Tất cả các hạt được đánh giá là đơn bội ở thí nghiệm 2 được sử dụng làm nguồn vật liệu cho thí nghiệm 3. Ở thí nghiệm này, chúng tôi sử dụng Colchicine để tạo ra dòng đơn bội kép từ các hạt đơn bội. Các hạt sau khi xử lý colchicine được trồng ra đồng ruộng, theo dõi các đặc điểm sinh trưởng, phát triển và khả năng tạo bắp hữu hiệu. Thí nghiệm được tiến hành trong điều kiện vụ Thu Đông năm 2013, tại Gia Lâm - Hà Nội. Phương pháp xử lý đơn bội kép theo bài giảng “Chromosome Doubling in Maize” của TS. W.Schipprack đại học Hohenhiem, năm 2012. Phương pháp thí nghiệm đồng ruộng được thực hiện theo tiêu chuẩn: 10TCN 556-2006 của Bộ Nông nghiệp và phát triển nông thôn.
Kết quả theo dõi, đánh giá khả năng tạo đơn bội kép, khả năng sinh trưởng, phát triển của các cây đơn bội, đơn bội kép được thể hiện chi tiết ở bảng 3.10:
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 51
Bảng 3.10. Tỷ lệ nảy mầm và khả năng tạo đơn bội kép sau xử lý với colchicine hạt đơn bội của các phép lai kích tạo
TT UH400 x dòng mẹ Tổng số hạt đơn bội TN Tỷ lệ nảy mầm (%) Số hạt xử lý colchicin e Số cây sống (cây) Tỷ lệ cây đơn bội kép(cây) Tỷ lệ tạo bắp hữu hiệu (cây) 1 CUA 25 16 ,00 4 3 3 2 2 D3 7 57,14 4 1 0 0 3 D10 18 16,67 3 0 0 0 4 D13 16 68,75 10 4 2 0 5 D19 17 94,12 15 6 3 1 6 D24 22 45,45 8 3 0 0 7 D26 25 36,00 9 6 3 1 8 D27 8 75,00 5 0 0 0 9 D34 28 42,86 10 4 2 2 10 D37 7 57,14 4 1 0 0 11 D41 26 46,15 11 4 1 1 12 D43 25 12,00 3 1 0 0 13 D45 26 46,15 12 2 0 0 14 D46 8 75,00 6 1 0 0 15 D54 21 19,05 4 1 0 0 16 D55 8 37,50 3 1 1 0 17 D56 24 20,83 5 2 2 1 18 D58 15 46,67 6 1 0 0 19 M7 19 68,42 11 3 1 1 20 III.21 7 71,43 5 5 4 2 21 NK67.21 6 66,67 4 1 1 0 Tổng cộng 142 50(35,21%) 23(16,20%) 11(7,75%)
Qua bảng 3.10 cho thấy, tỷ lệ nảy mầm của các hạt đơn bội của các phép lai kích tạo giữa dòng UH400 và các dòng mẹ tự phối có sự chênh lệch nhau khá lớn dao động trong khoảng từ 12,00 - 94,12%. Trong đó, hạt đơn bội của dòng D19 có tỷ lệ nảy mầm cao nhất với 94,12%, dòng III.21 có tỷ lệ nảy mầm là 71,43%, trong khi đó, hạt đơn bội của dòng D43, CUA và dòng D10 lại có tỷ lệ nảy mầm thấp nhất lần lượt là 12%, 16% và 16,67%. Theo Vijay Chaikam và George Mahuku (2012) tỉ lệ nảy mầm của hạt đơn bội là 85-90%. Tuy nhiên, tỷ lệ nảy mầm của hạt phụ thuộc và rất nhiều yếu tố, trong đó phải kể đến là yếu tố di truyền giống, yếu tố kỹ thuật cũng như các điều kiện tối ưu khác. Do khả năng nảy mầm của hạt đơn bội có ảnh hưởng lớn đến kết quả tạo dòng đơn bội kép sau này trong toàn thí nghiệm nên có thể can thiệp để tạo điều kiện tối ưu cho hạt nảy mầm như: chọn lọc hạt có sức nảy
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 52 tốt, ngâm hạt đúng nhiệt độ, đủ thời gian, điều chỉnh khả năng nảy mầm thông qua điều khiển nhiệt độ (nhờ tủ thúc mầm), thậm chí có thể dùng một trong các loại chất điều tiết sinh trưởng, phân bón lá để ngâm hạt giống trong 8-10 giờ, giúp cho hạt nảy mầm đều, mầm khỏe, sinh trưởng phát triển tốt sau trồng. Ngoài ra, xử lý nấm bệnh trước khi ngâm ủ cũng là một biện pháp để nâng cao tỷ lệ nảy mầm của hạt.
