TẠO cây cà CHUA MANG GEN HBsAg BẰNG PHƯƠNG PHÁP BIẾN nạp GEN DÙNG VI KHUẨN agrobacterium tumefaciens (tt)

4 Ki m tra s di truy n c a gen ch n l c nptII gen chuy n m c tiêu HBsAg th h T1 b ng ph ng pháp sinh h c đ nh tính PCR 2.2 V t li u nghiên c u 2.2.1 V t li u th c v t: H t cà chua TN412 (cà chua bi) (Công ty Trang Nông TP HCM) 6 2.2.2 Vi khu n: Agrobacterium tumefaciens LBA 4404 (do phòng Cơng ngh Gen, Phòng Thí nghi m Tr ng m phía Nam v Cơng ngh T bào Th c v t - Vi n Sinh h c Nhi t đ i cung c p) 2.2.3 Plasmid: S d ng plasmid pITB-HBsAg ( 16,78 kb) [do TS Nguy n H u Tâm (Vi n Sinh h c Nhi t đ i) thi t k ] mang gen: gusA (promoter T7, terminator T7); nptII (promoter CaMV35S); HBsAg mã hoá protein kháng nguyên b m t nh (S) đ c u n b i h th ng [promoter PDS (phytoene desaturase,  kb) + T7 RNA polymerase (2,7 kb)] t o s bi u hi n chuyên bi t 2.3 Ph mô qu ng pháp nghiên c u 2.3.1 Kh o sát nh h m m vƠ nh h ng c a BA, IAA lên s tái sinh ch i in vitro t ng c a kháng sinh kanamycin lên m m, cơy in vitro 2.3.1.1 Kh o sát nh h ng c a BA, IAA lên s tái sinh ch i in vitro t m m: Xác đ nh môi tr tr ng tái sinh v i n ng đ ch t u hòa sinh ng ( HST) BA, IAA thích h p cho t l m m tái sinh ch i (%), s ch i tái sinh/m u cao nh t đ i v i gi ng cà chua TN412 Thành ph n môi tr agar g/L, đ không đ i ng tái sinh môi tr ng MS v i vitamin B5, ng saccharose 30 g/L, b sung IAA 0,5 mg/L (n ng đ môi tr ng kh o sát), n ng đ BA thay đ i l n l 1,25; 1,50; 1,75; 2,00; 2,25; 2,50 mg/L M i môi tr th c hi n v i 30 m u c y Thí nghi m đ tồn ng u nhiên v i nghi m th c đ 2.3.1.2 nh h t ng tái sinh kh o sát c b trí theo ki u m t y u t hồn c l p l i l n ng c a kháng sinh kanamycin lên m m, cơy in vitro: Xác đ nh n ng đ t i thi u c a kanamycin gây c ch kh n ng tái sinh ch i gây ch t m m, cà chua in vitro đ áp d ng trình ch n l c nh ng m u chuy n gen gi đ nh Thí nghi m đ c b trí gi ng nh thí nghi m 2.3.1.1 2.3.2 Xơy d ng quy trình bi n n p gen vƠo m m cơy cƠ chua TN412 b ng ph ng pháp dùng vi khu n Agrobacterium tumefaciens: Các m u m m s d ng có kích th tr c mm x mm đ c ti n nuôi c y mơi ng tái sinh thích h p (thí nghi m 2.3.1.1) th i gian ngày Sau đó, cho d ch vi khu n (OD600 0,5) vào ng p m m th i gian 20 phút r i ti n hành nuôi chung m u m m v i Agrobacterium tumefaciens môi tr ng tái sinh có b sung acetosyringone n ng đ (100 µM) Sau ngày ni chung, di t vi khu n Agrobacterium tumefaciens, nuôi c y ch n l c m m môi tr ng tái sinh có b sung kháng sinh kanamycin 50 mg/L đ n hình thành mơ s o, phác th ch i, ch i chuy n gen hoàn ch nh 2.3.3 Ki m tra s hi n di n c a gen bi n n p vƠ s bi u hi n c a chúng b ng ph ng pháp hóa mơ t bƠo, sinh h c đ nh tính, hóa sinh 2.3.3.1 Ki m tra s bi u hi n đ nh tính c a gen kháng kanamycin nptII: Ch i l n (ch a có r , cao 1,5 - cm, tái sinh môi tr 50 mg/L) m nh th t (7 x mm, c a sinh tr không ch t tr HST) đ c nuôi c y môi tr ng MS không ch t HST môi tr ng kanamycin có ng mơi tr ng t ng ng ng: môi ng tái sinh t t nh t (BA 2,0 mg/L; IAA 0,5 mg/L) có b sung kanamycin 100 mg/L đ theo dõi kh n ng t ng tr ng (phát tri n r , thân, lá) t o mô s o, tái sinh 30 ngày; so sánh v i đ i ch ng 2.3.3.2 Ki m tra s hi n di n c a gen nptII, HBsAg b ng k thu t PCR: Tách chi t DNA t ng s dùng ph ng pháp CTAB (tham kh o tài li u c a tác gi Fulton cs (1995)) s d ng c p m i chuyên bi t đ i v i gen HBsAg (Srinivas cs., 2008) gen nptII đ khu ch đ i đo n DNA có kích th ct ng ng 681 bp 600 bp  ... ng nh thí nghi m 2.3.1.1 2.3.2 Xơy d ng quy trình bi n n p gen vƠo m m cơy cƠ chua TN412 b ng ph ng pháp dùng vi khu n Agrobacterium tumefaciens: Các m u m m s d ng có kích th tr c mm x mm đ c... hi n di n c a gen nptII, HBsAg b ng k thu t PCR: Tách chi t DNA t ng s dùng ph ng pháp CTAB (tham kh o tài li u c a tác gi Fulton cs (1995)) s d ng c p m i chuyên bi t đ i v i gen HBsAg (Srinivas... kanamycin lên m m, cơy in vitro: Xác đ nh n ng đ t i thi u c a kanamycin gây c ch kh n ng tái sinh ch i gây ch t m m, cà chua in vitro đ áp d ng trình ch n l c nh ng m u chuy n gen gi đ nh Thí nghi