Nghiên cứu tạo dòng ngô kháng thuốc trừ cỏ bằng phương pháp chuyển gen thông qua vi khuẩn AGROBACTERIUM

TRƯỜNG ĐẠI HỌC sư PHẠM HÀ NỘI KHOA SINH - KTNN TRẦN THỊ THANH DIỆP NGHIÊN CỨU TẠO DÒNG NGÔ KHẢNG THUỐC TRỪ CỎ BẰNG PHƯƠNG PHÁP CHUYỂN GEN THÔNG QUA VI KHUẨN AGROBACTERIUM KHÓA LUÂN TÓT NGHIÊP ĐAI HOC •••• Chuyên ngành: Di truyền học Người hướng dẫn khoa học TS. PHẠM THỊ LÝ THU HÀ NỘI - 2015 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan công trình nghiên cứu riêng tôi, có hỗ trợ từ giáo viên hướng dẫn TS. Phạm Thị Lý Thu. Các nội dung nghiên cứu kết đề tài trung thực chưa công bố công trình nghiên cứu trước đây. Những số liệu bảng phục vụ cho việc phân tích , nhận xét, đánh giá tác giả nghiên cứu có ghi nhật kí thí nghiệm bảng theo dõi thí nghiệm hàng ngày trình thực tập. Ngoài ra, đề tài sử dụng số nghiên cứu, nhận xét, đánh số liệu tác giả, quan, tổ chức khác thể phần tài liệu tham khảo. Nếu phát có gian lận xin hoàn toàn chịu trách nhiệm trước Hội đồng, kết luận văn mình. Hà Nội, ngày . tháng .năm 2015 Tác giả Trần Thị Thanh Diệp LỜI CẢM ƠN Qua thời gian học tập Viện Di truyền Nông nghiệp, học hỏi nhiều kiến thức chuyên môn, kĩ thực hành làm việc. Để có kiến thức kết ngày hôm nay, trước tiên xin bày tỏ lòng kính trọng biết ơn sâu sắc đến Ban lãnh đạo Viện Di truyền Nông nghiệp, Phòng thí nghiệm trọng điểm Công nghệ tế bào thực vật, đặc biệt TS. Phạm Thị Lý Thu người tận tình bảo, hướng dẫn cho kiến thức chuyên môn, kĩ thực tế, mở mang nâng cao kiến thức để hoàn thành khóa luận cách tốt nhất. Cùng với giúp đỡ tận tình cán khoa học Phòng thí nghiệm trọng điểm công nghệ tế bào thực vật tạo điều kiện thuận lợi cho có môi trường học tập làm việc tốt. Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới thầy, cô khoa Sinh- KTNN, trường Đại học sư phạm Hà Nội tạo điều kiện giúp đỡ suốt trình thực tập. Cuối xin gửi lời biết ơn chân thành tới gia đình bạn bè, người động viên giúp đỡ trình thực tập vừa qua. Trong trình thực tập viết khóa luận, thời gian thực đề tài hạn chế nên không tránh khỏi sai sót. Vì vậy, mong nhận đóng góp thày cô giáo, bạn bè để giúp hoàn thành tốt khóa luận này. Hà Nội, ngày . tháng .năm 2015 Tác giả Tràn Thị Thanh Diệp Hình 1.1. Phản ứng tổng hợp EPSP từ S3P PEP xúc tác enzyme Bảng 1.1. Các gen sử dụng tạo ngô chuyển gen mang đặc tính chống 2,4-D :Dichlophenoxy acetic acid DNA :Deoxiribonucleic acid AS :Acetosyringone CIMMYT : The International Maize and Wheat Improvement Center - Trung tâm cải tiến ngô lúa mỳ quốc tế cs : Cộng CTAB : Cetyl trimetylammonium bromua EPSP : 5-enolpyruvylshikimate 3-phosphate EPSPS : Enzyme 5-enolpyruvylshikimate synthase Hpt :Hygromycin phosphotransferase L-PPT :L-phosphinothricin Pat/bar :Gen mã hoá cho enzym phosphinothricin acetyl transferase (PAT). 3-phosphate PCR : Polymerase Chain Reaction- phản ứng PCR PEP : Phosphoenolpyruvate S3P : 3-phosphate-shikimate T-DNA : Tumor indosing plasmid= Plasmid gây khối u thực vật TCN : Trước công nguyên Vir : Virulence Region= Vùng gây độc MỤC LỤC MỞ ĐẦU 1. Lí chọn đề tài Ngô ba lương thực quan trọng giới (cùng với lúa mì gạo) lương thực có vai trò kinh tế quan trọng bậc nhất. Tính đến năm 2012 diện tích trồng ngô giới vào khoảng 159 triệu (FAO, 2013). Theo dự đoán vào năm 2020, nhu cầu ngô tăng lên 50% với 852 triệu năm vượt qua gạo lúa mì (Pingali Padney, 2010). Hiện ngành sản xuất ngô giới nói chung nước ta nói riêng phải đối mặt với nhiều vấn đề như: khí hậu biến đổi phức tạp, hạn hán, lũ lụt ngày nặng nề hơn, đặc biệt cỏ dại vấn đề lớn nông nghiệp làm giảm suất trồng từ 10 - 15%. Do đó, hàng loạt biện pháp phòng trừ cỏ dại áp dụng như: sử dụng thuốc diệt cỏ chọn lọc không chọn lọc. Đặc biệt vùng có tượng xói mòn đất, thuốc diệt cỏ sử dụng giải pháp để loại trừ cỏ dại. Tuy nhiên, việc lạm dụng số thuốc diệt cỏ có độc tính cao gây hậu nghiêm trọng môi trường, hệ sinh thái sức khỏe người. Điều đặt nhiệm vụ to lớn cho nhà chọn giống, nhà nghiên cứu công nghệ sinh học chọn tạo giống ngô cho suất cao, mang đặc tính kháng thuốc diệt cỏ. Các giống trồng biến đổi gen mang đặc tính khác nghiên cứu áp dụng vào thực tiễn nhằm nâng cao suất trồng, tăng thu nhập cho người lao động. Hàng năm, số lượng nông dân quốc gia trồng trồng biến đổi gen liên tục gia tăng. Cây ngô chuyển gen