tạo cây cà chua mang gen HBsAg bằng phương pháp biến nạp gen dùng vi khuẩn agrobacterium tumefaciens

1 M CL C Trang M căl c Danhăm căhình Danhăm căb ng Danhăm căch ăvi tăt t 11 Tómăt t 12 M ăĎ u 16 Ch ngă1ăT ngăquanătàiăli u 20 1.1ăT ngăquanăv ăcâyăcàăchuaă(Lycopersicon esculentum Mill) 20 1.1.1ăNgu năg căvàăphânălo i 20 1.1.2 ụăngh aăkinhăt ăc aăcâyăcàăchua 21 1.1.3ăDinhăd ngătrongăqu ăcàăchua 21 1.1.4 Nghiênăc uăv ădiătruy năcâyăcàăchua 23 1.2ăT ngăquanăv ăvirusăviêmăgană(HepatitisăBăvirusă- HBV)ăvàăvaccineă năĎ căt ă th căv t 23 1.2.1ă iăc ngăv ăvirusăviêmăganăBă(Hepatitis B virus – HBV) 24 1.2.2ăC uătrúcăc aăHBVă 25 1.2.2.1 Gen S 26 1.2.2.2.ă Khángă nguyênă b ă m tă virusă viêmă gană Bă (HBsAgă – Hepatitis B surface antigen) 27 1.2.3ăVaccineă năĎ căt ăth căv t 30 1.2.3.1ă uăĎi măc aăvaccineă năĎ 1.2.3.2 Ph căt ăth căv tă 30 ngăth căs năxu tăvaccineă năĎ 1.3ă M tă s ă nghiênă c uă ă n căt ăth căv t 32 că ngoàiă vàă trongă n că v ă bi nă n pă genă HBsAg t oă khángănguyênăHBsAgătrênăth căv t 32 1.3.1ăNghiênăc uă ăn căngoài 32 1.3.1.1ăTrênăcâyăcàăchuaă(Lycopersicon esculentum Mill.) 33 1.3.1.2ăTrênăcácăcâyătr ngăkhác 33 1.3.2ăNghiênăc uătrongăn c v chuy n gen HBsAg 36 1.4ăCácăcôngătrìnhăchuy năgenăkhácătrênăcâyăcàăchuaă 36 1.5ăC uătrúcăvectorădùngătrongăbi năn păgenătrênăĎ iăt 1.6ă M tă s ă y uă t ă nhă h ngăcàăchua 42 ngă Ď nă hi uă qu ă bi nă n pă genă dùngă Agrobacterium tumefaciens ăcâyăcàăchua 44 1.6.1ăDòngă(strain)ăA tumefaciens 44 1.6.2ăTu iăc aăm u 44 1.6.3ăLo iăm u 45 1.6.4ăMôiătr ngăti nănuôiăc y 45 1.6.5ăMôiătr ngătáiăsinh 45 1.6.6ăTh iăgianănhi măkhu nă 46 1.6.7ăM tăĎ ăvi khu n 46 1.6.8ă ngănuôiăc y 46 1.6.9ăPhânăt ătínăhi u 47 1.6.10ăGiaiăĎo năti năch năl c 47 1.6.11ăN ngăĎ ăkhángăsinhăcefotaxime 47 1.6.12ă nhăh ngăc aăpromoterălênăs ăbi uăhi năGUS 47 1.7 Chuy năgenăgiánăti pănh ăAgrobacterium tumefaciens 47 1.7.1ă uăĎi măc aăph ngăphápăchuy năgenănh ăAgrobacterium tumefaciens 47 1.7.2ăC ăch ăxâmănh păc aăAgrobacterium tumefaciens vàoăt ăbàoăth căv tă 48 1.7.2.1 Hìnhăthànhăm tămobileăT- DNA copy, T- strand 49 1.7.2.2 C ăch ădiăchuy năph căh păT 50 1.7.2.3 S ăg năT-DNA 51 1.8ă M tă s ă ph ngă phápă t oă th că v tă chuy nă genă ană toànă sinhă h că khôngă cóă genă ch năl că(marker-free) 51 Ch ng V t li u vƠ ph ng pháp nghiên c u 53 2.1ăN iădungănghiênăc u 54 2.2ăV tăli uănghiênăc u 54 2.2.1ăV tăli uăth căv t 54 2.2.2ăViăkhu n 54 2.2.3 Plasmid 55 2.2.3.1ăT oădòngăE coli mang plasmid pITB-HBsAg 56 2.2.3.2ăBi năn păplasmidăpITB-HBsAg vàoăAgrobacterium tumefaciens LBA4404 56 2.3ăTh iăgianăvàăĎ aăĎi mănghiênăc u 56 2.4ăPh ngăphápănghiênăc u 56 2.4.1 Kh oăsátă nhăh nhăh ngăc aăBA,ăIAAălênă s táiăsinhăch iăin vitro t ăláăm măvàă ngăc aăkhángăsinhăkanamycinălênăláăm m,ăcâyăconăin vitro 56 2.4.1.1 Kh oăsátă nhăh 2.4.1.2ă nhăh ngăc aăBA,ăIAAălênăs ătáiăsinhăch iăin vitro t ăláăm m 56 ngăc aăn ngăĎ ăkhángăsinhăkanamycinălênăláăm m,ăcâyăcon in vitro 58 2.4.2 Xâyă d ngă quyă trìnhă bi nă n pă genă vàoă láă m mă câyă càă chuaă TN412 b ngă ph ngăphápădùngăviăkhu năAgrobacterium tumefaciens 59 2.4.3ăKi mătraăs ăhi nădi năc aăcácăgenăbi năn păvàăs ăbi uăhi năc aăchúngăb ngă ph ngăphápăhóaămôăt ăbào,ăsinhăh căĎ nhătínhăvàăhóaăsinh 61 2.4.3.1ăKi mătraăs ăbi uăhi năĎ nhătínhăc aăgenăkhángăkanamycinănptII 61 2.4.3.2ăKi mătraăs ăhi nădi năc aăcácăgenănptII, HBsAg b ngăk ăthu tăPCR 61 2.4.3.3ăGi iătrìnhăt ăs năph măPCRăgenăHBsAg c aăcâyăcàăchuaăchuy