà khoa học người Đức I.G.Koelreuter (1733 - 1806) phát hiện đầu tiên vào năm 1760 trong các thí nghiệm về lai xa ở cây thuốc lá

(Nicotiana paniculata × N rustica) Sau này, nhiều nhà nghiên cứu khác trong khi

tiến hành nghiên cứu lai ở thực vật đã đề cập đến hiện tượng này Ví dụ điển hình

về lai xa ở thực vật là con lai giữa các chi (intergeneric hybrid) thuộc họ Hoà thảo (Poaceae)

Lúa mỳ Triticum × Lúa mạch đen Secale → Triticale

Tuy nhiên, những vấn đề lý luận của hiện tượng ưu thế lai ở ngô đã được Charles Darwin nêu lên đầu tiên, ông nhận thấy những cây giao phối phát triển cao hơn những cây tự phối 20% trong tác phẩm “Tác động của giao phối và tự phối trong thế giới thực vật” xuất bản năm 1876 (Hoàng Trọng Phán và cs, 2008)

Năm 1878 nhà nghiên cứu người Mỹ tên Beal đã áp dụng thực tế ưu thế lai trong việc tạo giống ngô lai giữa các giống Ông thu được những cặp lai hơn hẳn các giống bố mẹ về năng suất từ 10-15%

Năm 1908 Shull lần đầu tiên tiến hành tự thụ cưỡng bức ở ngô để thu được các dòng chuẩn và đã tạo ra những giống lai từ các dòng chuẩn này Năm 1913 chính Shull đã đưa vào tài liệu khoa học thuật ngữ “hetetosis” để chỉ ưu thế lai (hetetosis là từ rút gọn của stimulus of heterozygosis) Từ năm 1918, Jones đề xuất

sử dụng lai kép trong sản xuất để giảm giá thành hạt giống thì việc áp dụng ưu thế lai vào trồng trọt, chăn nuôi được phát triển nhanh chóng

Bản chất của phương pháp tạo giống lai là lai hai hay nhiều bố mẹ với nhau tạo ra thế hệ F1 có hiệu ứng ưu thế lai cao để gieo trồng trong sản xuất Thành công của phương pháp tạo giống lai phụ thuộc trước hết vào việc tìm kiếm được cặp bố

mẹ có ưu thế lai và khả năng kết hợp cao Các dòng thuần đáp ứng tốt cả hai yêu cầu này Do đó việc tạo dòng thuần trở nên cần thiết và trở thành một trong ba bước quan trọng của công tác chọn tạo giống ngô lai (Lê Huy Hàm và cs, 2005)

1.4 Dòng thuần và những nghiên cứu phát triển dòng thuần

1.4.1 Dòng thuần

Dòng tự phối thuần (dòng thuần) là tập hợp các cá thể đồng nhất về mặt di

truyền được tạo ra do quá trình tự thụ phấn nhiều đời

Dòng thuần là vật liệu cơ bản quan trọng trong chọn tạo và phát triển giống ngô lai Dòng thuần được tạo ra từ những vật liệu rất đa dạng như giống địa phương, giống thụ phấn tự do, các quần thể… bằng nhiều phương pháp khác nhau như tự thụ phấn cưỡng bức, các hình thức nội phối…

Sự tăng trưởng ấn tượng của nghiên cứu và sản xuất ngô trên thế giới là kết quả của sự kết hợp cải thiện nguồn gen trong chọn tạo giống lai, cải thiện sản xuất

và quản lý nông nghiệp

1.4.2 Những nghiên cứu phát triển dòng thuần ở ngô

Những nghiên cứu của các nhà khoa học ở thế kỷ thứ 19 đều đã khẳng định các dòng thuần là nguồn vật liệu nền tảng cho nghiên cứu di truyền và chọn giống Các dòng ngô thuần được sử dụng mạnh mẽ trong chọn giống và sản xuất hạt giống ngô ưu thế lai Các dòng thuần ngô đặc thù đã đóng vai trò nền tảng trong di truyền

và chọn giống ở ngô

Một số phương pháp tạo dòng thuần đã được các nhà khoa học Sprague và Eberhart, 1955 đề xuất sử dụng như:

+ Phương pháp chuẩn: Do Shull đề xuất sử dụng (1909, 1910);

+ Phương pháp cận phối (sib hoặc fullsib); Phương pháp thuần hoá tích hợp; Chọn tạo dòng tương đồng; Phương pháp lai trở lại

Ngoài các phương pháp tạo dòng truyền thống như ở trên, một số phương pháp tạo dòng thuần mới đã được phát triển như chọn lọc giao tử, tạo dòng đơn bội kép bằng nuôi cấy bao phấn hoặc noãn chưa thụ tinh, hay phương pháp tạo dòng đơn bội kép in vivo sử dụng dòng kích tạo đơn bội…

1.4.2.1 Phương pháp tự phối

Người đầu tiên đề xuất phương pháp tự phối để tạo dòng thuần là Shull (1909, 1910) và đến nay đây vẫn là phương pháp chuẩn được các nhà tạo giống sử dụng Để tạo vật liệu cho quá trình chọn lọc được dễ dàng và chuẩn xác, phải tiến hành đồng huyết hóa mà tự phối là dạng đồng huyết hóa nhanh nhất Tuy nhiên, theo phương pháp truyền thống, việc sản xuất các dòng thuần thường đòi hỏi 6-8 thế hệ tự thụ phấn bắt buộc để thu được mức đồng hợp tử mong muốn Đây là một

quá trình lâu dài và tốn kém

1.4.2.2 Phương pháp Sib hoặc Fullsib

Stringfield (1974) đã đề xuất phương pháp Sib và sử dụng để tạo dòng thuần nhằm làm giảm mức độ suy thoái do tự phối gây nên, phương pháp này kéo dài thời gian chọn lọc dòng Để tạo được những dòng thuần có khả năng kết hợp cao thì tự phối có ưu thế hơn so với Sib hoặc Fullsib, mặt khác tự phối đạt được mức độ đồng hợp tử nhanh hơn các phương pháp cận phối nên nó được ưu chuộng hơn

