+ Thời điểm bón, cách bón:
• Bón lót: 10 tấn phân chuồng + 100% phân lân.
• Bón thúc 1 (Khi cây ngô có 3-4 lá): Bón 20% đạm + 20% kali, cách gốc 10 cm. • Bón thúc 2 (Khi cây ngô có 7-8 lá): Bón 40% đạm + 40% kali, cách gốc 15 cm. • Bón thúc 3 (Khi cây ngô xoáy nõn): Bón 40% đạm + 40% kali, cách gốc 15- 20
cm.
Luôn để đất tơi xốp và giữ ẩm, xới phá váng sau mưa vào kỳ cây con. Vun gốc vừa kết hợp làm cỏ sau khi bón thúc đợt 1, vun cao gốc kết hợp làm cỏ lần cuối cho ngô khi bón thúc lần 2.
+ Tưới nước: 3 lần
• Lần 1: khi cây 7-9 lá tưới ngập 1/3 luống sau khi bón thúc.
• Lần 2: trước trổ cờ 10-15 ngày tưới ngập 2/3 luống thấm đều rồi rút cạn. • Lần 3: sau thụ phấn xong tưới ngập 1/3 luống rồi rút cạn.
+ Thụ phẩn: thụ phẩn bằng tay
• Dùng bao cách ly chùm kín hoa đực (cờ ngô), rung nhẹ cho hạt phấn rơi vào bao. • Rắc hạt phấn thu được lên đầu nhụy (râu ngô) của hoa cái.
• Bao kín hoa cái (bắp ngô) bằng bao cách ly, ghi rõ ngày tháng thụ phấn. Trong quá trình thụ phấn tránh dính bết râu ngô, không thụ phấn quá nhiều.
Thụ phấn khi trời khô ráo, lặng gió, thường vào buổi sáng (mùa hè 9-10h).
+ Thu mẫu bẳp: Các bắp ngô, sau khi thụ phấn khoảng 10-18 ngày (tùy thuộc vào thời vụ trồng) được thu để tách phôi.
+ Thu mẫu lá: Tiến hành thu mẫu lá ở cây đã chuyển gen khi cây được 4 lá, chọn lá non sau đó bảo quản trong N2 lỏng. Sau đó mẫu sẽ được bảo quản trong tủ lạnh sâu (- 80°C) để sử dụng lâu dài.
2.2.2. Phương pháp biến nạp gen thông qua A. tumefaciens
Các thí nghiệm biến nạp gen EPSPS vào phôi non thông qua vi khuẩn A. tumefaciens được tiến hành theo quy trình của Phạm Thị Lý Thu (2007) và Zhao và cộng
sự (1999) có cải tiến gồm các bước sau:
- Tạo dịch huyền phù vi khuẩn
Cấy trải Agrobacterium cất giữ trong glycerol ở -80°c lên đĩa môi trường ABC (có bổ sung rifampicin 30 mg/1 và kanamycin 50 mg/1), nuôi ở 21°c trong 2-3 ngày. Sau đó lấy 1 khuẩn lạc vi khuẩn nuôi trong môi trường YEB đặc có bổ sung 50 mg/1 kanamycin, nuôi ở 28°c trong 2-3 ngày. Trước khi biến nạp, lấy vi khuẩn hòa tan vào môi trường lây nhiễm tới OD550« 0,3-0,4 nuôi lắc 100v/p trong thời gian 3-4 h, bổ sung 100 mg/1 AS. Dịch huyền phù vi khuẩn này được sử dụng để lây nhiễm với phôi.
- Khử trùng bắp
Ngâm bắp ngô vật liệu trong bình 1 lít miệng rộng chứa 0,5 lít javen 30% với một vài giọt Tween-20 trong 20 phút sau đó rửa lại 5 lần bằng nước khử trùng và để bắp dựng đứng trên đĩa petri 150 xl5 mm đã khử trùng.