năgen 62 2.4.3.4ă ánhăgiáăcâyăcàăchuaăchuy năgenăHBsAg trongăĎi uăki năv nă mă ăth ăh ăT0 62 2.4.3.5ăKi mătraăs ăhi nădi năvàăbi uăhi năc aăgenăgusA b ngăk ăthu tăhóaămô 63 2.4.3.6 PhânătíchăSouthernăblotăcácădòngăcàăchuaăchuy năgenăHBsAg 64 2.4.3.7 Ki mătraănhanhăs ăhi nădi năc aăproteinăHBsAgă ăqu ăcâyăT0 b ngăqueăth ă Ď căhi u 67 2.4.3.8ăPhânătíchăproteinăt ngăs ădùngăĎi nădiătrênăgelăpolyacrylamideă(SDS-PAGE) (Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide Gel Electrophoresis) 68 2.4.3.9ăPhânătíchăWesternăblotăcácădòngăcàăchuaăchuy năgenăHBsAg 71 2.4.3.10ăKi mătraăhàmăl ngăproteinăHBsAgăb ngăph ngăphápăELISAă(Enzyme- Linked ImmunoSorbent Assay) 73 2.4.4ăKi mătraăs ădiătruy năc aăgenăch năl cănptII vàăgenăchuy năm cătiêuăHBsAg ă th ăh ăT1 b ngăph ngăphápăsinhăh c Ď nhătínhăvàăPCR 75 2.4.4.1ăKi mătraăkh ăn ngăkhángăkhángăsinhăkanamycinăc aăm tăs ăcâyăconăth ăh ă T1 b ngăph ngăphápăsinhăh căĎ nhătính 75 2.4.4.2ăKi mătraăs ăhi nădi năc aăgenănptII, gen HBsAg b ngăk ăthu tăPCR vàăt ăl ă phânălyăc aăgenănptII vàăgenăHBsAg ăth ăh ăT1 76 2.5ăPh Ch ngăphápăx ălỦăs ăli u 76 ng K t qu vƠ th o lu n 77 3.1 Kh oăsátă nhăh h ngăc aăBA,ăIAAălênăs táiăsinhăch iăin vitro t ăláăm măvàă nhă ngăc aăkhángăsinhăkanamycinălênăláăm m,ăcâyăconăin vitro 77 3.1.1ă nhăh ngăc aăBA,ăIAAălênăs ătáiăsinhăch iăin vitro t ăláăm m 77 3.1.2 nhăh ngăc aăn ngăĎ ăkhángăsinhăkanamycinălênăláăm m,ăcâyăconă 80 3.1.2.1 nhăh ngăc aăn ngăĎ ăkanamycinălênăs ătáiăsinhăc aăm uăláăm mă 80 3.1.2.2ă nh h ngăc aăn ngăĎ ăkhángăsinhăkanamycinălênăs ăsinhătr ngăc aăcây 81 3.2 Xâyăd ngăquyătrìnhăbi năn păgenăvàoăláăm măcâyăcàăchuaăTN412 b ngăph ngă phápădùngăviăkhu năAgrobacterium tumefaciens 84 3.3ă Ki mă traă s ă hi nă di nă c aă cácă genă bi nă n pă vàă s ă bi uă hi nă c aă chúngă b ngă ph ngăphápăhóaămôăt ăbào,ăsinhăh căĎ nhătính,ăhóaăsinh 91 3.3.1ăKi mătraăs ăbi uăhi năĎ nhătínhăc aăgenăkhángăkanamycinănptII 91 3.3.2 Ki mătraăs ăhi nădi năc aăcácăgenănptII, HBsAg b ngăk ăthu tăPCR 92 3.3.2.1ăKi mătraăPCRăgenăkhángăkanamycinănptII 92 3.3.2.2ăKi mătraăPCRăgenăHBsAg 92 3.3.3ăGi iătrìnhăt ăs năph măPCRăgenăHBsAg c aăcâyăcàăchuaăchuy năgen 94 3.3.4 ánhăgiáăcâyăcàăchuaăchuy năgenăHBsAg trongăĎi uăki năv nă mă ăth ăh ă T0 94 3.3.5ăKi mătraăs ăhi nădi năvàăbi uăhi năc aăgenăgusA b ngăk ăthu tăhóaămô 98 3.3.6ăPhânătíchăSouthernăblotăcácădòngăcàăchuaăchuy năgenăHBsAg 99 3.3.6.1ăT oăm uădòălaiăDNA 99 3.3.6.2 Lai DNA 100 3.3.7 Ki mătraănhanhă s ăhi nădi năc aăproteinăHBsAgă ăqu ă câyă T0 b ngăqueăth ă Ď căhi u 102 3.3.8 Phânătíchăproteinăt ngăs ădùngăĎi nădiătrênăgelăpolyacrylamide (SDS-PAGE) 103 3.3.9 PhânătíchăWesternăblotăcácădòngăcàăchuaăchuy năgenăHBsAg 106 3.3.10ăKi mătraăhàmăl ngăproteinăHBsAgăb ngăph ngăphápăELISA 107 3.4ăKi mătraăs ădiătruy năc aăgenăch năl cănptII vàăgenăchuy năm cătiêuăHBsAg ă th ăh ăT1 b ngăph ngăphápăsinhăh căĎ nhătínhăvàăk ăthu tăPCR 110 3.4.1ă ánhă giáă kh n ngă khángă khángă sinhă kanamycină c a m t s câyă conă th h sau b ngăph 3.4.2ăPh ngăphápăĎ nhătính 110 ngăphápăPCR 113 K t lu n vƠ đ ngh 115 K tălu n 115 ăngh 116 Danhăm căcôngătrình 117 Tàiăli uăthamăkh o 118 Ph ăl c 140 DANH M C HỊNH Hìnhă1.1ăC u trúcăkhôngăgianăc aăvirusăHBV 24 Hìnhă1.2ăC uătrúcăb ăgenăc aăvirusăHBV 26 Hìnhă1.3ăBaăvùngăc aăgenăS (S, pre-S1, pre-S2)ăvàăcácăproteinăĎ căcácăgenănàyămưă hóaă 29 Hìnhă1.4ăC uătrúc gen S vàăkhángănguyênăb ăm t (HBsAg) 29 Hìnhă1.5ăS ăĎ ăs năxu tăvaccineă