thương mại hóa vào năm 1996, đến năm 2012 diện tích trồng ngô biến đổi gen đạt 55,1 triệu 11 nước, có nước trồng triệu bao gồm: Hoa Kỳ (34,1 triệu ha), Brazil (12,1 triệu ha), Argentina (3,3 triệu ha), Nam Phi (2,4 triệu ha) Canada (1,6 triệu ha). Nước có sản lượng tăng cao vào năm 2012 Brazil (3 triệu ha). Ngô chuyển gen kháng thuốc diệt cỏ giống trồng ưu thế, chiếm 7,8 triệu tương đương với 5% diện tích trồng chuyển gen toàn cầu trồng nước. Ở Việt Nam, thời gian gần đây, nghiên cứu biến nạp gen vào loài trồng quan tâm, ý nhiều hơn, với đối tượng ngô, nói loài trồng tương đối khó tính trình nuôi cấy invitro chuyển nạp gen, hiệu biến nạp gen thấp. Mặt khác, việc tạo trồng chuyển gen có khả áp dụng vào sản xuất từ nghiên cứu nước đòi hỏi cấp thiết lĩnh vực nghiên cứu công nghệ sinh học ngành nông nghiệp Việt Nam. Mặt khác, kháng thuốc diệt cỏ nhân tạo đặc điểm thường sử dụng nhiều thực vật biến đổi gen, ngô chuyển gen mang đặc tính kháng thuốc diệt cỏ quan tâm nghiên cứu. Việc chuyển gen vào ngô nâng cao tính chọn lọc hiệu kinh tế thuốc diệt cỏ làm giảm ảnh hưởng thuốc quần thể sinh vật đất. Xuất phát từ yêu cầu thực tiễn dựa sở lý luận khoa học nêu trên, tiến hành đề tài “Nghiên cứu tạo dòng ngô kháng thuốc trừ cỏ phương pháp chuyển gen thông qua vi khuẩn Agrobacterium 2. Mục đích nghiên cứu - Biến nạp gen kháng thuốc trừ cỏ CP4 EPSPS vào số dòng ngô chọn lọc. - Phân tích sinh học phân tử PCR có mặt gen kháng thuốc trừ cỏ CP4 EPSPS dòng ngô chuyển gen tái sinh. - Đánh giá khả kháng thuốc trừ cỏ glyphosate dòng ngô chuyển gen CP4 EPSPS điều kiện nhà lưới. 3. Ý nghĩa khoa học ý nghĩa thực tiễn - Ý nghĩa khoa học: Kết nghiên cứu cung cấp dẫn liệu khoa học khả tiếp nhận gen kháng thuốc trừ cỏ số dòng ngô thông qua vi khuẩn Agrobacterỉum. - Ý nghĩa thực tiễn: Kết nghiên cứu đề tài tạo sở cho nghiên cứu tạo dòng/ giống ngô chuyển gen kháng thuốc trừ cỏ áp dụng vào thực tiễn sản xuất. CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1.Nguồn gốcphân loại vai trò ngố 1.1.1. Nguồn gốc phân loại ngô Phân loại khoa học: Ngô thuộc: Loài: Zea mays .L Chi : Maydeae Họ: Poaceae (hòa thảo) Bộ: Poaỉes (Hòa thảo) Lớp: Monocotyledons (Một mầm) Ngành: Angiospermatophyta (Hạt kín) Ngô, tiếng Anh “maize” xuất phát từ tiếng Tây Ban Nha (maíz) thuật ngữ tiếng Taino để loài này, từ thông dụng Vương quốc Anh để ngô. Tại Hoa Kỳ, Canada Australia, thuật ngữ hay sử dụng corn, từ trước dùng để gọi cho loại lương thực. Hiện nay, thuật ngữ dùng để ngô, dạng rút gọn "Indian com" “cây lương thực người Anh điêng”. Lịch sử nghiên cứu thuộc lĩnh vực khảo cổ, di truyền học, thực vật học, dân tộc học địa lý học .quan tâm đưa nhiều giả thuyết. Có giả thuyết cho nguồn gốc ngô khoảng năm 5.500 tới 10.000 trước công nguyên (TCN). Những nghiên cứu di truyền học gần cho trình hóa ngô diễn vào khoảng năm 7000 TCN miền trung Mexico tổ tiên loại cỏ teosinte hoang dại gần giống với ngô ngày mọc lưu vực sông Balsas. Liên quan đến khảo cổ học, người ta phát bắp ngô có sớm hang Guila Naquitz thung lũng Oaxaca, có niên đại vào khoảng năm 4.250 TCN, bắp ngô cổ hang động gần Tehuacan, Puebla, có niên đại vào khoảng 2750 TCN. Một số giả thuyết cho rằng, có lẽ sớm khoảng năm 1500 TCN, ngô bắt đầu phổ biến rộng nhanh. Ngô lương thực phần lớn văn hóa tiền Columbus Bắc Mỹ, Trung Mỹ, Nam Mỹ khu vực Caribe (Ganinat, 1997). 1.1.2. Vai fro ngô Cây ngô lương thực quan trọng đứng thứ ba giới (sau lúa mỳ lúa gạo) đứng thứ hai Việt Nam (sau lúa). Ngô trồng rộng rãi toàn giới, với tổng sản lượng hàng năm lớn loại ngũ cốc khác. Hoa Kỳ sản xuất khoảng 40% tổng sản lượng ngô giới, sau Hoa Kỳ nước Trung Quốc, Brazil, Mexico, Indonesia, Ấn Độ, Pháp Argentina. Chỉ tính riêng năm 2009, tổng diện tích trồng ngô toàn cầu 159 triệu ha, đạt sản lượng 817 triệu tấn, nhiều gạo (678 triệu tấn) lúa mì (682 triệu tấn) (FAO, 2009). Ngô loại lương thực nuôi sống gần 1/3 số dân toàn giới. Ngô có số vai trò chính: - Là nguồn có giá trị dinh dưỡng: Ngô có chứa chất protein (10,6%), lipid (4-5%), glucid (69%), hàm lượng vitamin ngô cao, tập chung chủ yếu lớp hạt ngô mầm. - Làm lương thực, thực phẩm cho người: Cây ngô ba trồng quan trọng sử dụng làm thức ăn cho người gia súc. Toàn giới sử dụng 17% sản lượng ngô làm lương thực cho người nước phát triển 30%, nước