1.4.2.3 Phương pháp chọn lọc phả hệ

Các nhà khoa học trên thế giới cho rằng chọn lọc phả hệ là một thành phần quan trọng trong chương trình chọn tạo giống hiện đại, nó sẽ là điểm nhấn trong quần thể với sự hạn chế của cơ sở di truyền các giống lai và các dòng tốt là cơ sở để cải tiến các dòng thông qua chọn lọc phả hệ

1.4.2.4 Tạo dòng đơn bội kép (Double haploid – DH)

Trong khi việc chọn tạo dòng thuần bằng phương pháp truyền thống mất rất nhiều thời gian, thông thường cần từ 6-8 đời tự thụ (khoảng từ 3-4 năm), các nhà khoa học đã nghiên cứu tạo ra các dòng đơn bội kép (double haploid) thông qua: i)

Kỹ thuật nuôi cấy in vitro (bao gồm các kỹ thuật nuôi cấy bao phấn, hạt phấn hay nuôi cấy noãn chưa thụ tinh); ii) Kỹ thuật tạo dòng đơn bội kép in vivo (sử dụng

dòng kích tạo đơn bội (inducer haploid) và đa bội hóa thể đơn bội để tạo dòng đơn

bội kép) Các dòng mới được tạo ra trong thời gian rất ngắn (từ 1-2 năm)

a) Sơ lược về thể đơn bội

Hầu hết các loài cây trồng của chúng ta đều có mức bội thể lớn hơn 1, phổ biến là nhị bội (2n) và tứ bội (4n) Như vậy, mỗi đặc điểm di truyền ở những cá thể này đều bị hai hay nhiều allen của một gen chi phối Nếu đó là những cá thể dị hợp

tử, tức là các gen trong mỗi hệ gen nhị bội hay tứ bội khác nhau thì biểu hiện tính trạng (phenotype) của gen đó hoàn toàn tùy thuộc vào tính trạng lặn hay trội của chúng quyết định Vì vậy, mức bội thể lý tưởng để tiến hành nghiên cứu di truyền các tính trạng phải là mức đơn bội (1n) hoặc các mức đa bội khác nhưng chúng phải đồng nhất tuyệt đối Các thể đơn bội là những cá thể thường là của những loài nhị bội hay đa bội khác nguồn mà trong tế bào soma của chúng số lượng nhiễm sắc thể bằng nửa số lượng nhiễm sắc thể của loài khởi đầu, trong mỗi cặp nhiễm sắc thể tương đồng, nó chỉ có một nhiễm sắc thể Như vậy, cây đơn bội là cây có số lượng nhiễm sắc thể trong tế bào dinh dưỡng chỉ có một nửa (n) so với cây bình thường (2n) Trong cây đơn bội mỗi chiếc nhiễm sắc thể tương đồng chỉ tồn tại một chiếc, hay một locus gene đơn chỉ tồn tại một allele Chính đặc điểm như vậy của bộ máy

di truyền nên cây đơn bội có nhiều ý nghĩa trong chọn giống:

- Sự có mặt của một bộ nhiễm sắc thể đơn dễ dàng cho tách dòng đột biến

- Nhị bội đồng hợp tử thu nhận được bằng cách nhị bội hóa cây đơn bội rất

có ý nghĩa trong công tác lai tạo gống

- Nghiên cứu về phôi học thực nghiệm

- Nghiên cứu tế bào học

- Nghiên cứu đột biến

- Cải thiện giống cây: Tạo dòng thuần, tạo cây từ hạt phấn

- Nghiên cứu tạo cây từ hạt phấn của các giống thuần

- Nghiên cứu đột biến, gây đột biến ở các dạng đơn bội và chọn lọc

- Phát triển dòng vô tính ở các loài thân gỗ lâu năm

- Chuyển các gene ngoại lai mong muốn

- Thiết lập các dòng tế bào đơn bội và nhị bội hạt phấn của cây

Trong đó, tạo dòng thuần là một trong những hướng ứng dụng quan trọng

hàng đầu của thể đơn bội Từ thể đơn bội, người ta có thể can thiệp để lưỡng bội hóa bộ máy di truyền của nó, khiến nó trở thành thể đơn bội kép (một dạng dòng thuần tuyệt đối), rất có ý nghĩa trong chọn tạo giống ưu thế lai