năĎ căt ăth căv tătrênăc ăs ăxâyăd ngăh ăth ngă bi uă v ă ă virusă gâyă nhi mă th că v tă vàă bi nă n pă diă truy nă nh ă viă khu nă Agrobacterium/b năgen 32 Hìnhă1.6 C uătrúcăgenăPDS ăcàăchuaă 43 Hìnhă1.7ăC ăch ăxâmănh păc aăT-DNA Agrobacterium tumefaciens vàoăt ăbàoăth că v tă 50 Hìnhă1.8 Cácăph ngăphápăt oăcâyătr ngăbi năĎ iăgenăkhôngăcóăgenăĎánhăd u 52 Hìnhă2.1ăCácăb căthíănghi măv ăbi năn păt oăcâyăchuy năgenăvàăminhăch ngăv ăs ă diătruy năc aăgenăchuy n 53 Hìnhă2.2 C uătrúcăplasmidăpITB-HBsAg 55 Hìnhă2.3ăM uăláăm măcàăchuaăin vitro Ď căs ăd ngălàmănguyênăli uătáiăsinhăch i 57 Hìnhă2.4ăS ăĎ ăĎo năDNAăsauăkhiăx ălỦăb ngăenzymeăgi iăh năNcoI 66 Hìnhă3.1ăCh iătáiăsinhăt ăm uăláăm măcàăchuaătrênăcácămôiătr ngăkh oăsátăcóăb ă sungăn ngăĎ ăBAăt ă1,25ămg/LăĎ nă2,5ămg/Lă ă42ăNSCă 79 Hìnhă3.2ăM uăláăm măĎ cănuôiăc yătrênămôiătr ngătáiăsinhăcóăn ngăĎ ăkhángăsinhă kanamycinăkhácănhauă ă28ăNSCă 81 Hìnhă3.3ăM uăcâyănuôiăc yătrênămôiătr ngăcóăn ngăĎ ăkhángăsinhăkanamycinăkhácă ă60ăNSC 82 Hìnhă3.4ăM uăláăm mă ăchuăk ăch năl căl năth ă1ătrênămôiătr ngăcóăkanamycină50ă mg/L 84 Hìnhă3.5ăM uăláăm măs ngăsótătrênămôiătr ngăcóăkhángăsinhăkanamycină50ămg/Lă hìnhăthànhămôăs o,ătáiăsinhăch iăsauă4ăl năc yăchuy năsangămôiătr ngăch năl c 87 Hìnhă3.6 Trìnhăt ăĎo năT-DNAăh pănh tăvàoăb ăgenăcây 88 Hìnhă3.7ăTómăt tăquyătrìnhăbi năn păgenăHBsAg vàoăláăm măgi ngăcàăchuaăTN412ă nh ăviăkhu năAgrobacterium tumefaciens 89 Hìnhă 3.8 S ă Ď ă bi nă n pă genă HBsAg vàoă láă m mă gi ngă càă chuaă TN412ă nh ă viă khu năAgrobacterium tumefaciens 90 Hìnhă 3.9ă M uă láă th tă câyă T0 táiă sinhă trênă môiătr ngăch aă khángă sinhă kanamycină 100 mg/Lă ă60ăngàyăsauăc yăch năl c 91 Hìnhă3.10ăK t qu Ďi n di s n ph m PCR c a gen nptII câyăcàăchuaăchuy n gen 92 Hìnhă3.11ăK t qu Ďi n di s n ph m PCR c a gen HBsAg câyăcàăchuaăchuy n gen 93 Hìnhă3.12ăBaădòngăcâyăcàăchuaăchuy năgenăT0 ăgiaiăĎo năin vitro vàăgiaiăĎo năt ngăă tr ngăex vitro 96 Hìnhă3.13ăBaădòngăcâyăcàăchuaăchuy năgenăT0 giaiăĎo năraăhoa,ăk tăqu ăex vitro 97 Hìnhă3.14ăBi uăhi năGUSă ăm tăs ălo iămôăc a câyăcàăchuaăTN412ăchuy năgen 99 Hìnhă3.15ăK tăqu ăĎi nădiăs năph măPCRăgenăHBsAg nh măthuăm uăt oăprobe 100 Hìnhă3.16ăK tăqu ăĎi nădiăgelăagaroseăcácăm uăDNAăsauăc tăb ngăenzymeăgi iăh nă ph căv ăphânătíchăSouthernăblot 101 Hìnhă3.17ăK tăqu ăphânătíchăSouthernăblotăcácădòngăcàăchuaăchuy năgen 102 Hìnhă3.18ăK tăqu ăphátăhi nănhanhăproteinăHBsAgă ăláăvàăqu ăcàăchuaăcâyăT0 103 Hìnhă3.19ăK tăqu ăĎi nădiăSDS-PAGEăproteinăcácădòngăcàăchuaăchuy năgenăHBsAg 104 Hìnhă 3.20ă K tă qu ă phână tíchă Westernă blotă d ngă tínhă Ď iă v iă cácă dòngă càă chuaă chuy năgen 107 Hìnhă 3.21 S chuy n gen c ch n y m m c aă khángă sinhă kanamycină trênă h tă càă chuaă khôngă NSC 111 Hìnhă3.22ăS n y m m c a h tăcàăchuaăchuy n gen th h T0 trênămôiătr cóăb sung kanamycin 100 mg/L ngă½ăMSă NSC 112 Hìnhă3.23ăCâyăconăt h tăcàăchuaăchuy n gen HBsAg khángăkanamycină100ămg/Lă tr ng v nă mă 30 NSC 113 Hìnhă3.24 K tăqu ăki mătraăPCRăgenăkhángăkanamycinănptII vàăgenăHBsAg m tă s ăcáăth ăcâyăconăcàăchuaăth ăh ăT1 c aădòngăCC1 113 DANH M C B NG B ngă1.1ăM iăliênăquanăgi aăki uăhuy tăthanhă(serotype)ăvàăki uăgenă(genotype) 25 B ngă1.2ăNh ngăcôngătrìnhăt oăvaccineă năĎ că ăcàăchuaăgiúpăng aăm tăs ă b nh 37 B ngă1.3ăNh ngănghiênăc uăchuy năgenă ăcàăchuaăc iăthi năkh ăn ngăkhángăb nhă vàăch ngăch uăv iămôiătr ngăb tăl i 38 B ngă1.4ăNh ngăcôngătrìnhăchuy năgenă