- Lây nhiễm vi khuẩn với phôi ngô non
Bắp non được thu từ các cây ngô mẹ trồng trong nhà lưới. Ngay sau khi khử trùng bắp, phôi non được tách trong điều kiện vô trùng. Phôi non sau đó được ngâm trong dịch huyền phù vi khuẩn khoảng 30 - 60 phút.
- Giai đoạn đồng nuôi cay
Phôi sau khi lây nhiễm với vi khuẩn được chuyển sang môi trường đồng nuôi cấy (CCM), nuôi trong điều kiện tối, ở nhiệt độ 20°c, thời gian 3 ngày.
- Nuôi phục hồi
Sau giai đoạn đồng nuôi cấy, chuyển phôi đã biến nạp từ môi trường CCM sang môi trường phục hồi (ReM) có chứa kháng sinh diệt khuẩn Cefotaxime, nuôi trong điều kiện tối, ở nhiệt độ 28°c, thời gian 7 ngày.
- Chọn lọc mô sẹo chuyển gen
Mô sẹo tạo thành từ phôi non đã biến nạp trên môi trường ReM được cấy chuyển sang môi trường chọn lọc (ECM) (có bổ sung 100 mg/1 Kanamycine), nuôi trong tối ở 28°c, thời gian 15 ngày.
- Tạo chồi chuyển gen
Mô sẹo phôi hoá tạo thành trên môi trường chọn lọc ECM được cấy chuyển sang môi trường tái sinh chồi (SeM) để tái sinh chồi, nuôi ở điều kiện chiếu sáng 28°c, thời
gian 1 5 - 2 0 ngày.
- Tái sinh cây chuyển gen hoàn chỉnh
Chồi tái sinh trong môi trường chọn lọc SeM khi đạt được độ dài 2 - 3cm được cấy chuyển sang môi trường tạo cây hoàn chỉnh RM, nuôi trong điều kiện chiếu sáng với chu kỳ chiếu sáng 16:8 h sáng: tối, ở nhiệt độ 25°c, thời gian 10-20 ngày.
- Đưa cây ra đất
Cây tái sinh hoàn chỉnh sẽ được chuyển vào nước để loại bỏ thạch bám trên cây, sau đó cây sẽ được trồng trên bàu đất trong nhà lưới.
2.2.3.1. Phương pháp tách chiết DNA tổng sổ từ lả ngô
Tiến hành thu mẫu lá ngô khi cây được 4 lá để tách chiết DNA. DNA được tách chiết và tinh sạch theo phương pháp CTAB của Saghai Maroof (1984) có cải tiến.
- Chuẩn bị dung dịch đệm chiết: (CTAB) + 100 ml CTAB gồm:
Bảng 2.2. Công thức môi trường sử dụng trong nghiên cứu
Môi trường Thành phân
ABC
800ml H20 + 3,9g Mes + 15g bacto-difco agar + 50ml AB salf 20X + 50ml AB buffer 20X + 20ml Stock C; pH=5,6.
50ml AB salf 20X: lg NH4C1 + 0,3g MgS04.7H20 + 0,15g KC1 +
0,01g CaC12 +0,0025g FeS04.7H20;
50ml AB buffer 20X: 3g K2HP04 + lg NaH2P04 20ml Stock C: 12,5g glucose;
YEB
10g bacto peptone + 5g yeast extract + 5g yeast extract + 12g agar; pH=7.
IM - AS
N6 + 2mg glycine + 68,5g sucrose + 36g glucose + 0,7g 1-proline + l,5mg 2,4D; pH = 5,2; 200mM AS.
CCM
N6 + 2mg glycine + 30g sucrose + 0,7g 1-proline + l,5mg 2,4D; 6g gellan-gum; pH = 5,8; 200mM AS; 0,85mg AgN03.
ReM
N6 + 2mg glycine + 30g sucrose + 0,7g 1-proline + 0,5g mes + l,5mg 2,4D; 6g gellan-gum; pH = 5,8; 0,85mg AgN03; 250mg cefotaxim. ECM
N6 + 2mg glycine + 30g sucrose + 0,7g 1-proline + 0,5g mes + l,5mg 2,4D; 6g gellan-gum; pH = 5,8; lOmg AgN03; 250mg cefotaxim ; l,5mg phosphinothricin/2,5mg hygromycin
SeM
N6 + 2mg glycine + 30g sucrose + 0,7g 1-proline + 0,5g mes; 6g gellan-gum; pH = 5,8; lmg BAP; 0,85mg AgN03; 250mg cefotaxim; 3mg phosphinothricin/5mg hygromycin.