phát triển khoảng 40%. Các nước Trung Mỹ, Nam Á Châu Phi sử dụng ngô làm lương thực chính. Khẩu phàn ăn nước châu Mỹ La Tinh bánh ngô, đậu đỗ ớt giống nước châu Á sử dụng cơm (gạo), cá, rau xanh nước châu Âu sử dụng bánh mỳ, khoai tây, sữa. - Ngô làm thức ăn chăn nuôi: Theo số liệu thống kê CIMMYT, giai đoạn 1997 - 1999, giới dùng ngô làm thức ăn chăn nuôi 66% - khoảng 400 triệu tấn/năm. Các nước phát triển có tỷ lệ dùng ngô làm thức ăn nuôi cao, thường 70%. Hiện nay, Việt Nam dùng ngô làm thức ăn chăn nuôi (khoảng 90%) song tỷ lệ ngô tổng số chất tinh khoảng 50%, ta dùng thêm gạo gẫy, cám, bột sắn Từ ngô hạt xay vỡ nuôi gia cầm (gà, vịt, ngan, ngồng .), nghiền thành bột chế biến làm thức ăn cho trâu bò, lợn gia cầm, chế biến thức ăn cho cá. Thân ngô cho trâu bò ăn tươi, sau thu hoạch (nhất ngô thu bắp non) băm nhỏ ủ chua làm thức ăn cho gia súc. Giá trị dinh dưỡng thân, ngô lớn, phụ thuộc vào giống ngô thời vụ thu hoạch. Trong kg thân ngô có 600 - 700 g chất khô, 60 - 70 g protein, 280 - 300 g xơ. Do vậy, thân, ngô nguồn thức ăn thô quan trọng cho trâu bò nhiều vùng. Giá trị dinh dưỡng thân, ngô tăng lên chế biến theo cách lên men ủ chua. - Làm nguyên liệu cho số ngành công nghiệp: Ngô sử dụng làm nguyên liệu cho số ngành công nghiệp: sản xuất thức ăn gia súc, sản xuất rượu cồn, tinh bột dầu, glucose, bánh kẹo . Trong thành phàn khối lượng hạt ngô, tinh bột chiếm tỷ lệ 65-83% nguồn nguyên liệu quan trọng công nghiệp gia công tinh bột. Nguồn tinh bột sử dụng phổ biến công nghiệp chế biến loại đường: sản xuất glucose dùng sản xuất bánh kẹo, công nghiệp keo dán, sản xuất xăng sinh học, chế biến đồ giải khát, bia, rượu. 1.2.Các phương pháp chuyển gen thực vật Có nhiều phương pháp chuyển gen vào thực vật hai phương pháp áp dụng rộng rãi có giá ừị thực tiễn, chuyển gen vào hàng loạt trồng khác nhau, là: - Chuyển gen gián tiếp thông qua vi khuẩn A. tume/aciens - Chuyển gen trực tiếp 1.2.1. Chuyển gen gián tiếp thông qua vi khuẩn Agrobacterium tume/aciens 1.2.1.1 Hệ thong chuyển gen in vitro Khó khăn việc xây dựng hệ thống chuyển gen in vitro phải có kết hợp xâm nhiễm A. tume/aciens khả tái sinh tế bào sau lây nhiễm với vi khuẩn. Một số trợ giúp kỹ thuật trình biến nạp cải thiện hiệu hệ thống chuyển gen in vỉtro nhờ A. tume/aciens bao gồm: • Xử lỷ sóng siêu âm Xử lý mô thực vật với A. tumefaciens điều kiện sóng siêu âm tạo tổn thương nhỏ, đồng mô thực vật, cho phép Agrobacterium dễ dàng xâm nhập vào tế bào thực vật. Bằng phương pháp cải thiện rõ rệt hiệu chuyển gen, biểu gus tạm thời tăng từ 100-1400 lần tế bào đậu tương, đậu đũa, vân sam trắng, gen EPSPS hệ gen thực vật. Chúng tiến hành phản ứng PCR thể tích phản ứng 20 |J.1, sử dụng Taq DNA polymerase (Fermentas) với 35 chu kỳ. Thành phần, nồng độ chất tham gia phản ứng PCR theo bảng 2.4. Để nhân gen CP4 EPSPS sử dụng cặp mồi CP4-EPSPS đặc hiệu cho gen CP4 EPSPS mã hoá cho khả kháng thuốc trừ cỏ glyphosate. Chương trình phản ứng với cặp mồi CP4-EPSPS 95°c - phút, 95°c - phút, 51°c - 30 giây, 72°c - lphút, lặp lại 35 chu kỳ, 72°c - 10 phút, kết thúc 4°c. Sản phẩm PCR kiểm tra điện di gel agarose 1% 100 mV nhuộm ethidium bromide để quan sát vạch DNA. Bảng 2.3. Trình tự đoạn mồi sử dụng phản ứng PCR T Đoạn mồi Trình tự mồi T CP4-EPSPS - F 5’- ATGGC ACAAA TTAAC AACAT GGCAC-3’ CP4-EPSPS- R 5’- GCCCA TTTCG CGCAG CGGGT TCAAC-3’ Bảng 2.4 Thành phần phản ứng PCR gen EPSPS Thành phần Buffer+KCl-MgC12 Thể tích (jxl) MgC12 1.6 dNTP (2nM) PrimerF (lOpM) 0.5 PrimerR (lOpM) 0.5 Taq polymerase 0.2 DNA H20 12.2 Tổng thể tích phản ứng 2.2.4. 20 Thử khả kháng thuốc trừ cỏ chuyển gen điểu kiện nhà lưới Các dòng ngô chuyển gen kháng thuốc trừ cỏ sau tái sinh chuyển đất trồng. Khi giai đoạn có lá, tiến hành thử khả kháng thuốc trừ cỏ cách phun dung dịch Vifosate có chứa glyphosate 200 mg/1 0,1% Tween 20 (v/v) chuyển gen EPSPS. Phun lên chuyển gen không chuyển gen (đối chứng), ngày phun lần, phun lần (Brettschneider & cs., 1997). Quan sát theo dõi mức độ kháng thuốc trừ cỏ chuyển gen đối chứng (cây bình thường không chuyển gen) sau 10 ngày phun. 2.2.5. Phương pháp thu thập sổ liệu thống kê Các phôi non cấy với mật độ 25 phôi/đĩa Petri 10 cm. Cứ 2-3 tuần sau phôi non mô sẹo cấy chuyển sang môi trường ECM/SM, mô sẹo phôi hoá tạo thảnh tái sinh đếm. Các