ăcàăchuaăgiaăt ngătínhăch uăĎ ngăstressăphiă sinhăh c 39 B ngă2.1ăThànhăph năc aăresolvingăgelăvàăstackingăgel 70 B ngă3.1 nhăh ngăc aăn ngăĎ ăBAălênăs táiăsinhăch iăt ăláăm măcà chuaă ă42ă ngàyăsauăc yă(NSC) 78 B ngă3.2 nhăh ngăc aăn ngăĎ ăkhángăsinhăkanamycinălênăkh ăn ngătáiăsinhăc aă láăm măcàăchuaăvàăs ăsinh tr ngăc aăcây conăcàăchua 82 B ngă 3.3ă T ngă s ă nhánhă lá,ă s ă hoa,ă s ă qu ă vàă chi uă caoă c aă câyă càă chuaă khôngă chuy năgenă( C)ăvàăcâyăcàăchuaăchuy năgenăc aăcácădòngăCC1,ăCC2,ăCC3 95 B ngă3.4 Hàmăl ngăproteinăt ngăs ăc aăqu ăcácădòngăcàăchuaăchuy năgenăHBsAg 104 B ngă3.5ăKho ngăcáchădiăchuy năcácăb ngăproteinătrênăb năgelăc a cácăm uăkh oă sát 105 B ngă3.6ăTr ngăl ngăphânăt ăcácăb ngăproteină ăcácăm uăĎ iăch ngăvàăchuy năgenă HBsAg 106 B ngă3.7ăT ngăquană gi aăgiáătr ă ODăvàăcácăn ngăĎ ăproteinăHBsAgă(BFă6015ă - AaltoăBio)ădùngălàmăĎ B ngă 3.8 Hàmă l ng chu n 108 ngă vàă t ă l ă proteină khángă nguyênă HBsAgă trênă proteină t ngă s ă trongănh ngăm uăkh oăsát 108 10 B ng 3.9 K t qu th nghi m kh n ngă khángă khángă sinhă c a h t t qu càă chuaă chínă chuy n gen HBsAg th h T0 trênă môiă tr kanamycin 100 mg/L ng n y m mă ½ă MSă cóă b sung NSC 111 175 Descriptives Sohoa 95% Confidence Interval for Mean Std N Mean Deviation Std Error Lower Upper Bound Bound BetweenComponent Minimum Maximum DC 49.3333 8.14453 4.70225 29.1012 69.5655 40.00 55.00 CC1 56.3333 7.23418 4.17665 38.3626 74.3040 48.00 61.00 CC2 53.3333 9.45163 5.45690 29.8542 76.8125 46.00 64.00 CC3 48.3333 13.05118 7.53510 15.9124 80.7543 38.00 63.00 Total 12 51.8333 8.94258 2.58150 46.1515 57.5152 38.00 64.00 9.72540 2.80748 45.3593 58.3074 Model Fixed Effects Random 2.80748 Effects a 42.8987 a 60.7680 a Variance -17.86111 a Warning: Between-component variance is negative It was replaced by 0.0 in computing this random effects measure Test of Homogeneity of Variances Sohoa Levene Statistic df1 754 df2 Sig 550 ANOVA Sohoa Sum of Squares df Mean Square Between Groups 123.000 41.000 Within Groups 756.667 94.583 Total 879.667 11 F Sig .433 Post Hoc Tests Multiple Comparisons Dependent Variable:Sohoa (I) (J) Mean Std Error Sig 95% Confidence Interval 735 176 LSD Dong Dong DC CC1 -7.00000 7.94075 404 -25.3114 11.3114 CC2 -4.00000 7.94075 628 -22.3114 14.3114 CC3 1.00000 7.94075 903 -17.3114 19.3114 DC 7.00000 7.94075 404 -11.3114 25.3114 CC2 3.00000 7.94075 715 -15.3114 21.3114 CC3 8.00000 7.94075 343 -10.3114 26.3114 DC 4.00000 7.94075 628 -14.3114 22.3114 CC1 -3.00000 7.94075 715 -21.3114 15.3114 CC3 5.00000 7.94075 546 -13.3114 23.3114 DC -1.00000 7.94075 903 -19.3114 17.3114 CC1 -8.00000 7.94075 343 -26.3114 10.3114 CC2 -5.00000 7.94075 546 -23.3114 13.3114 CC1 CC2 CC3 Difference (I-J) Lower Bound Homogeneous Subsets Sohoa Subset for alpha = 0.05 Dong a Duncan N CC3 48.3333 DC 49.3333 CC2 53.3333 CC1 56.3333 Sig .370 Means for groups in homogeneous subsets are displayed a Uses Harmonic Mean Sample Size = 3.000 T ng s nhánh ONEWAY Sonhanhla BY Dong /STATISTICS DESCRIPTIVES EFFECTS HOMOGENEITY /MISSING ANALYSIS /POSTHOC=DUNCAN LSD ALPHA(0.05) Oneway Upper Bound 177 Notes Output Created 19-Feb-2016 03:32:32 Comments Input Data C:\Users\Dell5470\Desktop\Ban be\Chinam\thongkemoi_chinam\thongkemoi _chinam.sav Active Dataset DataSet1 Filter Weight Split File N of Rows in Working Data File Missing Value Handling Definition of Missing 27 User-defined missing values are