Nghiên cứu tạo các dòng ngô mang gen Isopentenyl transferase (IPT) bằng phương pháp biến nạp nhờ vi khuẩn Agrobacterium Tumefaciens (Luận văn thạc sĩ)

Nghiên cứu tạo các dòng ngô mang gen Isopentenyl transferase (IPT) bằng phương pháp biến nạp nhờ vi khuẩn Agrobacterium Tumefaciens (Luận văn thạc sĩ)Nghiên cứu tạo các dòng ngô mang gen Isopentenyl transferase (IPT) bằng phương pháp biến nạp nhờ vi khuẩn Agrobacterium Tumefaciens (Luận văn thạc sĩ)Nghiên cứu tạo các dòng ngô mang gen Isopentenyl transferase (IPT) bằng phương pháp biến nạp nhờ vi khuẩn Agrobacterium Tumefaciens (Luận văn thạc sĩ)Nghiên cứu tạo các dòng ngô mang gen Isopentenyl transferase (IPT) bằng phương pháp biến nạp nhờ vi khuẩn Agrobacterium Tumefaciens (Luận văn thạc sĩ)Nghiên cứu tạo các dòng ngô mang gen Isopentenyl transferase (IPT) bằng phương pháp biến nạp nhờ vi khuẩn Agrobacterium Tumefaciens (Luận văn thạc sĩ)Nghiên cứu tạo các dòng ngô mang gen Isopentenyl transferase (IPT) bằng phương pháp biến nạp nhờ vi khuẩn Agrobacterium Tumefaciens (Luận văn thạc sĩ)Nghiên cứu tạo các dòng ngô mang gen Isopentenyl transferase (IPT) bằng phương pháp biến nạp nhờ vi khuẩn Agrobacterium Tumefaciens (Luận văn thạc sĩ)Nghiên cứu tạo các dòng ngô mang gen Isopentenyl transferase (IPT) bằng phương pháp biến nạp nhờ vi khuẩn Agrobacterium Tumefaciens (Luận văn thạc sĩ)Nghiên cứu tạo các dòng ngô mang gen Isopentenyl transferase (IPT) bằng phương pháp biến nạp nhờ vi khuẩn Agrobacterium Tumefaciens (Luận văn thạc sĩ)

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VIỆT NAM VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT  LUẬN VĂN THẠC SĨ Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 60420114 NGHIÊN C U TẠO CÁC NG NG ISOPENTENYL TRANSFERASE (IPT NẠP NH MANG G N NG PH NG PHÁP I N VI KHU N AGROBACTERIUM TUMEFACIENS Người hướng dẫn: PGS TS Nguyễn Văn Đồng H vi n : Tr n uy H ng Hà Nội – 2015 L i cảm n Để hoàn thành luận văn này, tơi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới guy n ăn Đ ng tận t nh, d u dắt, h ớng dẫn, truy n qu b u c ng nh t nh ng inh nghi ng vi n t o i u ki n giúp ỡ qu tr nh học tập nghi n cứu Tôi xin g i l i ơn ến phòng t o t o i u i n tận t nh h ớng dẫn ọi th t c ể tơi c thể hồn thành luận văn ôi xin g i l i ơn tới tập thể c n b hòng thí nghi m Trọng iể Công ngh tế bào hực vật - Vi n Di truy n ông nghi p giúp ỡ nhi t t nh suốt th i gian thực hi n h a luận Cuối c ng nh ng hông b n bè, nh ng ng gian i ph n quan trọng, xin g i tới bố mẹ, anh chị c ng quan tâ , ng h chỗ dựa cho suốt th i h a luận này, c ng nh cu c sống ôi ghi nhớ hông bao gi qu n giúp ỡ vô c ng to lớn ến tất qu th y cô, gia ôi xin g i nh, b n bè lòng biết ơn vô tận Hà Nội, ngày 24 tháng 12 năm 2015 Học viên n i y H ng M c c L i cảm n i M c c ii nh m c h nh v iv nh m c ảng v nh m c c c ch vi t t t vi M Đ U Ch ng –T NG QUAN 1.1 Nguồn gốc ngô 1.2 T nh h nh nghiên cứu ngô th giới 1.3 T nh h nh nghiên cứu ngô Việt Nam: 1.4 C sở ho học v nghiên cứu nạp gen vào thực vật ph ng ph p Agrobacterium tumefaciens 13 1.4.1 Ti-Plasmid 14 1.4.2 Chức c 1.4.3 C ch chuy n gen ằng A tumefaciens 