thông số sau quan tâm để đánh giá hiệu trinh nuôi cấy: Số mô sẹo tạo thành Tỷ lệ tạo mô sẹo (%) = ----------------------------------Tổng số phôi nuôi cấy Số tái sinh Tỷ lệ tái sinh (%) = ---------------------------------Tổng số mô sẹo phôi hoá Số sống Tỷ lệ sống đưa đất (%) =----------------------------------Tổng số tái sinh Số hữu thụ Tỷ lệ hữu thụ (%) = ---------------------------------Tổng số sống Để xác định hiệu chuyển gen bền vững thí nghiệm biến nạp vào phôi non, đánh giá tiêu sau: Số chuyển gen bền vững Tần số chuyển gen (STF) (%) = -----------------------------Tổng số phôi biến nạp Các số liệu thu xử lý phương pháp thống kê theo Chương trình phần mềm Excel 5.0. CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1.Nghiên cứu đánh giá khả tiếp nhận gen CP4 EPSPS dòng ngô Việt Nam Tổng số thí nghiệm với 3400 phôi dòng ngô sử dụng làm vật liệu chuyển gen. Kết trình bày bảng 3.1. Bảng 3.1. Kết biến nạp gen CP4 EPSPS vào dòng ngô CM8 VH1 T Dòng Số lượng mẫu (phôi) Tỉ lệ tạo Tỉ lệ tái T ngo mô sẹo sinh chồi CM8 VH1 Tổng số Số Số câ sống y sót CC M Re M EC M Se M R M (%) 160 180 340 99 90 19 00 805 31 18 49 14 10 24 80,66 38,51 44 đấ 20 66,96 29.80 40 18 84 38 604 140 (%) So sánh mức độ tiếp nhận gen dòng ngô thí nghiệm dễ dàng nhận thấy tỷ lệ tạo mô sẹo chuyển gen dòng ngô CM8 (đạt 80,66%) cao so với dòng VH1 (đạt 66,96%). Xét tỷ lệ tái sinh chồi chuyển gen dòng cho thấy: dòng CM8 cho tỷ lệ tái sinh cao hơn, đạt 38,51%. Dòng VH1 có tỷ lệ tạo mô sẹo thấp cho tỷ lệ tái sinh chồi thấp, đạt 29.80%. Đánh giá khả sống sót tái sinh, nhận số chuyển gen tái sinh dòng CM8 sống sót 20 dòng VH1 18 cây. Các chuyển gen tái sinh chuyển đất, trồng nhà lưới, hầu hết ngô có kiểu hình bình thường so với đối chứng không chuyển gen có khoảng 80% số chuyển gen tái sinh có khả tạo hạt phương pháp tự thụ phấn tay. Quá ừình biến nạp thu nhân chuyển gen tái sinh dòng VH1 mô tả hình 3.1 đây. Hình 3.1. Các giai đoạn trình chuyển gen EPSPS vào dòng ngô VH1 thu nhân chuyển gen tái sinh Chú thích: 1. Đồng nuôi cấy phôi non với Agrobacterium 2. Nuôi cấy phục hồi 3. Tạo mô sẹo môi trường chọn lọc 4. Tái sinh chòi môi trường chọn lọc 5. Tái sinh hoàn chỉnh mồi trường chọn lọc 6,7.Chuyển đất 8. Bắp chuyển gen TO dòng VH1 Các ngô chuyển gen tái sinh hữu thụ thu mẫu tiến hành phân tích để đánh giá có mặt gen chuyển. 3.2 Phân tích sinh học phân tử PCR có mặt gen CP4 EPSPS dòng ngô chuyển gen. 3.2.1. Kết tách chiết ĐNÂ tổng sổ từ dòng ngô chuyển gen Chúng tiến hành tách chiết DNA tổng số từ dòng ngô chuyển gen hệ TO, sử dụng phương pháp CTAB (Saghai - Maroof & cs., 1984) có cải tiến. Mẩu DNA sau tách chiết kiểm ưa phương pháp điện di gel agarose 0,8% để đánh giá mức độ tinh nguyên vẹn DNA. V * ■ h r JI * »Ma/ u*; LJ < uJ bu/ L«_J u—I LJ I Hình 3.2. Kết điện di kiểm tra mẫu DNA tổng số gel agarose 0,8% ■ Kết điện di cho thấy: Chất lượng DNA tổng số tách từ mẫu tương đối tốt. DNA đạt độ tinh không bị đứt gãy. Mặt khác không thấy xuất cácvết sáng RNA phía dưới, điều chứng tỏ RNA loại bỏ hoàn toàn khỏi dịch chiết DNA. Dựa giá ứị OD260 cho thấy hàm lượng DNA thu cao. Sản phẩm DNA tổng số dòng ngô chuyển gen sử dụng DNA khuôn cho phân tích PCR. 3,2,2, Kết phân tích PCR chuyển gen Những chuyển gen tái sinh sau chuyển đất sống sót chúng tồi tiến hành thu mẫu để tách chiết DNA phục vụ cho phân tích PCR. Sử dụng cặp mồi CP4 EPSPS F; CP4 - EPSPS R với thành phần chu trình mô tả phần vật liệu phương pháp, thu kết sau: Bảng 3.2. Kết phân tích PCR gen EPSPS dòng ngô chuyển gen T T Dòng ngô Tổng số SỐ dương tính với PCR CM8 phân tích 20 VH1 18 Tổng 38 Từ kết bảng 3.2. cho thấy: tổng số 38 chuyển gen kháng tái sinh phân tích, có có kết PCR dương tính với gen EPSPS. Trong đó, dòng CM8 có 5/20 cây, dòng VHlcó 1/18 dương tính. 644b p Hình 3.3. Kết phân tích PCR gen EPSPS chuyển gen tái sinh dòng CM8 Ghi chủ: M: Marker kb (Fermentas) P: đối chứng dương (DNA plasmid pBI 121 mang gen EPSPS) CM8: đối chứng âm (Cây CM8 không chuyển gen) H20: mẫu nước 77E; 55E; 53Ea; 53Eb; 12E: Các chuyển gen dòng CM8 có mang gen EPSPS 6E; 81E; 79E: Các chuyển gen dòng CM8 không mang gen EPSPS ^ ự £ > 644 bp Hình 3.4. Kết phân tích PCR gen EPSPS chuyển gen tái sinh dòng VH1 Ghi chủ: M: Marker kb (Fermentas) P: đối chứng dương (DNA plasmid pBI 121 mang