treated as missing Cases Used Statistics for each analysis are based on cases with no missing data for any variable in the analysis Syntax ONEWAY Sonhanhla BY Dong /STATISTICS DESCRIPTIVES EFFECTS HOMOGENEITY /MISSING ANALYSIS /POSTHOC=DUNCAN LSD ALPHA(0.05) Resources Processor Time 00:00:00.032 Elapsed Time 00:00:00.014 Descriptives Sonhanhla 95% Confidence Interval for Mean Std N Mean Deviation Std Error Lower Upper Bound Bound BetweenComponent Minimum Maximum DC 12.3333 57735 33333 10.8991 13.7676 12.00 13.00 CC1 13.3333 57735 33333 11.8991 14.7676 13.00 14.00 CC2 12.0000 2.00000 1.15470 7.0317 16.9683 10.00 14.00 CC3 12.6667 2.08167 1.20185 7.4955 17.8378 11.00 15.00 Variance 178 Total Model 12 12.5833 Fixed Effects 1.37895 39807 11.7072 13.4595 1.50000 43301 11.5848 13.5819 Random 43301 Effects a 11.2053 a 13.9614 10.00 15.00 a -.42593 a Warning: Between-component variance is negative It was replaced by 0.0 in computing this random effects measure Test of Homogeneity of Variances Sonhanhla Levene Statistic df1 df2 1.942 Sig 202 ANOVA Sonhanhla Sum of Squares Between Groups df Mean Square F 2.917 972 Within Groups 18.000 2.250 Total 20.917 11 Sig .432 736 Post Hoc Tests Multiple Comparisons Dependent Variable:Sonhanhla (I) 95% Confidence Interval Mean Dong (J) Dong Difference (I-J) Std Error LSD DC CC1 CC2 Sig Lower Bound Upper Bound CC1 -1.00000 1.22474 438 -3.8243 1.8243 CC2 33333 1.22474 792 -2.4909 3.1576 CC3 -.33333 1.22474 792 -3.1576 2.4909 DC 1.00000 1.22474 438 -1.8243 3.8243 CC2 1.33333 1.22474 308 -1.4909 4.1576 CC3 66667 1.22474 601 -2.1576 3.4909 DC -.33333 1.22474 792 -3.1576 2.4909 CC1 -1.33333 1.22474 308 -4.1576 1.4909 179 CC3 CC3 -.66667 1.22474 601 -3.4909 2.1576 DC 33333 1.22474 792 -2.4909 3.1576 CC1 -.66667 1.22474 601 -3.4909 2.1576 CC2 66667 1.22474 601 -2.1576 3.4909 Homogeneous Subsets Sonhanhla Subset for alpha = 0.05 Dong a Duncan N CC2 12.0000 DC 12.3333 CC3 12.6667 CC1 13.3333 Sig .335 Means for groups in homogeneous subsets are displayed a Uses Harmonic Mean Sample Size = 3.000 S qu c a cơy ONEWAY Soqua BY Dong /STATISTICS DESCRIPTIVES EFFECTS HOMOGENEITY /MISSING ANALYSIS /POSTHOC=DUNCAN LSD ALPHA(0.05) Oneway Notes Output Created 19-Feb-2016 03:31:04 Comments Input Data C:\Users\Dell5470\Desktop\Ban be\Chinam\thongkemoi_chinam\thongkemoi _chinam.sav 180 Active Dataset DataSet1 Filter Weight Split File N of Rows in Working Data File Missing Value Handling Definition of Missing 27 User-defined missing values are treated as missing Cases Used Statistics for each analysis are based on cases with no missing data for any variable in the analysis Syntax ONEWAY Soqua BY Dong /STATISTICS DESCRIPTIVES EFFECTS HOMOGENEITY /MISSING ANALYSIS /POSTHOC=DUNCAN LSD ALPHA(0.05) Resources Processor Time 00:00:00.031 Elapsed Time 00:00:00.011 Descriptives Soqua 95% Confidence Interval for Mean N Mean Std Std Lower Upper Deviation Error Bound Bound BetweenComponent Minimum Maximum DC 2.3333 57735 33333 8991 3.7676 2.00 3.00 CC1 2.6667 57735 33333 1.2324 4.1009 2.00 3.00 CC2 2.3333 57735 33333 8991 3.7676 2.00 3.00 CC3 2.6667 57735 33333 1.2324 4.1009 2.00 3.00 Total 12 2.5000 52223 15076 2.1682 2.8318 2.00 3.00 57735 16667 2.1157 2.8843 Model Fixed Effects Random Effects 16667 a 1.9696 a 3.0304 a a Warning: Between-component variance is negative It was replaced by 0.0 in computing this random effects measure Variance -.07407 