16 1.4.4 Gen ch th - gen chọn ọc c ch hoạt động chọn lọc c a hygromycin 18 T-DNA 16 C ch ch u hạn t 1.5 ng già h gen IPT 19 1.5.1 C ch ch u hạn c 1.5.2 Hiện t 1.5.3 Đi u hò già h 1.5.4 Gen ipt promoter pSARK12 21 C c ph 1.6 Ph 1.6.2 Ki m tr v i trò c ng ph p Southern Cyto inin 20 ot 21 ch u hạn t i ng – VẬT LIỆU VÀ PH 2.1 c c y u tố ảnh h ởng 20 ng ph p i m tra c mặt i u c a gen bi n nạp 21 1.6.1 Ch ng già h thực vật 19 22 NG PHÁP 24 Vật liệu 24 2.1.1 Vật liệu thực vật 24 2.1.2 Ch ng vi khuẩn vector dùng chuy n gen 24 2.1.3 H 2.2 Ph chất thi t b sử d ng 24 ng ph p nghiên cứu 25 2.2.1 Quy tr nh chuy n gen vào phôi non thông qu vi huẩn Agrobacterium tumefaciens 25 ii 2.2.2 Phân tích chuy n gen ph 2.2.3 Đ nh gi 2.2.4 Đ nh gi h Đ 2.3 Ch ch u hạn c già c m, th i gi n ph ng ph p sinh học phân tử 27 c c dòng ngơ chuy n gen th i u iện 30 c t h i cành 31 ng ph p xử ý số liệu 31 ng - K T QUẢ 32 3.1 K t c 3.2 Ki m tr qu tr nh chuy n gen,chọn ọc t i sinh c ằng ph giống ngô 32 ng ph p sinh học phân tử 35 3.2.1 K t t ch chi t NA t ng số 35 3.2.2 K t phân tích chuy n gen ằng ph ng ph p PCR gen hpt 36 3.2.3 K t phân tích chuy n gen ằng ph ng ph p PCR gen ipt 37 3.2.4 K t phân tích Southern 3.3 K t đ nh gi 3.4 Ch ot c c dòng ngơ chuy n gen th hệ T 38 ch u hạn c K t đ nh gi qu tr nh h c c dòng ngơ chuy n gen th i già c hi c t 40 45 ng – THẢO LUẬN 46 4.1 Chuy n gen thông qu vi huẩn 46 4.2 Phân tích ằng ph 4.3 Đ nh gi s Ch ng ph p sinh học phân tử 47 ộ i u ch u hạn c u iện phòng thí nghiệm 49 ng – K T LUẬN VÀ KI N NGH 52 5.1 K t uận 52 5.2 Ki n ngh 52 TÀI LIỆU THAM KHẢO 53 PH L C 59 iii nh m c h nh v H nh 1: ấu trú Ti-plasmid 14 H nh : Hệ thống ve tor li n hợp 15 H nh : Hệ thống vector nhị thể (kép) 15 H nh 4: ấu trú T-DNA 16 H nh : S ấu trú ve tor pSI hyg-2 24 H nh : S quy tr nh huyển gen 27 H nh 7: Kh n ng ph h i- ti p nh n- t i sinh giống ng 32 H nh 8: T n số huyển gen gi ịnh 33 H nh 9: M t số h nh nh gi i o n huyển gen 33 H nh 10: K t qu iện i N t ng số 36 H nh 11: K t qu ph n t h P R gen hpt th hệ T0 37 H nh 12: K t qu ph n t h P R gen ipt th hệ T0 37 H nh 13: K t qu ph n t h P R gen ipt th hệ T1 38 H nh 14: K t qu Southern lot ng huyển gen th hệ T1 39 H nh 15: nh gi kh n ng hịu h n gi i o n y on nh lưới số r yx l h n 40 H nh 16: K t qu nh gi kh n ng hịu h n gi i o n y on n v o hi u o th n l v hi u i r i t i nh lưới số 41 H nh 17: K t qu nh gi kh n ng hịu h n gi i o n y on n v o tr ng lượng tư i t i nh lưới số 41 H nh 18: K t qu nh gi kh n ng hịu h n gi i o n y on n v o tr ng lượng kh t i nh lưới số 41 H nh 19: nh gi kh n ng hịu h n gi i o n y on nh lưới số r yx l h n 43 H nh 20: K t qu nh gi kh n ng hịu h n gi i o n y on n v o hi u o th n l v hi u i r i t i nh lưới số 43 H nh 21: K t qu nh gi kh n ng hịu h n gi i o n y on n v tr ng lượng tư i t i nh lưới số 44 H nh 22: K t qu nh gi kh n ng hịu h n gi i o n y on n v o tr ng lượng kh t i nh lưới số 44 H nh 23: nh gi qu tr nh h gi l H9 45 H nh 24: nh gi qu tr nh h gi l M8 45 iv nh m c ảng ng 1: Ph n lo i thực v t ng 2: T nh h nh s n xuất ng tr n th giới n m g n y ng 3: T nh h nh s n xuất ng Việt Nam n m g