gen EPSPS) VH1: đối chứng âm (Cây VH1 không chuyển gen) 112E: Cây chuyển gen dòng VH1 mang gen EPSPS Dựa ừên kết chuyển gen phân tích PCR thực đánh giá hiệu chuyển gen thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumeýaciens. Ket thể 4 bảng 3.3. Bảng 3.3. Hiệu chuyển gen thông qua vi khuẩn Agrobacterỉum tumeỷacỉens Dòng Số phôi Callus tạo Số chồi Số tái Số có ngô lây thành tái sinh sinh hoàn PCR dương nhiễm môi trường môi chỉnh (A) chọn lọc trường môi trường chọn lọc 20 CM8 1600 310 chọn lọc 143 VH1 1800 180 104 Tông sô 3400 490 147 tính (B) Tần số chuyển gen (%) (B/A) 0,31 18 0,05 38 0,17 Trong số 38 tái sinh từ callus tạo thảnh môi trường chọn lọc (có bổ sung kanamycin) dòng ngô VH1, CM8 kiểm tra có mặt gen EPSPS PCR thu dương tính với băng DNA có kích thước 644 bp tương ứng với gen EPSPS. Các âm tính với PCR tái sinh từ callus không mang gen sống sót môi trường chọn lọc callus chuyển gen gen chuyển không kết hợp vào genome tái sinh. Trong số dòng ngô chuyển gen (CM8, VH1), dòng CM8 có tần số chuyển gen cao (đạt 0,31%), dòng VH1 có tần số chuyển gen thấp (đạt 0,05%). 3.3.Đánh giá khả kháng thuốc trừ cỏ glyphosate dòng ngô chuyển gen CP4 EPSPS điều kiện nhà lưới Ở đa số loài trồng cỏ dại khả kháng với glyphosate. Tính tự kháng với glyphosate tìm thấy nuôi cấy mô số loài thực vật. Đe tạo chuyển gen kháng thuốc diệt cỏ, người ta càn gen mã hóa cho protein, protein làm bất hoạt thuốc diệt cỏ, thay đổi vị trí tác động thuốc tế bào, làm thuốc không gây hại. Cơ chế kháng thuốc diệt cỏ không chọn lọc Glyphosate giải thích sau: Thuốc diệt cỏ glyphosate đình đặc hiệu enzyme 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate- synthase (EPSP-synthase). Đây enzyme cần thiết thực vật để tổng hợp amino acid thơm (phenylalanin, tryptophan tyrosin), số vitamin hợp chất có nguồn gốc thứ cấp. Enzyme người động vật, glyphosate không độc người. Glyphosate phân giải đất nhờ vi sinh vật không để lại sản phẩm độc hại nào. Kháng glyphosate chế khác nhau: - Thứ có biểu mạnh mẽ enzyme EPSP-synthase điều khiển promoter CaMV-35S đồng thời tạo nên enzyme oxidoreductase vi khuẩn. Nhờ enzyme oxidoreductase mà thuốc bị bất hoạt với lượng lớn EPSP-synthase tạo nên lượng thuốc lại gây hại biến đổi gen. Ở gen cần thiết, gen oxidoreductase thực vật. - Một khả thứ hai sử dụng EPSP-synthase vi khuẩn. Từ vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens (loài CP4), EPSP-synthase vi khuẩn phân lập thay đổi trình tự amino acid nên enzyme không mẫn cảm với glyphosate sử dụng nhiều trồng thương mại. Thứ ba xuất dạng đột biến EPSP-synthase ừồng có khả kháng glyphosate. Đột biến xảy EPSP-synthase làm cho kháng thuốc diệt cỏ glyphosate. Sự kết hợp glyphosate vào enzyme EPSP-synthase loại hình bình thường làm hoạt tính xúc tác hạn chế di chuyển enzyme vào lục lạp. Tóm lại chế hoạt động protein CP4 EP SPS mô tả sau: Ở ngô thông thường, phun thuốc trừ cỏ glyphosate, chất glyphosate gây chết ngô thông qua việc ức chế hoạt động enzyme EPSPS nội sinh. Kết ngô khả tổng hợp hợp chất thơm cần thiết (Steinrucken, 1980) trình sinh tổng hợp auxins, hợp chất kháng bệnh, phytoalexins, axit folic, tiền chất lignin, flavonoids, plastoquinone hàng loạt hợp chất phenol alkaloid khác bị kìm hãm. Dựa chế tác động enzyme EPSPS, tiến hành đánh giá khả kháng thuốc diệt cỏ glyphosate chuyển gen. Các chuyển gen tái sinh chuyển trồng đất. Khi đạt - tiến hành đánh giá khả kháng thuốc diệt cỏ glyphosate. Dựa kết trước sàng lọc chuyển gen phương pháp hóa sinh nhóm nghiên cứu, chúng tiến hành phun thuốc trừ cỏ Vifosat 2% (thuốc cỏ chứa glyphosate nồng độ 200mg/l) lên chuyển gen đối chứng. Mỗi phun làn, phun cách ngày. Ket thể bảng 3.4. Bảng 3.4. Đánh giá khả kháng thuốc trừ cỏ glyphosate dòng ngô chuyển gen T Gen T chuyển EPSPS Dòng ngô hệ TO Tổng số phun Số sống sót sau CM8 20 lần phun VH1 18 Đôi chứng (CM8) Đôi chứng (VH1) Kết thu cho thấy có khác biệt rõ rệt dòng đối chứng (không chuyển gen) dòng ngô chuyển gen EPSPS kháng thuốc trừ cỏ. Các đối chứng sau lần phun có tượng vàng lá, héo chết. Trong dòng chuyển gen có (1 thuộc dòng VH1, dòng CM8) có khả kháng rõ rệt, sống sót sinh trưởng, phát triển bình thường sau lần phun thuốc Vifosate với nồng độ glyphosate 200 mg/1 (Hình 3.5.)6 ngô chuyển gen thuộc dòng CM8 VH1 có khả