181 Test of Homogeneity of Variances Soqua Levene Statistic df1 df2 000 Sig 1.000 ANOVA Soqua Sum of Squares Between Groups df Mean Square F 333 111 Within Groups 2.667 333 Total 3.000 11 Sig .333 802 Post Hoc Tests Multiple Comparisons Dependent Variable:Soqua 95% Confidence Interval Mean (I) Dong (J) Dong Difference (I-J) Std Error LSD DC CC1 CC2 CC3 Lower Bound Upper Bound CC1 -.33333 47140 500 -1.4204 7537 CC2 00000 47140 1.000 -1.0871 1.0871 CC3 -.33333 47140 500 -1.4204 7537 DC 33333 47140 500 -.7537 1.4204 CC2 33333 47140 500 -.7537 1.4204 CC3 00000 47140 1.000 -1.0871 1.0871 DC 00000 47140 1.000 -1.0871 1.0871 CC1 -.33333 47140 500 -1.4204 7537 CC3 -.33333 47140 500 -1.4204 7537 DC 33333 47140 500 -.7537 1.4204 CC1 00000 47140 1.000 -1.0871 1.0871 CC2 33333 47140 500 -.7537 1.4204 Homogeneous Subsets Soqua Subset for alpha = 0.05 Dong Sig N 182 a Duncan DC 2.3333 CC2 2.3333 CC1 2.6667 CC3 2.6667 Sig .523 Means for groups in homogeneous subsets are displayed a Uses Harmonic Mean Sample Size = 3.000 K t qu gi i trình t m u PC (t plasmid) vƠ m u 1, 2, (t dòng cƠ chua chuy n gen C1, C2, C3) PH L C 10 đo th đ ng chu n t b c sóng 595 nm ng quan gi a n ng đ protein BSA vƠ giá tr OD 183 L ng protein t ng c a dòng chuy n gen HBsAg ONEWAY protein BY dong /STATISTICS DESCRIPTIVES EFFECTS HOMOGENEITY /MISSING ANALYSIS /POSTHOC=DUNCAN LSD ALPHA(0.05) Oneway Notes Output Created 21-Aug-2015 14:40:52 Comments Input Active Dataset DataSet0 Filter Weight Split File N of Rows in Working Data File Missing Value Handling Definition of Missing 12 User-defined missing values are treated as missing 184 Cases Used Statistics for each analysis are based on cases with no missing data for any variable in the analysis Syntax ONEWAY protein BY dong /STATISTICS DESCRIPTIVES EFFECTS HOMOGENEITY /MISSING ANALYSIS /POSTHOC=DUNCAN LSD ALPHA(0.05) Resources Processor Time 00:00:00.000 Elapsed Time 00:00:00.000 Descriptives protein 95% Confidence Interval for Mean Std N Mean Between- Lower Deviation Std Error Bound Componen Upper Bound Minimum Maximum 1.7306E2 4.77908 2.75920 161.1881 184.9319 169.92 178.56 1.6914E2 7.92776 4.57709 149.4457 188.8330 161.66 177.45 1.6080E2 16.61154 9.59067 119.5347 202.0653 146.65 179.09 3 1.5574E2 8.62374 4.97892 134.3208 177.1659 147.27 164.51 1.6469E2 11.39014 3.28805 157.4487 171.9226 146.65 179.09 10.44032 3.01386 157.7357 171.6356 3.92671 152.1891 177.1822 Total Model 12 Fixed Effects Variance Rando m Effects Test of Homogeneity of Variances protein Levene Statistic 1.734 df1 df2 Sig 237 ANOVA 25.3427 185 protein Sum of Squares df Mean Square F Between Groups 555.085 185.028 Within Groups 872.002 109.000 1427.087 11 Total Sig 1.698 244 Post Hoc Tests Multiple Comparisons Dependent Variable:protein 95% Confidence Interval Mean Difference (I) dong (J) dong LSD (I-J) Std Error 8.52448 658 -15.7368 23.5782 12.26000 8.52448 188 -7.3975 31.9175 17.31667 8.52448 077 -2.3408 36.9742 -3.92067 8.52448 658 -23.5782 15.7368 8.33933 8.52448 357 -11.3182 27.9968 13.39600 8.52448 155 -6.2615 33.0535 -12.26000 8.52448 188 -31.9175 7.3975 -8.33933 8.52448 357 -27.9968 11.3182 5.05667 8.52448 569 -14.6008 24.7142 -17.31667 8.52448 077 -36.9742 2.3408 -13.39600 8.52448 155 -33.0535 6.2615 -5.05667 8.52448 569 -24.7142 14.6008 Subset for alpha = 0.05 a Upper Bound 3.92067 protein Duncan Lower Bound Homogeneous Subsets dong Sig N 3 155.7433 