RM MS + 60g sucrose + lOOmg myo-inositol; 9g agar; pH = 5,8
- Khử trùng 117°c thời gian 20 phút.
- Bổ sung СТАВ, PVP và ascorbic acid vào DEB sau khi khử trùng (bổ sung khi dung dịch ở khoảng 65°c để hoà tan hết các chất này).
СТАВ 2g (2% СТАВ)
PVP 2g (2% PVP)
ascorbic acid 88 mg (5 mM ascorbic acid)
- Bổ sung mercaptoethanol lOOul/lOOml СТАВ trước khi dùng - Chuẩn bị СТАВ: ủ ở bể ổn nhiệt 65°c.
- Nghiền khoảng 1 g mẫu lá thành bột mịn trong N2 lỏng, chuyển sang eppendorf 1,5 ml.
- Thêm 800ul đệm СТАВ ở 65°c. ủ ở bể ổn nhiệt 65°c ít nhất lh. - Ly tâm 15 phút với tốc độ 12.000 v/p thu dịch nổi.
- Hút lớp dịch nổi sang ống mới.
- Thêm 25 : 24 : 1 theo tỷ lệ 1 : 1. Votex trong 10 -15 phút. Ly tâm 10 - 15 phút 12.000- 13.000 v/p.
- Hút lớp dịch nổi + 24 : 1 theo tỷ lệ 1 : 1. Votex trong 10 phút. Ly tâm 15 phút ở 12.000 - 13.000 v/p.
- Hút lớp dịch nổi + isopropanol (tỷ lệ 1 : 1).
- Đưa vào tủ - 20°c ủ qua đêm để thu được lượng kết tủa lớn nhất. - Ly tâm thu tủa và rửa sạch bằng cồn 75° ít nhất 2 lần.
- Thổi khô DNA đã rửa sạch và hòa tan bằng TE.
- Bổ sung 10 mg/1 ARNase. ủ ở bể ổn nhiệt 37°c trong 1- 2h.
2.2.3.2. Phân tích PCR các cây ngô chuyển gen kháng thuốc trừ cỏ
Các cây chuyển gen được sàng lọc bằng phản ứng PCR để kiểm tra sự có mặt của Dung dịch mẹ Lượng cần lấy cho 100 ml Nồng độ cuối cùng (100 ml)
1 M Tris-HCl (pH 8) lOml ОД M Tris-HCl (Ph= 8)
5 M NaCl 28 ml 1,4 M NaCl
IM EDTA (pH 8) 1 ml 10 mM EDTA (pH= 8)
gen EPSPS trong hệ gen thực vật. Chúng tôi tiến hành các phản ứng PCR ở thể tích phản ứng 20 |J.1, sử dụng Taq DNA polymerase (Fermentas) với 35 chu kỳ. Thành phần, nồng độ các chất tham gia phản ứng PCR theo bảng 2.4.
Để nhân gen CP4 EPSPS chúng tôi sử dụng cặp mồi là CP4-EPSPS đặc hiệu cho gen CP4 EPSPS mã hoá cho khả năng kháng thuốc trừ cỏ glyphosate. Chương trình phản ứng với cặp mồi CP4-EPSPS là 95°c - 3 phút, 95°c - 1 phút, 51°c - 30 giây, 72°c - lphút, lặp lại trong 35 chu kỳ, 72°c - 10 phút, kết thúc 4°c. Sản phẩm PCR được kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 1% ở100 mV và nhuộm bằng ethidium bromide để quan sát các vạch DNA.