kháng thuốc trừ cỏ Viíosate có kết phân tích PCR dương tính cho gen EPSPS. Như bước đàu khẳng định gen CP4 EPSPS chuyển vào hệ gen biểu hoạt tính gen chuyển ngô. Hình 3.5. Các ngô dòng CM8 sau ngày phun Vifosat 2% CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1.Kết luận 1. Nghiên cứu biến nạp gen EPSPS vào dòng ngô VHlvà CM8 thu 38 tái sinh sống sót đưa đất, có 18/40 thuộc dòng VH1; 20/44 thuộc dòng CM8. Các chuyển gen sinh trưởng, phát triển tốt có kiểu hình bình thường so với đối chứng không chuyển gen. 2. Phân tích sinh học phân tử PCR 38 chuyển gen tái sinh xác định có mặt gen EPSPS ngô dòng CM8 ngô dòng VH1 chuyển gen với băng DNA có kích thước 640 bp tương ứng với gen EPSPS. 3. Bước đầu xác định hiệu chuyển gen dòng ngô Việt Nam CM8 VH1, dòng CM8 có tàn số chuyển gen cao (đạt 0,31%) so với dòng VH1 (đạt 0,05%). 4. Đã thu chuyển gen dòng CM8 chuyển gen dòng VH1 có khả kháng thuốc trừ cỏ glyphosate sau lần phun Viíosat nồng độ 2%. 4.2.Kiến nghị Tiếp tục đánh giá ổn định gen chuyển EPSPS dòng ngô chuyển gen thu hệ để thu nhận dòng chuyển gen bền vững phục vụ công tác chọn giống ngô chuyển gen chịu thuốc trừ cỏ. TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT 1. Nguyễn Đức Thành, 2003, Nuôi cấy mô tế bào- nghiên cứu ứng dụng, Nxb Nông nghiệp. 2. Phạm Thị Lý Thu, Lê Huy Hàm, Đỗ Năng Vịnh (2003) Đánh giá khả sinh trưởng, phát triển tái sinh từ phôi non hai dòng ngô nhập nội HR8, HR9 điều kiện Việt Nam. Tạp chí nông nghiệp PTNT, số 9, tr. 726- 729. 3. Phạm Thị Lý Thu, Lê Huy Hàm, Đồ Năng Vịnh (2005) Ảnh hưởng số yếu tố đến hiệu chuyển gen ngô thông qua vi khuẩn A.tumefaciens. Tạp chí Nông nghiệp Phát triển Nông thôn, số 10, tr. 28-31. 4. Phạm Thị Lý Thu, Lê Huy Hàm, Đỗ Năng Vịnh (2006) Hoàn thiện quy trình chuyển gen ngô sủng bẳn gen. Tạp chí Nông nghiệp Phát triển Nông thôn, Số 8, tr. 31-35. 5. Phạm Thị Lý Thu, Phạm Minh Thợi, Lê Huy Hàm, Đồ Năng Vịnh (2003) Nghiên cứu xây dựng hệ thong tái sinh sử dụng cho biến nạp gen ngô. Kỷ yếu hội nghị CNSH toàn quốc 2003, tr. 820-824. 6. Phạm Thị Lý Thu (2007), “Nghiên cứu xây dựng hệ thong tái sinh từ phôi non xác định phương pháp chuyển gen thích hợp ngô”, Luận án Tiến sĩ Sinh học, Viện Công nghệ Sinh học, Viện Khoa học Công nghệ Việt Nam. 7. Ngô Hữu Tình (2009) Chọn lọc lai tạo giống ngô. Nhà xuất Nông nghiệp, Hà Nội. 8. Nguyễn Thị Khánh Vân, Lê Huy Hàm, L.M. Dung, Đỗ Năng Vịnh (2005). Bước đầu nghiên cứu nuôi cấy noãn ngô chưa thụ tinh thông qua mô nuôi. Tạp chí Nông nghiệp Phát triển nông thôn, số 18-2005, tr.20 - 22. TÀI LIỆU TIẾNG ANH 9. Armstrong CL, Parker GB and Pershing JC (1995) Field evaluation of European corn borer control in progeny of 173 transgenic corn events expressing an insecticidal protein from Bacillus thuringiensis. Crop Sci. 35: 550-557. 10. Bentley R (1990). The shikimate pathway: a metabolic tree with many branches. CRC Crit Rev Biochem Mol Biol 25:307-384. 11. Brettschneider R, Becker D, Lorz H (1997) Efficient transformation of scutellar tissue of immature maize embryos. Theor Appl Genet 94:737-748. 12. Chan MT, Chang HH, Ho SL, Tong WF, Yu SM (1993) A.tumefaciens- mediated production of transgenic rice plants expressing a chimeric alpha-amylase promoter/betaglucuronidase gene. Plant Mol Biol 22: 491-506. 13. ChengM, Lowe BA, Spencer TM, Ye X, Armstrong CL (2004) Factors influencing Agrobacterium-mediated transformation of monocotyledonous species In Vitro Cell Dev Biol Plant 40:31-45. 14. Cheng, M. & CS. (1997) Genetic transformation of wheat mediated by Agrobacterium tumefaciens. Plant Physiol. 115, 971-980. 15. Clemente, T.E., LaValle, B.J., Howe, A.R., Conner-Ward, D., Rozman, R.J., Hunter, P.E., Broyles, D.L., Kasten, D.S., Hinchee, M.A. (2000). Progeny analysis of glyphosate selected transgenic soybeans derived from Agrobacteriummediated transformation. Crop Sei. 40, 797-803. 16. Eschenburg S, Healy ML, Priestman MA, Lushington GH, Schonbrunn E (2002) How the mutation glycine 96 to alanine confers glyphosate insensitivity to 5enolpyruvyl shikimate-3-phosphate synthase from Escherichia coli. Planta 216: 129-135 . 17. FAOSTAT : www.faostat.fao.org. 18. Frame BR, Shou H, Chikwamba HRK, Zhang Z, Xiang C, Fonger TM Pegg SEK, Li B, Nettleton DS, Pei D, Wang K (2002) Agrobacterium tumefaciensmediated transformation of maize embryo using a standard binary vector system. Plant Physiol 129:13-22. 