Hình 3.4. Tủ thúc nảy mầm hạt đơn bội
Hình 3.5. Hạt nảy mầm Hình 3.6. Cắt đỉnh mầm để xử lý Colchicine
Hình 3.7. Chuẩn bị xử lý colchicine
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 53 Colchicine là một ankaloid có tác dụng ngăn cản sự hình thành thoi vô sắc khi tế bào phân chia, qua đó thay đổi bộ máy di truyền của tế bào (làm lưỡng bội hóa tế bào đơn bội). Do bị thay đổi cấu trúc di truyền nên một số cá thể sẽ chết. Qua kết quả ở bảng 3.10 cho thấy tỉ lệ chết của các cây sau khi xử lý colchicine là khá cao (chiếm xấp xỉ 65%). Tỷ lệ cây còn sống sau khi xử lý trung bình chỉ đạt 35,21%. Theo Vijay Chaikam và George Mahuku (2012), chỉ 40-80% cây đơn bội được xử lí sẽ phát triển được trên đồng ruộng (hay trong nhà lưới). Do đó, có thể thấy rằng, tỷ lệ sống sau khi xử lý colchicine trong thí nghiệm đạt khá thấp so với nghiên cứu trước đó của Vijay Chaikam và George Mahuku (2012)
Hình 3.9. Hạt đơn bi sau khi được xử lý colchicine được trồng ra khay ươm
trong nhà lưới
Hình 3.10. Cây sống sau khi xử lý colchicine
Hình 3.11. Cây chết sau khi xử lý cochicine
Hình 3.12. Cây đơn bội kép giai đoạn từ 5-7 lá
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 54 Sau khi ra cây con ở nhà lưới và trồng chăm sóc và theo dõi tất cả các cây ở ngoài đồng ruộng, việc quan trọng là tìm ra được cây nào là cây đã xử lí colchicine thành công tạo cây đơn bội kép. Để làm được điều này, cần dựa vào một số những đặc điểm chỉ thị hình thái cây nhất định để qua đó khẳng định được đâu là cây đơn bội kép còn đâu là cây đơn bội. Ở thí nghiệm 2 thông qua chỉ thị hình thái hạt đã phân biết được 3 loại hạt là hạt đơn bội, hạt F1 lưỡng bội và hạt hạt lưỡng bội ngoài ý muốn. Thí nghiệm 3 này chỉ sử dụng hạt loại 1 là hạt đơn bội từ thí nghiệm 2 để xử lí colchicine. Vì quá trình chọn lọc, phân loại hạt rất kĩ càng, mỗi đại diện của các phép lai kích tạo lại được chọn lọc những hạt có chỉ thị hình thái rõ nhất và số lượng hạt cũng không quá lớn nên loại trừ khả năng chọn lọc lẫn tạp hạt loại 2 và 3 vào nguồn vật liệu của thí nghiệm. Nói cách khác, các hạt đơn bội sử dụng trong thí nghiệm là chính xác 100% theo chỉ thị hình thái hạt. Như vậy sau khi xử lí với tác nhân colchicine có các trường hợp xảy ra là: (i) Hạt đơn bội không bị lưỡng bội thành đơn bội kép, cây thể hiện đặc tính của cây đơn bội; (ii) Hạt đơn bội được lưỡng bội thành đơn bội kép, cây thể hiện đặc tính giống với cây lưỡng bội bình thường.