Năm 1921, Blakeslee mô tả cây đơn bội tự nhiên đầu tiên ở Datura stramonium, sau đó, cây đơn bội tự nhiên đã được tìm thấy ở nhiều loài cây khác

nhau Tuy vậy, các cây đơn bội trong tự nhiên xuất hiện một cách ngẫu nhiên với tần suất rất thấp (0,1%) không thể đáp ứng yêu cầu của nghiên cứu và chọn giống

b) Nghiên cứu tạo dòng đơn bội kép in vitro

Năm 1964, lần đầu tiên trên thế giới, hai nhà khoa học ấn Độ Guha và Maheshwari đã thành công trong việc tạo cây đơn bội từ nuôi cấy bao phấn in vitro

cây cà Datura innoxia Ngay sau đó, cây đơn bội đã được tạo ra bằng nuôi cấy bao

phấn ở hàng loạt cây trồng khác nhau Các nhà khoa học đã tìm ra những yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến thành công của quá trình nuôi cấy như ảnh hưởng của kiểu gen, giai đoạn phát triển của hạt phấn và các điều kiện môi trường nuôi cấy Ngoài nuôi cấy bao phấn, các nhà khoa học còn có những thành công trong nuôi cấy

noãn chưa thụ tinh, nuôi cấy hạt phấn tách rời Kỹ thuật tạo cây đơn bội in vitro

thông qua kích thích tiểu bào tử hoặc đại bào tử trong nuôi cấy hạt phấn và noãn cho phép tạo ra nhanh chóng hàng loạt cây đơn bội, phục vụ đắc lực cho mục đích nghiên cứu di truyền và tạo giống cây trồng Kể từ thành công đầu tiên, các cây đơn bội của hơn 247 loài thuộc 88 chi và 34 họ thực hạt kín đã được tạo ra từ nuôi cấy bao phấn và hạt phấn (Bajaj, 1990) Cây đơn bội từ nuôi cấy noãn hình thành theo kiểu trinh sinh cái

Sau khi tạo được thể đơn bội, các nhà khoa học đã đa bội hóa thể đơn bội đó

để thu được các đồng hợp tử tuyệt đối hay còn gọi là đơn bội kép (một dạng dòng thuần tuyệt đối) Do đó, việc nghiên cứu chọn ra những dòng đơn bội kép bằng nuôi

cấy in vitro dựa trên kĩ thuật nuôi cấy một trong ba bộ phận sinh sản của ngô là bao

phấn, hạt phấn tách rời và noãn chưa thụ tinh đã giúp cho công việc chọn tạo dòng thuần một cách nhanh chóng, rút ngắn việc tạo dòng thuần chỉ còn một thế hệ

Những ưu điểm của tạo đơn bội kép bằng nuôi cấy in vitro là không thể phủ nhận

Tuy nhiên, bên cạnh đó vẫn tồn tại những nhược điểm cố hữu khó có thể khắc phục

đó là: i) kỹ thuật này mới chỉ thành công chủ yếu trên cây họ Cà (Solanaceae), trên

họ hòa thảo (Poaceae) và mới chỉ thành công trên cây lúa mì và lúa nước; ii) tỷ lệ

“bạch tạng” ở thế hệ con là rất cao; iii) tỷ lệ đơn bội kép thấp, iv) tồn tại cả cây lưỡng bội (khi nuôi cấy bao phấn) hay v) khó tách noãn để nuôi cấy…

Ở ngô, việc ứng dụng kỹ thuật đơn bội in vitro trong thực tiễn chọn tạo giống

vẫn còn gặp nhiều khó khăn và hạn chế:

- Khả năng tái sinh cây từ bao phấn và noãn nuôi cấy in vitro nói chung còn

thấp và phụ thuộc rất nhiều vào kiểu gen (genotype) Một số giống có phản ứng trong nuôi cấy rất cao, nhưng hầu hết các giống đều có phản ứng thấp hoặc không phản ứng Hiệu quả tái sinh cũng đạt thấp, chỉ 3-5% phôi có thể tái sinh thành cây

- Tần suất các cây đơn bội kép thu được từ nuôi cấy bao phấn rất thấp (chỉ 20% số cây thu được là đơn bội kép) Khả năng làm nhị bội hoá các cây đơn bội để thu nhận các dòng nhị bội đồng hợp còn rất thấp

- Phương pháp nuôi cấy noãn chưa thụ tinh có thể là một phương pháp thay thế khắc phục được một số hạn chế trong nuôi cấy bao phấn, nhưng còn rất ít nghiên cứu theo hướng này

Mặc dù vậy, kỹ thuật nuôi cấy bao phấn ngô để thu nhận các dòng đơn bội kép đã được ứng dụng thành công ở một số nước Ở Trung Quốc, hơn 100 dòng thuần đã thu được từ 30 tổ hợp khác nhau (Wu và cs., 1983), một số giống được áp dụng trong tạo giống lai và đã được sử dụng trong sản xuất như AC 4115, Elite DK 524 (Genovesi, 1987)

Bên cạnh việc nghiên cứu tạo dòng thuần bằng nuôi cấy bao phấn, các nhà

khoa học đã nghiên cứu thành công phương pháp tạo dòng thuần in vivo bằng cách

sử dụng dòng kích tạo đơn bội (inducer haploid)

c) Nghiên cứu tạo dòng đơn bội kép in vivo

* Giới thiệu về phương pháp

Phương pháp sản xuất vật liệu đơn bội in vivo tạo ra vật liệu đơn bội (hạt,

cây…) thông qua nuôi trồng thông thường, trên đồng ruộng, không liên quan tới

phòng thí nghiệm (in vivo) Trái ngược với kĩ thuật tạo đơn bội in vitro như nuôi cấy bao phấn và tiểu bào tử, phương pháp in vivo không hề liên quan đến các bước nuôi cấy mô Hơn nữa, với ngô, nuôi cấy in vitro phụ thuộc rất nhiều vào kiểu gene