19. Galinat W.C. (1995), " The origin of maize”, Econ. Bot (44), pp. 3-12 20. Gordon-KammWJ, Spencer TM,ManganoM, Adams TR, Daines RJ, StartWG, O’Brien JV, Chambers SA, Adams WR Jr,Willetts NG et al. (1990) Transformation of maize cells and regeneration of fertile transgenic plants. Plant Cell 2: 603-618. 21. Hensel G, Kastner C, Oleszczuk S, Riechen J, and Kumlehn J (2009) A.tumefaciens-Mediated Gene Transfer to Cereal Crop Plants: Current Protocols for Barley, Wheat, Triticale, and Maize. International Journal of Plant Genomics Volume 2009, Article ID 835608. 22. Hiei, Y., Ohta, S., Komari, T. & Kumashiro, T. (1994) Efficient transformation of rice (Oryza sativaL.) mediated by Agrobacterium and sequence analysis of the boundaries of the T-DNA. Plant J. 6, 271-282. 23. Ishida Y, Saito H, Ohta S, Hiei Y, Komari T, Kumashiro T (1996) High efficiency transformation of maize (Zea Mays L.) mediated by Agrobacterium tumefaciens. Nat Biotechnol 14:745-750. 24. James C (2014) Global Status of Commercialized Biotech/GM Crops: 2014. IS AAA Brief 49. 25. Khanna H., Becker D., Kleidon J. and Dale J. (2004), “Centrifugation Assisted Agrobacterium-mediated Transformation (CAAT) of embryogenic cell suspensions of banana (Musa spp. Cavendish AAA and Lady finger AAB) ”, Mol. Breed. 14:239252. 26. Padgette SR, Re DB, Barry G, Eichholtz DA, Delannay X, Fuchs RL, Kishore G, Fraley RT (1996) New weed control opportunities: development of soybeans with a Roundup Ready gene. In SO Duke, ed, Herbicide Resistant Crops: Agricultural, Economic, Environmental, Regulatory, and Technological Aspects. CRC Press, Boca Raton, FL, 53-84. 27. Pingali P.L., Pandey S. (2010), “World maize needs meeting: technological opportunities and priorities for the public section. In: Pingali P (ed) CIMMYT 2009-2010. World maize facts and trends. Meeting world maize needs: technological opportunities and priorities for the public section ” CIMMYT, Mexico city, pp. 1-3. 28. Priestman MA, Healy ML, Becker A, Alberg DG, Bartlett PA, Lushington GH, Schonbrunn E (2005) Interaction of phosphonate analogues of the tetrahedral reaction intermediate with 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase in atomic detail. Biochemistry 44: 324. 29. Rathore, K.S., Chowdhury, V.K., Hodges, Т.К., 1993. Use of bar as a selectable marker gene for the production of herbicide -resistant rice plants from protoplast. Plant Mol. Biol. 21, 871 - 884. 30. Russell DA, Fromm ME (1997) Tissue-specific expression in transgenic maize of four endosperm promoters from maize and rice. Transgenic Res 692: 157 — 168. 31. Saghai-Maroof MA, Soliman KM, Jorgensen RA, Allard RW (1984) Ribosomal DNA spacer-length polymorphisms in bar-ley: mendelian inheritance, chromosomal location, and population dynamics. Proc Natl Acad Sci USA 81(24):8014-8018. 32. Steinrucken, H.C. and N. Amrhein. 1980. The herbicide glyphosate is a potent inhibitor of 5-enolpyruvylshikimic acid-3-phosphate synthase. Biochemical and Biophysical Research Communications 94: 1207-1212. 33. Tingay, S. & CS., (1997) Agrobacterium tumefaciens-mediated barley transformation.Plant J. 11, 1369-1376. 34. Ye, G.-N., Hajdukiewicz, P.T.J., Broyles, D., Rodriguez, D., Xu, C.W., Nehra, N., Staub, J.M., 2001. Plastid-expressed 5-enolpyruvulshikimate-3- phosphate synthase genes provide high level glyphosate tolerance in tobacco. Plant J. 25, 261-270. 35. Zhao ZY, Gu W, Cai T, Tagliani LA, Hondred DA, Bond D, Krell S, Rudert ML, Bruce WB, Pierce DA (1998) Molecular analysis of TO plants transformed by Agrobacterium and comparison of Agrobacterium-mediated transformation with bombardment transformation in maize. Maize Genet Coop Newsl 72:34-37. [...]