Do đó, có thể dựa vào đặc điểm đặc trưng của cây ngô đơn bội để phân biệt đâu là cây đơn bội, đâu là cây đơn bội kép đã xử lí thành công. Thông thường cây đơn bội có thể phân biệt được với các cây lưỡng bội bởi các đặc điểm như lá thẳng đứng, sức sống kém, và bất dục. Tuy nhiên, ở giai đoạn cây con trong nhà lưới, rất khó để phân biệt được đâu là cây đơn bội và đâu là cây đơn bội kép. Những đặc điểm này có thể được quan sát thấy sau khi cây đơn bội đã sinh trưởng, phát triển đầy đủ.
Theo Chase (1969) đã mô tả những cây đơn bội đó có lá hẹp, thường chứa các sọc trắng và chúng thấp hơn so với các cây lưỡng bội. Ông cũng lưu ý rằng các cây này có khả năng chịu stress rất kém, cờ và bắp bị thu, lép, bất dục. Hầu hết các cây đơn bội thể hiện khả năng hữu dục cái ở mức chắc chắn (Chalyk, 1994; Geiger và cs, 2006) nhưng lại thường bất dục đực (Chase, 1952; Chalyk, 1994). Sau khi xử lí colchicine, cờ của cây ngô là cơ quan có nhiều
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 55 thay đổi và có thể dựa vào đó để đánh giá với 4 trường hợp sau: (i) Cờ có nhiều bao phấn hiện rõ trên nhánh chính và phụ, hạt phấn phát tán khi chạm vào bao phấn; (ii) Chỉ có một nhánh bên của cờ có bao phấn xuất hiện mà có khả năng phát tán hạt phấn; (iii) Một số bao phấn đã xuất hiện trên các nhánh chính và phụ nhưng không có phấn hoa được phát tán khi chạm vào bao phấn; (iv) Không có bao phấn xuất hiện. Với trường hợp (i) và (ii) thì có thể kết luận tạo đơn bội kép thành công, với trường hợp (iii) và (iv) thì là không thành công. Tuy nhiên, điều này cũng không phải là tuyệt đối. Ngoài ra, còn một chỉ tiêu rất quan trọng đánh giá sự thành công của thí nghiệm. Đó là khả năng tạo hạt. Cây đơn bội sau khi trải qua quá trình lưỡng bội hóa bằng cochicine sẽ tạo ra bắp chứa ít nhất một lượng nhỏ hạt giống (Chalyk, 1994; Geiger, 2009). Chalyk (1994) đã thống kê trung bình có 27 hạt cho mỗi bắp, với mức cao nhất là 107 hạt. Con số cao hơn được đưa ra bởi Geiger và cs (2006), trung bình là 80 hạt cho mỗi bắp.
Theo dõi và đánh giá các sức sống của các hạt đơn bội sau khi xử lý dựa trên 4 chỉ tiêu: Khả năng sinh trưởng (chủ yếu dựa vào chiều cao) và chống chịu, tính hữa dục đực, hữa dục cái và khả năng tạo bắp chúng tôi thu được kết quả như sau:
- Có 23 cây có khả năng sinh trưởng, phát triển bình thường, hữu dục đực và hữu dục cái (cây được đánh giá là cây đơn bội kép) chiếm 16,20% trên tổng số 142 hạt đem xử lý, chiếm 46% trong tổng số cây 50 cây có khả năng sống sau khi xử lý colchicine.