(Büter, 1997; Tang và cs, 2006), tỉ lệ bạch tạng cao, biến động thể đơn bội thu được

không đồng đều Vì thế, sản xuất vật liệu đơn bội in vitro ít khi được sử dụng trong chọn tạo giống ngô Thay vào đó là việc ứng dụng phương pháp sản xuất in vivo Khoảng 10-15 năm trở lại đây, sản xuất vật liệu đơn bội in vivo đã trở thành một

công cụ được sử dụng rộng rãi trong nghiên cứu và chọn giống ngô Tất cả các chương trình tạo dòng đơn bội kép thương mại hiện nay đều dựa trên cơ sở kích tạo

đơn bội in vivo (Barret và cs, 2008; Rotarenko và cs, 2009)

Sản xuất đơn bội in vivo có thể đạt được bằng cách: (i) lai xa (inter-specific crossing), phương pháp này thường được áp dụng rộng rãi cho lúa mạch (Hordeum vulgare, bằng cách thụ phấn với H bulbosum; Kasha và Kao, 1970) và lúa mì (bằng

cách thụ phấn với ngô; Laurie và Bennett, 1986); (ii) lai tạo trong đó phấn hoa được

xử lí bằng chiếu xạ, nhiệt và/hoặc hóa chất (Dunwell, 2010); hoặc (iii) thông qua dòng kích tạo đơn bội kích tạo (Chase, 1952) Với cách thức thứ ba có 2 chiến lược:

Sử dụng sử dụng dòng kích tạo làm mẹ sẽ tạo ra con đơn bội giống bố (paternal haploids) (Kermicle, 1969), và ngược lại sử dụng dòng kích tạo làm bố sẽ sẽ tạo ra con đơn bội giống mẹ (Rober và cs, 2005) Nghiên cứu của đề tài sẽ áp dụng phương pháp tạo vật liệu đơn bội thông qua cây kích tạo đơn bội kích tạo như chiến lược thứ hai, đó là sử dụng dòng kích tạo làm bố Đây là bước đầu tiên trong bốn bước quan trọng để tạo ra cây đơn bội kép (công nghệ đơn bội kép) bao gồm: (i) induction of haploidy - sản xuất vật liệu đơn bội (bằng cách cho dòng mẹ nhận phấn

từ dòng kích tạo), (ii) identification of haploid seeds - nhận biết hạt đơn bội (thông qua hệ thống marker màu hạt giống), (iii) artificial chromosome doubling - lưỡng bội hóa nhân tạo (bằng việc xử lí hạt đơn bội với colchicine) và (iv) seed multiplication of DH plants - nhân hạt giống của cây đơn bội kép (bằng cách tự thụ phấn bắt buộc các cây đơn bội kép)

* Dòng kích tạo đơn bội (kích tạo haploid)

Để tạo ra vật liệu đơn bội, cây nhận (cây mẹ - donor) được nhận phấn từ một nguyên liệu ngô đặc thù (dòng, lai đơn hoặc quần thể) gọi là cây kích tạo (cây/dòng inducer) Bên cạnh con lai là hạt F1 bình thường, kết quả thụ phấn còn cho ra một tỉ

lệ nhất định hạt (đơn bội) có chứa phôi ở trạng thái đơn bội và nội nhũ ở trạng thái

tam bội như thông thường Những hạt như vậy vẫn có khả năng nảy mầm dẫn đến các cây con phát triển bình thường (Rober và cs, 2005; Geiger, 2009) Sau khi lưỡng bội nhân tạo, tiến hành tự thụ các cây đã được xử lí thành công để tạo ra con cái đồng nhất và đồng hợp hoàn toàn (dòng DH)

Về cơ chế kích kích tạo đơn bội của cây/dòng kích tạo, cho đến nay, các nghiên cứu tổ chức học (histological), tế bào học cũng như di truyền học vẫn chưa thể giải thích rõ ràng Có hai giả thuyết được đưa ra: (1) Một trong hai tế bào tinh trùng được cung cấp bởi cây kích tạo bị “khiếm khuyết” nhưng vẫn có thể kết hợp với tế bào trứng Trong các lần phân chia tế bào sau đó, các nhiễm sắc thể từ cây kích tạo thoái hóa và từng bước bị loại bỏ khỏi tế bào nguyên thủy Tế bào tinh trùng thứ hai dung hợp với tế bào trung tâm và dẫn đến tạo ra một nội nhũ tam bội bình thường (2) Một trong hai tế bào tinh trùng không thể kết hợp được với tế bào trứng nhưng có thể kích hoạt sự phát triển phôi đơn bội (embryogenesis) Tế bào thứ hai dung hợp với tế bào trung tâm giống như giả thuyết đầu tiên

* Tỉ lệ kích tạo đơn bội

Năm 1952, Chase quan sát hiện tượng đơn bội tự nhiên ở nguồn gene ngô Corn-Belt của Mĩ với tỉ lệ là 0,1% Tỉ lệ này quá thấp để có thể áp dụng trong thương mại Tới năm 1959, Coe tìm thấy dòng thuần là Stock6 tỉ lệ kích tạo từ 1 đến 2% Đây là dòng kích tạo đơn bội tổ tiên của các dòng kích tạo đơn bội phát triển sau này Tiếp sau đó, nhiều thành tựu về cải thiện tỉ lệ kích tạo của dòng kích tạo thành công như nhóm nghiên cứu của Ấn Độ (Sarkar và cs, 1994); nhóm nghiên cứu của Liên Xô (Tyrnov và Zavalisshina, 1984; Chalyk, 1994; Shatskaya và cs, 1994a), nhóm nghiên cứu của Cộng hòa Pháp (Lashermes và Beckert, 1988; Bordes

và cs, 1997), và nhóm nghiên cứu của Cộng hòa Liên bang Đức (Deimling và cs, 1997; Rober và cs, 2005)