Bảng 2.3. Trình tự các đoạn mồi sử dụng trong phản ứng PCR T
T Đoạn mồi Trình tự mồi
1 CP4-EPSPS - F 5’- ATGGC ACAAA TTAAC AACAT GGCAC-3’
CP4-EPSPS- R 5’- GCCCA TTTCG CGCAG CGGGT TCAAC-3’
Bảng 2.4 Thành phần phản ứng PCR gen EPSPS Thành phần Thể tích (jxl) Buffer+KCl-MgC12 2 MgC12 1.6 dNTP (2nM) 2 PrimerF (lOpM) 0.5 PrimerR (lOpM) 0.5 Taq polymerase 0.2 DNA 1 H20 12.2 Tổng thể tích phản ứng 20
2.2.4. Thử khả năng kháng thuốc trừ cỏ của các cây chuyển gen trong điểu kiện
nhà lưới
Các dòng ngô chuyển gen kháng thuốc trừ cỏ sau khi tái sinh đã được chuyển ra đất trồng. Khi cây ở giai đoạn có 5 lá, tiến hành thử khả năng kháng thuốc trừ cỏ bằng cách phun dung dịch Vifosate có chứa glyphosate 200 mg/1 và 0,1% Tween 20 (v/v) đối với
các cây chuyển gen EPSPS. Phun đều lên lá của các cây đã được chuyển gen và cây không được chuyển gen (đối chứng), 2 ngày phun 1 lần, phun 3 lần (Brettschneider & cs., 1997).
Quan sát và theo dõi mức độ kháng thuốc trừ cỏ của các cây chuyển gen và đối chứng (cây bình thường không được chuyển gen) sau 10 ngày phun.
2.2.5. Phương pháp thu thập sổ liệu thống kê
Các phôi non được cấy với mật độ 25 phôi/đĩa Petri 10 cm.
Cứ 2-3 tuần sau khi các phôi non hoặc mô sẹo được cấy chuyển sang môi trường ECM/SM, mô sẹo phôi hoá tạo thảnh và cây tái sinh được đếm.
Các thông số sau được quan tâm để đánh giá hiệu quả của quá trinh nuôi cấy: Số mô sẹo tạo thành
Tỷ lệ tạo mô sẹo (%) = --- Tổng số phôi nuôi cấy
Số cây tái sinh Tỷ lệ tái sinh cây (%) = ---
Tổng số mô sẹo phôi hoá Số cây sống
Tỷ lệ cây sống khi đưa ra đất (%) =--- Tổng số cây tái sinh Số cây hữu thụ
Tỷ lệ cây hữu thụ (%) = --- Tổng số cây sống
Để xác định hiệu quả chuyển gen bền vững trong các thí nghiệm biến nạp vào phôi non, chúng tôi đánh giá các chỉ tiêu sau:
Số cây chuyển gen bền vững Tần số chuyển gen (STF) (%) = ---
Tổng số phôi biến nạp Các số liệu thu được được xử lý bằng phương pháp thống kê theo Chương trình phần mềm Excel 5.0.
3.1.Nghiên cứu đánh giá khả năng tiếp nhận gen CP4 EPSPS của các dòng ngô Việt Nam
Tổng số 6 thí nghiệm với 3400 phôi của 2 dòng ngô đã được sử dụng làm vật liệu chuyển gen. Kết quả được trình bày trong bảng 3.1.
Bảng 3.1. Kết quả biến nạp gen CP4 EPSPS vào dòng ngô CM8 và VH1 T
T Dòng ngo
Số lượng mẫu (phôi)
Tỉ lệ tạo mô sẹo (%) Tỉ lệ tái sinh chồi (%) Số câ y ra đấ Số cây sống sót CC M ReM ECM SeM RM 1 CM8 160 0 998 805 310 143 80,66 38,51 44 20 2 VH1 180 0 902 604 180 104 66,96 29.80 40 18 Tổng số 340 0 1900 1409 490 247 84 38
So sánh mức độ tiếp nhận gen của các dòng ngô thí nghiệm dễ dàng nhận thấy tỷ lệ tạo mô sẹo chuyển gen của dòng ngô CM8 (đạt 80,66%) cao hơn so với dòng VH1 (đạt 66,96%).