- Trong số 23 cây có khả năng sinh trưởng, phát triển bình thường thì có 11 cây đơn bội kép có khả năng tạo bắp có hạt (chiếm 47,83%). Số còn lại không có khả năng tạo bắp do nhiều nguyên nhân: (i) do khoảng cách thời gian giữa tung phấn và phun râu là tương đối lớn dẫn đến khi cây phun râu thì không còn phấn để thụ cho cây; (ii) có thu phấn và thụ phấn cho bắp, nhưng bắp tạo thành không có hạt; iii) cây có tung phấn và bắp nhưng bắp không phun râu.
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 56
Hình 3.13. Cây đơn bội và cây đơn bội kép sau khi xử lý Colchicine được đưa
ra ngoài đồng ruộng
Hình 3.14. Ruộng thí nghiệm cây sau khi đã xử lý colchicine
Hình 3.15. Cây đơn bội sau khi xử lý cochicine
Hình 3.16. Cây đơn bội kép sau xử lý colchicine
Hình 3.17. Bông cờ hữu dục của cây đơn bội kép
Hình 3.18. Cây đơn bội và cây đơn bội kép ở giai đoạn trổ bông
Cây đơn bội Cây đơn bội kép
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 57
Hình 3.19. Bông cờ tung phấn của cây đơn bội kép sau khi xử lý colchicine
Hình 3.20. Bông cờ bất dục của dòng đơn bội sau khi xử lý colchicine
Như vậy, tỉ lệ lưỡng bội hóa thành công từ vật liệu hạt ngô đơn bội còn sống tạo cây đơn bội kép có bắp hữu hiệu là 11/50 (đạt 22 %) và tỉ lệ lưỡng bội hóa thành công trong toàn bộ thí nghiệm là 11/142 (đạt 7.75%).
Qua bảng 3.10 cho thấy: Những dòng có khả năng tạo ra cây đơn bội kép và tạo bắp hữu hiệu đó là CUA (2 cây), D19, D26, D34(2 cây), D41, D56, M7 và III.21 (2 cây). Trong đó có 6 dòng CUA, D19, D26, D34, D41 và M7 là thuộc nhóm dòng có từ 6 đời tự thụ trở lên. Riêng Dòng D56 và III.21 thuộc nhóm dòng dưới 3 đời tự thụ. Do đó, có thể thấy rằng các dòng có độ thuần cao (số đời tự thụ >=6 đời) có khả năng tạo cây đơn bội kép cao hơn so với các dòng có độ thuần thấp hơn (số đời tự thụ <3).
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 58
3.4. Đánh giá đặc điểm nông sinh học, khả năng chống chịu và năng suất của các dòng đơn bội kép trong điều kiện vụ Xuân 2014 tại Gia Lâm, Hà Nội
3.4.1. Tỷ lệ nảy mầm và các giai đoạn sinh trưởng của các dòng đơn bội kép
Hạt đơn bội kép của các dòng sau khi thu hoạch đã được sử dụng để trồng và đánh giá khả năng sinh trưởng, phát triển, chống chịu sâu bệnh của các dòng đơn bội kép trong điều kiện vụ Xuân 2014 tại Gia Lâm, Hà Nội.
Kết quả theo dõi, đánh giá về sức sống của hạt và các giai đoạn sinh trưởng của các dòng đơn bội kép được thể hiện chi tiết trong bảng 3.11:
Bảng 3.11. Tỷ lệ nảy mầm và thời gian sinh trưởng của các dòng đơn bội kép trong điều kiện trồng tại Gia Lâm, Hà Nội
TT Kí hiệu dòng Ngày gieo Tỷ lệ nảymầm (%) G-TP (ngày) G-PR (ngày) Chênh lệch TP- PR (ngày) TGST (ngày) 1 CUA.1 x UH400 7/3/2014 100 57 60 3 98 2 CUA.2 x UH400 7/3/2014 100 56 57 1 98 3 D19 x UH400 7/3/2014 100 58 60 2 98 4 D26 x UH400 7/3/2014 100 60 61 1 98 5 D34.1 x UH400 7/3/2014 100 60 63 3 98 6 D34.2 x UH400 7/3/2014 100 57 60 3 98 7 D41 x UH400 7/3/2014 100 54 56 2 98 8 D56 x UH400 7/3/2014 100 57 60 3 98 9 M7 x UH400 7/3/2014 100 58 60 2 98 10 III.21.1 x UH400 7/3/2014 100 55 56 1 88 11 III.21.2 x UH400 7/3/2014 0 0 0 0 0
Qua bảng 3.11 cho thấy, kết quả sau khi gieo trồng trong điều kiện vụ Xuân 2014 tại Gia Lâm- Hà Nội cho thấy các dòng đơn bội kép thu được có sức sống khá cao (tỷ lệ hạt nảy mầm khi gieo đạt 100%) trừ dòng đơn bội kép được tạo ra từ dòng mẹ III.21.2 (tỷ lệ nảy mầm là 0%).