Bảng 1.5 Một số dòng kích tạo đơn bội và tỉ lệ kích tạo đơn bội của chúng

Dòng kích tạo Tỉ lệ kích tạo (%) Tài liệu tham khảo

KEMS 6 Shatskaya và cs, 1994a

UH400 8-10 Thông tin cá nhân của Schipprack, 2011 Một dòng kích tạo hiệu quả hiện nay là RWS do Đại học Hohenheim phát triển (Rober và cs, 2005) Nó được phát triển bằng việc lai tạo giữa dòng thuần có nguồn từ giống kích tạo tổng hợp của Nga là KEMS (Shatskaya và cs, 1994b) với dòng kích tạo của Pháp là WS14 (Lashermes và Beckert, 1988) và là dòng thích nghi với khí hậu ôn đới của Châu  nhưng cũng hiệu quả với môi trường nhiệt đới (Rober và cs, 2005) Bên cạnh đó cũng phải kể tới dòng kích tạo UH400 (là nguồn vật liệu trong đề tài) cũng do Đại học Hohenheim phát triển Tuy nhiên, những nghiên cứu về dòng kích tạo đơn bội này chưa nhiều và chi tiết như với dòng RWS

Đối với các kiểu gene khác nhau thì tỉ lệ kích tạo sai khác một cách có ý nghĩa (Rober và cs, 2005) Mặc dù vậy, phạm vi biến động nhỏ hơn so với kĩ thuật

cấy in vitro (Petolino và Thompson, 1987; Cowen và cs, 1992; Murigneux, 1994;

Buter, 1997; Spitko và cs, 2006) Sự biến động của tỉ lệ kích tạo cũng do nguyên nhân của yếu tố môi trường (Rober và cs, 2005) Hơn nữa tỉ lệ kích tạo còn có thể phụ thuộc vào phương pháp và thời gian thụ phấn (Rotarenko và cs, 2009) Tốt nhất

là thụ phấn bằng tay (so với tự do thụ phấn ở khu cách ly) ba ngày sau khi phun râu Tuy nhiên, với các nhà tạo giống có kinh nghiệm thì tỉ lệ thu được từ thụ phấn tự do tương tự như thụ phấn bằng tay

* Nhận biết đơn bội (haploid identification)

Một vấn đề chìa khóa để áp dụng phương pháp kích tạo đơn bội in vivo vào

thương mại hóa là hệ thống sàng lọc hiệu quả cho phép nhà tạo giống nhận biệt

được sự khác biệt giữa hạt/cây đơn bội so với hạt/cây là kết quả của thụ phấn thông thường Sự nhận biết thực hiện được càng sớm càng tốt Nhận biết thành công ở giai đoạn hạt sẽ tốt hơn ở giai đoạn cây, vì khi cây đã phát triển, rất khó để có thể can thiệp lưỡng bội hóa thành cây đơn bội kép cho hiệu quả cao Các nhà chọn giống đã nghiên cứu và đưa ra hệ thống marker nhận biết hạt đơn bội rất hiệu quả

Marker nhận biết đơn bội đó chính là tính trạng đỉnh hạt đỏ “red crown” hoặc “navajo” được mã hóa bởi allele đột biến trội R1-nj của gene màu đỏ R1 Trong sự hiện diện của các gene sắc tố chính là A1 hoặc A2 và C2, R1-nj sẽ quy định sắc tố sâu bên trong lớp aleurone (mô nội nhũ) trên khu vực đỉnh hạt Ngoài ra,

nó cũng gây ra sắc tố cho bao phôi (mô phôi) Mức độ lan rộng và độ đậm của sắc

tố thay đổi phụ thuộc vào nền di truyền (genetic back-ground) của kiểu gene cây nhận phấn (xem chi tiết tại MaizeGDB http://maizegdb.org/) Nanda và Chase (1966), Greenblatt và Bock (1967) lần đầu tiên sử dụng tính trạng đầu hạt đỏ như chỉ thị chọn lọc trong thí nghiệm kích tạo đơn bội Để thí nghiệm có kết quả, các cây mẹ (nhận phấn) phải có hạt không màu và cây kích tạo phải có kiểu gene đồng hợp cho allele R1-nj và các gene sắc tố chính nói trên Theo lý thuyết, sau phép lai

có thể thu được kết quả các hạt phân loại như sau:

(i) Hạt đơn bội - vùng đỉnh hạt màu đỏ (nội nhũ tam bội bình thường) và một bao phôi không màu

(ii) Hạt F1 thông thường (con lai giữa dòng kích tạo và dòng mẹ) - sắc tố (tím) ở cả hai vùng là lớp aleurone và bao phôi (Geiger, 2009)

(iii) Các hạt ngoài ý muốn (lưỡng bội) là kết quả của sự tự thụ hoặc lai với các cây khác (nhận phấn ngoài, không phải từ cây kích tạo) không hiển thị bất

kì sắc tố (tím) nào

(iv) Ngoài ra còn có loại hạt (lưỡng bội) mà chỉ có tế bào trứng được thụ tinh,

tế bào trung tâm không được thụ tinh - phôi có sắc tố (tím), nội nhũ mẹ lưỡng bội

và không có sắc tố, nhưng các hạt như vậy thường chết sớm trong quá trình phát triển hạt nên không (hoặc rất hiếm khi) thấy ở kết quả