160.8000 186 169.1393 173.0600 Sig .093 Means for groups in homogeneous subsets are displayed a Uses Harmonic Mean Sample Size = 3.000 Tr ng l ng phơn t c a b ng protein thang chu n Tr ngăl Rf (cm) ngăphânăt ă(Dal) Log Mw 0,075 118,000 5,071 0,132 90,000 4,954 0,320 50,000 4,698 0,433 34,000 4,531 0,515 26,000 4,414 0,612 19,000 4,278 th bi u di n s t ng quan gi a Log (tr ng l thang chu n v i Rf ng chu n protein HBsAg (BF 6015 - Aalto Bio) ng phơn t ) c a protein 187 3,5 y = 1,065x + 0,092 R 2,5 1,5 0,5 0 L 0,5 1,5 2,5 3,5 ng kháng nguyên HBsAg nh ng m u kh o sát ONEWAY HBsAg BY Dong /STATISTICS DESCRIPTIVES EFFECTS HOMOGENEITY /MISSING ANALYSIS /POSTHOC=DUNCAN LSD ALPHA(0.05) Oneway Notes Output Created 16-Aug-2015 11:09:30 Comments Input Active Dataset DataSet0 Filter Weight Split File N of Rows in Working Data File Missing Value Handling Definition of Missing 10 User-defined missing values are treated as missing Cases Used Statistics for each analysis are based on cases with no missing data for any variable in the analysis 188 Syntax ONEWAY HBsAg BY Dong /STATISTICS DESCRIPTIVES EFFECTS HOMOGENEITY /MISSING ANALYSIS /POSTHOC=DUNCAN LSD ALPHA(0.05) Resources Processor Time 00:00:00.015 Elapsed Time 00:00:00.016 Descriptives HBsAg 95% Confidence Interval for Mean Std N Mean Deviation Std Error Between- Lower Upper Bound Bound Component Minimum Maximum 2.0297E2 9.51600 5.49407 179.3321 226.6102 194.00 212.95 1.8699E2 10.54422 6.08771 160.7961 213.1827 175.98 197.00 3 1.7132E2 9.48032 5.47347 147.7700 194.8709 162.00 180.95 Total 1.8709E2 16.14746 5.38249 174.6816 199.5057 162.00 212.95 9.85920 3.28640 179.0522 195.1352 9.13692 147.7807 226.4067 Model Variance Fixed Effects Random 218.04885 Effects Test of Homogeneity of Variances HBsAg Levene Statistic 025 df1 df2 Sig 976 ANOVA HBsAg Sum of Squares Between Groups Within Groups Total Post Hoc Tests df Mean Square 1502.701 751.350 583.223 97.204 2085.923 F Sig 7.730 022 189 Multiple Comparisons Dependent Variable:HBsAg 95% Confidence Interval LSD (I) Dong (J) Dong 15.98174 8.05000 094 -3.7159 35.6794 31.65072* 8.05000 008 11.9531 51.3484 -15.98174 8.05000 094 -35.6794 3.7159 15.66898 8.05000 100 -4.0287 35.3666 -31.65072* 8.05000 008 -51.3484 -11.9531 -15.66898 8.05000 100 -35.3666 4.0287 Mean Difference (I-J) Std Error Sig Lower Bound Upper Bound * The mean difference is significant at the 0.05 level Homogeneous Subsets HBsAg Subset for alpha = 0.05 Dong Duncana N 3 171.3204 186.9894 186.9894 202.9712 Sig .100 094 Means for groups in homogeneous subsets are displayed a Uses Harmonic Mean Sample Size = 3.000 ng protein HBsAg/ protein t ng s T l protein HBsAg/ protein t ng s % th t l hƠm l 0,15 0,12 0,11 CC1 CC2 0,11 0,1 0,05 0 1C CC34 m u kh o sát [...]... Tween 20 12 TịM T T T O CÂY CẨ CHUA MANG GEN HBsAg B NG PH NG PHÁP BI N N P GEN DỐNG VI KHU N Agrobacterium tumefaciens Nghiênăc uăĎ c th căhi năt iăPhòngăCôngăngh Gen, Vi năSinh h căNhi tă Ď iă– Vi năHànălâmăKhoaăh căvàăCôngăngh Vi tăNamăvàăt iăTr ngă iăh căNôngă LâmăThànhăph ăH ăChíăMinh.