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 59 Thời gian tung phấn - phun râu là giai đoạn quan trọng nhất quyết định đến năng suất của cây ngô. Sau khi bông cờ tung phấn thì bắp ngô bắt đầu phun râu, khoảng cách từ tung phấn đến phun râu càng ngắn thì càng tốt cho quá trình hình thành hạt:
- Thời gian từ gieo đến tung phấn dao động trong khoảng 54-60 ngày. Trong đó dòng đơn bội kép của dòng mẹ D26 và D34.1 là dòng có thời gian từ khi gieo đến tung phấn dài nhất (60 ngày), dòng D41 có thời gian từ khi gieo đến tung phấn ngắn nhất (54 ngày).
- Thời gian từ gieo đến phun râu của các dòng dao động từ 56-63 ngày. Trong đó, thời gian từ gieo đến phun râu của dòng D34.1 là dài nhất (63 ngày) và ngắn nhất là của dòng D41 và III.21.1 (56 ngày).
- Chênh lệch thời gian giữa tung phấn và phun râu của các dòng đơn bội kép là tương đối ngắn, dao động trong khoảng từ 1-3 ngày. Khoảng cách này là tương đương so với kết quả thu được ở dòng bố UH400 và khoảng cách trung bình của các dòng mẹ. Khoảng cách ngắn nhất là của dòng D26 và III.21.1 với 1 ngày, khoảng cách dài nhất là của dòng CUA.1, D34 và D56 là 3 ngày. Tuy nhiên, đây vẫn là thời gian nằm trong khoảng chênh lệch cho phép có lợi cho việc tạo hạt, góp phần nâng cao năng suất của các dòng đơn bội kép.
Kết quả theo dõi cho thấy, trong điều kiện vụ Xuân 2014 ở miền bắc, tổng thời gian sinh trưởng trung bình của các dòng là như nhau với thời gian sinh trưởng là 98 ngày. Duy chỉ có dòng III.21.1 là dòng có thời gian từ khi gieo đến khi bắp chín là khá ngắn với 88 ngày. Thời gian sinh trưởng của các dòng đơn bội kép nằm ở giữa thời gian sinh trưởng của dòng bố UH400 (với trung bình 89 ngày) và các dòng mẹ (dao động trong khoảng từ 98-116 ngày). Sự sinh trưởng trong thời gian ngắn của các dòng đơn bội kép sẽ làm giảm công chăm sóc và chi phí sản xuất hơn so với các giống địa phương khác.
3.4.2. Đặc điểm nông sinh học của các dòng đơn bội kép
Kết quả theo dõi đặc điểm hình thái của các dòng đơn bội kép thí nghiệm được thể hiện qua bảng 3.12:
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 60
Bảng 3.12. Một số đặc điểm nông sinh học của các dòng đơn bội kép trong điều kiện vụ Xuân 2014 tại Gia Lâm, Hà Nội
Ký hiệu dòng Chiều cao cây (cm) CV % Chiều cao đóng bắp (cm) CV % TL CĐB/CC (%) Số lá thật Màu sắc gân,