Hình 1.1 Nhận biết hạt đơn bội thông qua chỉ thị hình thái

Một phương pháp xác định đơn bội khác giá rẻ và nhanh chóng cũng đã được

đề xuất bởi Rotarenko và cs (2007) Các tác giả quan sát thấy rằng các hạt chứa phôi đơn bội có nồng độ dầu thấp hơn đáng kể so với các hạt F1 có phôi lưỡng bội Nguyên nhân là do kích thước của phôi đơn bội nhỏ hơn so với phôi lưỡng bội Trong trường hợp này, việc sử dụng các dòng kích tạo với nồng độ dầu trên mức trung bình là thích hợp nhất Các dòng kích tạo hàm lượng protein cao cũng có thể được sử dụng cho những nghiên cứu tương tự

* Tạo đơn bội kép bằng tác nhân colchicine

- Tính chất

Colchicine là một alkaloid có ở nhiều loài thực vật nhưng có chủ yếu ở trong

củ và hạt loài colchicum autumnale Colchicine có công thức phân tử là C22H25O6N, khối lượng phân tử là 1399.4 dv C

Colchicine khi kết tinh có dạng tinh thể hình kim ngắn, có màu vàng nhạt Nhiệt độ nóng chảy là 155oC, tan trong rượu, clorofoc, nước lạnh, hầu như không tan trong ete

- Cơ chế tác động

Colchicine có tác dụng đến sự phân bào bằng cách ức chế sự hình thành thoi

vô sắc ở kì giữa, ngăn cản các nhiễm sắc thể con phân ly ở hậu kì Ở pha này, các nhiễm sắc thể được nhân lên nhưng thoi vô sắc không hình thành nên không xảy ra sự phân đều nhiễm sắc thể về 2 cực tế bào Kết quả là, bộ gene đơn bội được nhân đôi nhưng các tế bào không phân chia, do đó, một tế bào đơn bội kép được hình thành

Theo những nghiên cứu của Trần Duy Quý và Lê Duy Thành (1997)

colchicine ở dạng dung dịch có khả năng khuếch tán mạnh vào mô thực vật Hiện

tượng đa bội hoá chỉ xảy ra khi có tác dụng của colchicine đến những mô đang

phân hoá mạnh

- Cơ chế hình thành đa bội

Phân chia tế bào nguyên nhiễm, giảm nhiễm là cơ chế phân chia chính xác về

số lượng nhiễm sắc thể, đảm bảo cho loài được ổn định về bộ nhiễm sắc thể qua các thế hệ Tuy nhiên, trong một số trường hợp, sự phân chia bình thường của các tế bào bị phân hủy dẫn tới hình thành các tế bào đa bội Sự nhân đôi của các nhiễm sắc thể xảy ra trước phân bào, thế nhưng các sợi tơ vô sắc bị phân hủy dưới tác động của colchicine, làm cho các sợi nhiễm sắc không chạy về hai cực của tế bào Cuối cùng, lượng vật chất di truyền đã nhân đôi tồn tại ở một tế bào, hình thành nên tế bào đã được đa bội hóa, từ 2n trở thành 3n, 4n… Có thể xảy ra các trường hợp là các sợi nhiễm sắc được vận động về hai cực của tế bào, song ở giữa tế bào không hình thành vách ngăn để phân đôi hai tế bào con, tế bào trở thành đa bội

* Ứng dụng công nghệ gây đột biến đa bội bằng xử lý colchicine trên thế giới và Việt Nam

- Trên thế giới

Lưỡng bội hóa nhiễm sắc thể từng là một trở ngại nghiêm trọng trong sản xuất đơn bội kép quy mô thương mại Hiện tượng lưỡng bội hóa trong tự nhiên đã được quan sát thấy trong rất ít các nguồn tế bào mầm (Chase, 1964; Shatskaya và cs, 1994a)

Một bước đột phá mới trong công nghệ gây đột biến đa bội đã được thực hiện bởi Gayen và cs (1994), ông cắt bỏ đỉnh mầm của hạt đơn bội và nhúng cây con vào dung dịch colchicine 0,06% cộng với 0,5% DMSO (dimethyl sulfoxide) trong 12 giờ ở 18°C đã tạo ra được cây đơn bội kép

Năm 1997, Deimling và cộng sự tiếp tục tăng hiệu quả của phương pháp này bằng cách cắt thêm 20-30 mm rễ và đặt cây con ngâm trong colchicine vào bóng tối Sau khi xử lí colchicine, cây con được rửa sạch trong nước và sau đó được trồng ở nhà kính đến giai đoạn 5-6 lá (điều kiện độ ẩm cao được duy trì trong suốt những ngày đầu tiên) Sau đó, các cây đã được xử lí được chuyển ra đồng ruộng

Eder và Chalyk (2002) cũng đã áp dụng phương pháp này với một loạt các kiểu gene cây mẹ và đạt được mức lưỡng bội hóa trung bình là 49% Khoảng 50 đến 60% số cây xử lí thành công cho phấn hoa và có thể tự thụ Như vậy, khoảng một phần ba số cây giống được xử lí colchicine đã tạo ra hạt giống

Năm 2005, các nhà khoa học tại Đại học Nông nghiệp Pakistant nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian xử lý colchicine trên cây lúa mì giai đoạn cây 5 – 7 lá Kết quả đã tạo ra giống lúa mì vừa có khả năng tự thụ phấn cao, vừa được đa bội hóa bộ NST