Xét về tỷ lệ tái sinh chồi chuyển gen của 2 dòng cho thấy: dòng CM8 cho tỷ lệ tái sinh cao hơn, đạt 38,51%. Dòng VH1 có tỷ lệ tạo mô sẹo thấp cũng cho tỷ lệ tái sinh chồi thấp, đạt 29.80%.
Đánh giá khả năng sống sót của cây tái sinh, chúng tôi đã nhận được số cây chuyển gen tái sinh ở dòng CM8 sống sót là 20 cây và dòng VH1 là 18 cây. Các cây chuyển gen tái sinh được chuyển ra đất, trồng trong nhà lưới, hầu hết các cây ngô đều có kiểu hình bình thường so với cây đối chứng không chuyển gen và có khoảng 80% số cây chuyển gen tái sinh có khả năng tạo hạt bằng phương pháp tự thụ phấn bằng tay.
7 8
Hình 3.1. Các giai đoạn của quá trình chuyển gen EPSPS vào dòng ngô VH1 và thu nhân cây chuyển gen tái sinh
Chú thích:
1. Đồng nuôi cấy phôi non với Agrobacterium
2. Nuôi cấy phục hồi
3. Tạo mô sẹo trên môi trường chọn lọc 4. Tái sinh chòi trên môi trường chọn lọc
5. Tái sinh cây hoàn chỉnh trên mồi trường chọn lọc 6,7.Chuyển cây ra đất
8. Bắp của cây chuyển gen TO dòng VH1
Các cây ngô chuyển gen tái sinh hữu thụ đã được thu mẫu lá và tiến hành các phân tích tiếp theo để đánh giá sự có mặt của gen chuyển.
3.2 Phân tích sinh học phân tử PCR sự có mặt của gen CP4 EPSPS trong các dòng ngô chuyển gen.
3.2.1. Kết quả tách chiết ĐNÂ tổng sổ từ lá của các dòng ngô chuyển gen
Chúng tôi đã tiến hành tách chiết DNA tổng số từ lá của các dòng ngô chuyển gen thế hệ TO, sử dụng phương pháp CTAB (Saghai - Maroof & cs., 1984) có cải tiến. Mẩu DNA sau khi tách chiết được kiểm ưa bằng phương pháp điện di trên gel agarose 0,8% để đánh giá mức độ tinh sạch và nguyên vẹn của DNA.
V * h JI * ■
■ r
»Ma/ u*; LJ I < uJ bu/ L«_J u—I LJ
Kết quả điện di cho thấy: Chất lượng DNA tổng số tách từ các mẫu tương đối tốt. DNA đạt độ tinh sạch và không bị đứt gãy. Mặt khác không thấy xuất hiện cácvết sáng RNA phía dưới, điều đó chứng tỏ RNA đã được loại bỏ hoàn toàn khỏi dịch chiết DNA. Dựa trên giá ứị OD260 cho thấy hàm lượng DNA thu được khá cao.
Sản phẩm DNA tổng số của các dòng ngô chuyển gen được chúng tôi sử dụng làn DNA khuôn cho các phân tích PCR.
3,2,2, Kết quả phân tích PCR các cây chuyển gen
Những cây chuyển gen tái sinh sau khi chuyển ra đất sống sót được chúng tồi tiến hành thu mẫu lá để tách chiết DNA phục vụ cho phân tích PCR. Sử dụng cặp mồi CP4 - EPSPS F; CP4 - EPSPS R với thành phần và chu trình đã được mô tả trong phần vật liệu và phương pháp, chúng tôi thu được kết quả như sau:
Bảng 3.2. Kết quả phân tích PCR gen EPSPS trong các dòng ngô chuyển gen T
T Dòng ngô Tổng số cây phân tích
SỐ cây dương tính với PCR
1 CM8 20 5
2 VH1 18 1
Tổng 38 6
Từ kết quả của bảng 3.2. cho thấy: trong tổng số 38 cây chuyển gen kháng tái sinh phân tích, chỉ có 6 cây có kết quả PCR dương tính với gen EPSPS. Trong đó, dòng CM8