ă M cătiêuăc a lu năánălàăt o cây cà chua mang gen HBsAg mưă hóaă proteină khángă nguyênă HBsAg ph că v ă h ngă... uătrên th ăgi iăhi nănayăv ăt oăproteinătáiă t ăh p HBsAg ăqu cà chua chuy n gen nh ălàă“vaccineă năĎ c”ăĎ ăphòngăng aă b nh vi măganăsiêu vi B M c tiêu c a lu n án T oă Ď c cây cà chua biă TN412ă mang gen HBsAg b ngă ph n p gen dùng vi khu n Agrobacterium tumefaciens ng pháp bi nă 18 Yêu c u c a lu n án - Hoànăthi năh ăth ngătáiăsinhăch iăin vitro t ăláăm măvàăxácăĎ nhăĎ căn ngă Ď ă t iă thi... XácăĎ nh s ăh pănh tăvàăbi uăhi năc a gen HBsAg, qua Ďi uăkhi năb iăpromoterăT7 - cóăngu năg căt ăth căkhu năth ăk tăh păv iăpromoteră PDS (Phytoene desaturase), ă cây/ qu ă cà chua chuy nă gen nh nă Ď bi năn p gen b ngăph că thôngă quaă ng pháp dùng vi khu n Agrobacterium tumefaciens ụ ngh a th c ti n: Cây cà chua mang gen mưă hóaă proteină khángă nguyênă HBsAg t oă ti nă Ď ă choă nhână gi ngă... ChâuăÂu, cà chua Ď căchuy năsangăChâuăPhiănh ănh ngăng iăth cădânăĎiăkhaiă pháăl căĎ a này.ăTr căkia, cà chua Ď h ăv i cây cà Ď căd c,ăvì cóămàuăs căqu ăĎ pănên cà chua ĎưăĎ c nh.ăMưiăĎ năn mă1750, cà chua m iăĎ th ăXVIII, cà chua m iăb tăĎ uăĎ chua Ď căchoăr ngălà cây cóăĎ căt ădo chúng cùngă cătr ngănh cây c dùng làmăth căph mă ăAnh.ăCu iăth ăk ă cătr ngă ăcácăn căthu căLiênăXôăc ă ăM , cà cănh... nh vi măganăB.ă Tính m i c a lu n án D aătrênăcácănghiênăc uătr qu ănghiênăc uănh năĎ căĎây v ăt o cây cà chua mang gen HBsAg, ăk tă c ăĎ ătàiănàyăcóătínhăm i là: L năĎ uătiênăt oăĎ dòng cây cà chua TN412ă(gi ngăth căm tăs ă ngăm i) mang vàăbi uăhi n gen HBsAg, ăĎ că Ďi uăkhi năb iăhaiăpromoterăT7 vàăpromoterăPDS,ăv iăk tăqu ălàmăt ngăs ăbi uăhi nă chuyênăbi tăproteinăkhángănguyên HBsAg ăqu cà chua. ă... production of transgenic tomato plants containing the HBsAg gene driven both by the PDS (phytoene desaturase) promoter and the T7 promoter The transformation protocol on TN412 tomato cultivar could be used in the genetic transformation of the other tomato cultivars 16 M U Lu năánă“T o cây cà chua mang gen HBsAg b ngăph dùng vi khu n Agrobacterium tumefaciens ă Ď ng pháp bi n n p gen c th c hi n t... Cà chua cóăth dùng làmăqu ăt i,ăxào,ăn u,ăn căgi iăkhát. Cà chua cònălàă nguyênăli uăch ăbi năthànhănhi uăs năph mănh cà chua côăĎ c,ăn t ng cà chua, ăt 1.1.3 Dinh d căqu ,ăn căs t,ă ngă t, cà chua Ďóngăh p ng trong qu cƠ chua Cà chua là cây rauă năqu ăgiàuăvitamin,ăcarotene,ăaminoăacid,ăĎ khoángă[133, 153].ăTheoăs ăli uăc a Vi năDinhăD ngăvàămu iă ngăn mă2007ă(b ngăphânătíchă thànhăph năhóaăh căc a Vi năv... păthànhăcông gen HBsAg vào láăm m cà chua nh Agrobacterium tumefaciens. ăCácădòng cây chuy n gen ĎưăĎ c ki m tra s hi n di năvàăbi u hi n gen HBsAg b ngăph dot blotting, ELISA Qu cà chua Ď ng pháp PCR,ă c cho chu tă n,ă k t qu cho th yă cóă s Ďápă ng mi n d ch (oral immunization) Nh ăv y,ănh ngăk tăqu ănghiênăc uănàyăchoăth yăr ngăcóăth ăs năxu tăvaccine r ă ti nă t ă nh ngă ph nă nă Ď ng că c aă cây tr... ăToxinăd chăt ăĎ că t ă cà chua căti tăt ăVibrio cholerae baoăg măti uăĎ năv ăAă vàăB.ăSauăĎóăg năvàoăreceptorăGM1-ganglioside. Cây cà chua Ď căbi năn păv i gen mưăhóaăti uăĎ năv ătoxinăBăd chăt ă(ctxB)ăcùngăv iătínăhi uămàngăn iăch tăd iăs ă ki măsoátăpromoterăCaMV 35S nh Agrobacterium tumefaciens. ăPhânătíchăPCRăvàă Southernăblotăki mătraăs ăcóăm tăc a gen ctxBă cây cà chua chuy n gen. ăPhânătíchă mi... căs ădiătruy nă c a gen ch năl cănptII và gen chuy nă m că tiêu HBsAg ăth ăh ă T1.ăK tăqu ăc ngă choăth yăs ăphânălyădiătruy năhai gen nóiătrênăc ăb năphùăh păquyălu tăMendelăv iă t ăl ă3:1.ă âyă làă nghiênă c uă Ď uă tiênă Ď ă c pă t oă cây cà chua mang gen HBsAg Ď că Ďi uăkhi năb iăhai promoter PDS (phytoene desaturase) vàăpromoterăT7.ăQuyătrìnhă chuy nă gen ă gi ngă cà chua TN412ă cóă th