Năm 2006, X.M.Yang và cộng sự đã xử lý colchicine trên cây nho (Vitis vinifera L.) nhằm tạo giống nho đa bội Kết quả nhận được 5/29 cá thể tứ bội hoàn

toàn bằng phương pháp đếm NST

Năm 2009, Wang Feng-bao Fu Jin-feng Dong Li-feng đã nghiên cứu ảnh hưởng của việc xử lý kết hợp colchicine 0,05% với DMSO 2% ở 24h, 48h và 72h dưới các điều kiện nhiệt độ khác nhau trong việc gây tứ bội hóa ở cây đậu Hà Lan Kết quả cho thấy, sau 48h xử lý ở 150C và 160C cho tỷ lệ sống sót cao nhất, đồng thời thu được các dạng con có bộ NST được tứ bội hóa

Năm 2010, S M Shahinul Isla tại Banglades cũng nghiên cứu tạo cây lúa mì đơn bội kép bằng xử lý colchicine Kết quả đã làm tăng tỷ lệ này đến 81,73% so với đối chứng (72,4%)

- Tại Việt Nam

Nghiên cứu trên lúa cho thấy dùng mạ gieo được 30 ngày lấy dao khía một lát ở gốc mạ rồi đem gốc mạ ngâm vào dung dịch colchicine 0,02%-0,05% trong 8-

14 ngày thì cũng thu được giống là đa bội

Viện Nghiên cứu rau quả năm 2010 đã tiến hành nghiên cứu tạo dòng đơn bội kép ớt và dưa chuột phục vụ chọn tạo giống ưu thế lai bằng phương pháp xử lý

colchicine (Trần Khắc Thi, 2011)

Chương 2 VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Vật liệu nghiên cứu

- Dòng bố: Dòng kích tạo đơn bội tự nhiên UH400 (University of

Hohenheim 400) có nguồn gốc nhập nội từ Đại học Hohenheim CHLB Đức

Bảng 2.1: Nguồn gốc và một số đặc điểm đặc trưng của dòng

kích tạo đơn bội UH400 Tên

dòng Nguồn gốc

Đặc điểm thân

Đặc điểm hạt Tai lá

Đặc điểm Gân lá,

bẹ lá

Nhiệt độ thích hợp

Không

có

Tía 17-300C

- Dòng mẹ: 21 dòng ngô có đời tự thụ từ 3-12 đời, có nguồn gốc khác nhau

(Việt Nam, Trung Quốc, Mỹ và Thái Lan) bao gồm: CUA, D3, D10, D13, D19,

D24, D26, D27, D34, D37, D41, D43, D45, D46, D54, D55, D56, D58, M7, III.21,

NK67.21 (thể hiện chi tiết ở bảng 2.2)

Bảng 2.2: Nguồn gốc vật liệu ngô dùng làm dòng mẹ trong thí nghiệm

2.2 Nội dung nghiên cứu

- Đánh giá đặc điểm nông sinh học, khả năng chống chịu và năng suất của

dòng UH400 trong điều kiện Gia Lâm, Hà Nội

- Xác định tỷ lệ kích tạo đơn bội của dòng UH400 với các dòng mẹ thu

được ở các đời tự thụ khác nhau

- Nghiên cứu đa bội hóa các cây đơn bội bằng colchicine

- Đánh giá đặc điểm nông sinh học của các dòng đơn bội kép mới chọn tạo

trong điều kiện Gia lâm, Hà Nội

2.3 Thời gian và địa điểm nghiên cứu

2.3.1 Thời gian nghiên cứu:

Từ tháng 2/2013 đến tháng 9/2014

2.3.2 Địa điểm nghiên cứu:

- Viện Nghiên cứu và phát triển cây trồng - Trường Đại học Nông nghiệp

Hà Nội (nay là Học viện Nông nghiệp Việt Nam)

- Bộ môn Sinh học - Khoa Công nghệ sinh học - Trường Đại học Nông

nghiệp Hà Nội (nay là Học viện Nông nghiệp Việt Nam)

2.4 Phương pháp nghiên cứu

2.4.1 Thí nghiệm 1: Đánh giá đặc điểm nông sinh học, chống chịu và năng suất của dòng UH400 trong điều kiện trồng tại Gia Lâm - Hà Nội

Theo dõi đánh giá các chỉ tiêu sinh trưởng, phát triển và tỷ lệ (%) nhiễm sâu bệnh hại của các dòng kích tạo đơn bội theo tiêu chuẩn: 10TCN 556-2006 Song song với việc đánh giá các chỉ tiêu nông sinh học, chỉ tiêu sâu bệnh, tiến hành tự thụ

để duy trì dòng Phương pháp duy trì các dòng kích tạo bằng tự phối, bao cách ly khi trỗ cờ, bao cách ly khi phun râu (bao sớm) thu phấn của cây nào thụ cho bắp của chính cây đó

c) Chỉ tiêu theo dõi và phương pháp theo dõi

- Theo dõi, đánh giá đặc điểm nông sinh học, chống chịu, năng suất và yếu tố tạo thành năng suất của dòng kích tạo UH400 tại Gia Lâm, Hà Nội trong vụ Xuân năm 2013

- Theo dõi tất cả các cây trên các chỉ tiêu sau:

¾ Tỷ lệ nảy mầm (%):

¾ Các giai đoạn sinh trưởng, phát triển:

+ Mọc: Trên 50% số cây có bao lá mầm lên khỏi mặt đất (mũi chông)