... trở thành công cụ quan trọng trong nghiên cứu chất nguyên sinh của phôi và nghiên cứu về các vấn đề sinh học cơ bản thông qua nghiên cứu về cây ngô chuyển gen Các nghiên cứu gần đây đã chứng minh phương pháp chuyển gen thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens là lựa chọn tốt hơn về sự phân phối của gen vào cây ngô so với vi c sử dụng phương pháp súng bắn gen Hệ thống phân phối gene này giúp cho... của giống ngô Hi-II tăng hiệu suất chuyển gen trung bình xấp xỉ 40% Frame & cs (2002) sử dụng vi khuẩn Agrobacterỉum mang vector nhị thể chuyển gen vào dòng ngô AI88 thu được hiệu suất chuyển gen đạt 5,5% 1 7 1.5.Tình hình nghiên cứu chuyển gen vào cây ngô trên thế giới và ở Vi t Nam 1.5.1 Tình hình nghiên cứu chuyển gen vào cây ngô trên thế giới Chuyển gen vào thực vật hai lá mầm thông qua vi khuẩn A.tumefaciens... đã chuyển gen Thông thường, huyền phù tế bào đơn được thu hoạch vào ngày thứ 5 hoặc thứ 6 sau khi cấy chuyển là giai đoạn tốt nhất để thực hiện quy trình chuyển gen 1.2.2.4 Phương pháp chuyển gen trực tiếp thông qua ống phẩn Phương pháp chuyển gen này được gọi là phương pháp chuyển gen không qua nuôi cấy mô Theo phương pháp này thì DNA chuyển vào, có thể theo đường ống phấn chui vào bầu nhụy cái và chuyển. .. giá thành vật tư đắt 1.3 .Nghiên cứu chuyển gen vào cây một lá mầm thông qua vỉ khuẩn Agrobacterium tumefaciens Sự thành công trong vi c tạo ra thực vật chuyển gen phụ thuộc vào một loạt các yếu tố như tàn số biến nạp, tác nhân chọn lọc hoặc sàng lọc và khả năng tái sinh cây chuyển gen hoàn chỉnh từ các tế bào và mô mang gen chuyển nạp Đối với phương pháp chuyển gen thông qua Agrobacterium thì tàn số... tằn số chuyển gen có thể được cải thiện bằng cách lây nhiễm thời gian ngắn, rửa mẫu sau khi lây nhiễm hoặc bổ sung các chất kìm hãm vi khuẩn vào môi trường đồng nuôi cấy 1.4 .Nghiên cứu chuyển gen thông qua A tumefaciens ở cây ngô Cây ngô chuyển gen (Zea mays) đầu tiên được tạo ra bằng phương pháp sử dụng súng bắn gen vào năm 1990 (Gordon-Kamm & cs., 1990) Ke từ sau đó công nghệ chuyển gen vào cây ngô. .. đất, thuốc diệt cỏ được sử dụng như một giải pháp duy nhất để loại trừ cỏ dại Trong giai đoạn từ 1991-2012, đặc tính kháng cỏ là tính trạng nổi bật Giống ngô kháng thuốc diệt cỏ glyphosate đầu tiên được thương mại hóa vào năm 1996 bởi công ty Monsanto và được gọi là “Roundup Ready Com” Năm 2011 ngô biến đổi gen kháng thuốc trừ cỏ đã được trồng ở 14 quốc gia Đen năm 2012, 26 giống ngô kháng thuốc trừ cỏ. .. glyphosate và NK66BƯGT kháng sâu đục thân và kháng thuốc trừ cỏ) 1.6.Cơ sở khoa học nghiên cứu về chọn tạo cây ngô biến đổi gen kháng thuốc diệt cỏ Trong sản xuất nông nghiệp, kiểm soát cỏ dại là một vấn đề quan ừọng, nếu không kiểm soát cỏ dại có thể làm giảm sản lượng cây trồng từ 20-60% Ngày nay, hàng loạt các biện pháp phòng trừ cỏ dại đã được áp dụng như: sử dụng các thuốc diệt cỏ chọn lọc hoặc không... Các chất kháng sinh để loại bỏ Agrobacterium Các chất kháng sinh như: cefotaxim, carbenicillin, timentin thường được sử dụng để loại bỏ vi khuẩn sau khi nuôi cộng sinh trong các nghiên cứu chuyển gen thông qua A tumefaciens Cefotaxim biểu hiện rất hiệu quả trong các nghiên cứu chuyển gen ban đầu ở ngô và lúa.Mặc dù Cefotaxim biểu hiện rất hiệu quả trong các nghiên cứu chuyển gen ban 1 6 đầu ở ngô và... chế quang hợp do đình chỉ sự vận chuyển điện tử trong hệ thống quang hóa II) là thuốc trừ cỏ chọn lọc cũng được sử dụng rộng rãi nhằm điều khiển cỏ dại hai lá mầm Vi c phát triển cây trồng kháng cỏ dại dựa vào 3 cơ chế sau: - Tạo ra các enzyme không bị ảnh hưởng bởi thuốc trừ cỏ: tạo ra những thay đổi trong enzyme là mục tiêu của thuốc trừ cỏ nhằm mục đích ngăn cản sự tác động 2 4 của thuốc trừ cỏ vào... glufosinate Gene bar và gene pat đều được sử dụng thảnh công khi chuyển gen vào nhiều đối tượng cây trồng với mục đích tạo cây trồng kháng cỏ Các dòng ngô, lúa, lúa mỳ và lúa mạch chuyển gen kháng thuốc 2 5 diệt cỏ đã được tạo ra Hai gene (pat và bar) mã hóa cho enzyme phos-phinothricin N- acetylừansferase (PAT) được sử dụng để kháng lại L-PPT trong các loài thực vật chuyển gen Gen bar (kháng lại bialophos) . tài Nghiên cứu tạo dòng ngô kháng thuốc trừ cỏ bằng phương pháp chuyển gen thông qua vi khuẩn Agrobacterium 2. Mục đích nghiên cứu - Biến nạp gen kháng thuốc trừ cỏ CP4 EPSPS vào một số dòng ngô. PHẠM HÀ NỘI 2 KHOA SINH - KTNN TRẦN THỊ THANH DIỆP NGHIÊN CỨU TẠO DÒNG NGÔ KHẢNG THUỐC TRỪ CỎ BẰNG PHƯƠNG PHÁP CHUYỂN GEN THÔNG QUA VI KHUẨN AGROBACTERIUM KHÓA LUÂN TÓT NGHIÊP ĐAI HOC • • • • Chuyên. là: - Chuyển gen gián tiếp thông qua vi khuẩn A. tume/aciens - Chuyển gen trực tiếp 1.2.1. Chuyển gen gián tiếp thông qua vi khuẩn Agrobacterium tume/aciens 1.2.1.1 Hệ thong chuyển gen in vitro Khó