+ Tung phấn: Ngày có 50% số cây có hoa nở được 1/3 trục chính

+ Phun râu: Ngày có 50% số cây có râu nhú dài từ 2-3 cm

+ Thời gian sinh trưởng: Thời gian từ khi gieo đến khi có trên 75% cây có lá

bi khô hoặc chân hạt có chấm đen

¾ Đặc điểm nông sinh học:

+ Chiều cao cây (cm): Đo từ gốc sát mặt đất đến đỉnh bông cờ của tất cả các

cây vào giai đoạn chín sữa

+ Chiều cao đóng bắp (cm): Đo từ gốc sát mặt đất đến mắt đóng bắp trên

cùng (bắp thứ nhất) của tất cả các cây vào giai đoạn chín sữa

+ Số lá thật: Cắt đánh dấu lá thứ 5 và lá thứ 10 để tiện cho việc đếm lá

cuối cùng

¾ Khả năng chống chịu đồng ruộng:

Không bị bệnh: <5% cây nhiễm 1

Nhẹ: 5-15% cây nhiễm 2 Vừa: >15-25% cây nhiễm 3 Nặng: >25-35% cây nhiễm 4 Rất nặng: >35% cây nhiễm 5

¾ Đặc điểm bắp và hạt:

+ Chiều dài bắp (không kể lá bi) (cm): Đo từ đáy bắp đến mút bắp của tất cả

các cây lúc thu hoạch Chỉ đo bắp thứ nhất

+ Đường kính bắp (không kể lá bi) (cm): Đo ở giữa bắp của tất cả các cây lúc thu hoạch Chỉ đo bắp thứ nhất

+ Số hàng hạt/bắp: Đếm số hàng hạt ở giữa bắp của tất cả các cây khi thu hoạch Chỉ đếm bắp thứ nhất của cây mẫu (một hàng được tính khi có 50% số hạt so với hàng dài nhất)

+ Số hạt/hàng: Đếm số hạt của hàng có chiều dài trung bình của bắp Chỉ đếm bắp thứ nhất

+ Khối lượng 100 hạt (gam) ở độ ẩm 14% (để khô sau 2 tuần thu hoạch ở

tủ sấy) Cân 2 mẫu, mỗi mẫu 50 hạt, nếu hiệu số giữa 2 lần cân (mẫu nặng/mẫu nhẹ) không chênh lệch quá 5% so với khối lượng trung bình của 2 mẫu là chấp nhận được

2.4.2 Thí nghiệm 2: Lai và xác định tỷ lệ kích tạo đơn bội

- Mỗi dòng mẹ trồng 30 cây/hàng Trồng cây kích tạo UH400 xen giữa các hàng Theo dõi đặc điểm nông sinh học và chống chịu của tất cả các cây

- Khi trỗ cờ - phun râu bao cách ly tất cả các cây, bẻ cờ toàn bộ cây hàng mẹ Thu phấn của cây kích tạo UH400 thụ cho từng bắp của cây mẹ Công việc thụ phấn thực hiện vào buổi sáng sớm

- Sau khi thụ phấn xong, tiến hành chăm sóc và thu hoạch các bắp/hàng mẹ

để riêng từng cây và thu hoạch các bắp cây kích tạo UH400

- Theo dõi các bắp trên cây mẹ các chỉ tiêu sau:

+ Số hàng hạt/bắp: Đếm số hàng hạt ở giữa bắp của tất cả các cây khi thu hoạch Chỉ đếm bắp thứ nhất của cây mẫu (một hàng được tính khi có 50% số hạt so với hàng dài nhất)

+ Số hạt/hàng: Đếm số hạt của hàng có chiều dài trung bình của bắp Chỉ đếm bắp thứ nhất

+ Số hạt không đổi màu

+ Số hạt đổi màu nội nhũ (Hạt được cho là đơn bội)

+ Số hạt đổi màu phôi (bao gồm cả hạt đổi màu và không đổi màu nội nhũ)

Ghi chú : chỉ thị chuyển màu do gen r1-nj quy định, cây mẹ nhận phấn

(donor) có kiểu gen (r1-nj r1-nj), cây kích tạo (kích tạo) có kiểu gen (R1-nj R1-nj); khi nhận phấn của cây kích tạo con F1 hạt của nó có kiểu gen dị hợp (R1-nj r1-nj) là

phôi đơn bội ( H embryo) như hình trên

* Chuẩn bị hạt và cho nảy mầm

Các hạt xử lý nấm bệnh trước khi tiến hành ngâm ủ để hạt nảy mầm Hạt sau khi ngâm được xếp lên một lớp giấy thấm gấp zigzag Các hạt xếp mặt phôi úp xuống để nảy mầm được đồng đều

* Nảy mầm

Tủ thúc mầm ở điều kiện tối và nhiệt độ ở 26°C Để đảm bảo cho độ ẩm để hạt nảy mầm, tiến hành tưới vào môi trường 2 lần/ngày vào buổi sáng và tối Môi trường được giữ ẩm tốt trong suốt thời gian thúc mầm không gạn nước đi Tính trạng nảy mầm lý tưởng để xử lý đa bội hóa bằng colchicine (chiều dài mầm khoảng

2 cm) thường sau 2 – 4 ngày tùy thuộc vào kiểu gen

* Chuẩn bị dung dịch Colchicine solution

- Colchicine có công thức hóa học C22H25NO6 là chất kiềm có độc tính cao

được chiết xuất từ rễ cây Conxixin autumnale L Có nhiều ở vùng Địa Trung Hải