n y 10 ng 4: Th nh ph n inh ng 100g h t 11 ng 5: Tr nh tự m i 29 ng 6: K t qu t ng hợp th nghiệm huyển gen chịu h n 32 ng 7: Số opy gen huyển 39 v nh m c c c ch vi t t t WW i u kiện tưới nướ WS i u kiện x l h n SH hi u o th n l LRL hi u ir y i FWS Tr ng lượng tư i th n l FWR Tr ng lượng tư i r DWS Tr ng lượng kh th n l DWR Tr ng lượng kh r IM M i trường l y nhi m CCM M i trường REM M i trường nu i ph h i ECM M i trường h n l m s o SeM M i trường ph t sinh h i RM M i trường r r vi ng nu i M y ng l n m y lư ng thực quan tr ng cho n n kinh t to n y lư ng thự h nh sống on người ũng ược phẩm Ở lư ng thự Đ U a th giới S n phẩm từ ng ngo i l thực phẩm nu i ng v t r thể ược ng d ng nhi u ng nh nước Trung Mỹ, N m Á v h u Phi, người ta s d ng ng l m h nh ho người với phư ng th c qu n n i Ng l u, l m t ng theo vùng ị l v t p y lư ng thự giúp nhi u n i gi i quy t n n i Việt N m S n phẩm từ ng ngo i l thực phẩm nu i sống on người ũng ng v t r thể ược ng d ng ng nh kh ng ngo i việc s d ng l m hất ốt ược phẩm G n y th n n l nguy n liệu ti m n ng ể ch t o x ng sinh h c S n lượng ng h ng n m ị gi m sút ng kể nhi u nh n tố sinh v t (biotic) ũng phi sinh (abiotic) Trong h n h n l nguy n nh n phi sinh quan tr ng n s n lượng ng m t l n với lượng nướ mư ph n ố kh ng gi m n h n 70% ất kh ằn c ng n 1,3 tấn/ha u dẫn tới k t qu thu ho ch ng kể so với ti m n ng thu ượ h n 10 tấn/ [64] Ch nh kh t ng tố qu tr nh lão h l , suy gi m kh n ng qu ng hợp dẫn ằn ã l n gi m sút s n lượng [84] ytokinin v i tr thi t y u n nhi u qu tr nh t ng trưởng v ph t triển c a thực v t ặc biệt ph n hi t o in vitro, ytokinin t h o [68] Trong v i tr rõ r ng việ giúp m l t h rời ch m tho i iệp l c tố Ngay c thực ti n th việc x l thư ng m i lớn v ho h v kéo Trong phư ng ph p nh t ịnh việc t o giống ã ướ v o việc t o nghĩ a rau sau thu y [45] truy n thống ã th nh ng y hịu h n, th việc b sung v kỹ thu t y huyển gen th h ng ược với h n h n ũng u ch ng minh ược k t qu c n p gen ipt- mã h ytokinin ũng m ng ytokinin giúp uy tr xanh tư i l u h n i tu i th c a hoa sau cắt khỏi ng nghệ sinh h ng nghệ nu i m m nh ã nghi n enzyme isopentenyl tr nsfer se li n qu n u v bi n n sinh t ng hợp cytokinin isopentenyl adenine, ze tin v ihy roze tin v o m t số trường hợp như: lú - Oryza sativa [41], súp l - Brassica oleracea qu cho thấy [72] v x l h- Lactuca sativa L cv Evola [65], thuố l [84], v ng [85] u t th nh ng ịnh Nhằm ướ kh n ng hịu h n, húng t i ti n h nh mang gen isopentenyl transferase (ipt) huẩn Agrobacterium tumefaciens” với m  Bi n n p th nh  Kiểm tra  ướ y tr ng K t u u t o giống ng t i “Nghiên cứu tạo c c dòng ngơ ằng ph ng ph p i n nạp nh ti u: ng gen ipt v o m t số ng ng h nl c mặt c a gen ipt kỹ thu t sinh h nh gi kh n ng hịu h n ng [58], l c[78] ph n t y on th hệ T1 vi Ch ng –T NG QUAN 1.1 Nguồn gốc ngô Ng hay bắp t n kho h ngu n từ ti ng T y l Zea mays L Trong ti ng Anh từ “m ize” n Nh (m z) (“M ize”- Oxford English Dictionary online edition) Từ “ orn” thường hay s d ng n y l orn” nghĩ l “ y lư ng thực c người h g i rút g n c “In i n nh i ng” (“M ize”-Oxford English Dictionary online edition.) ảng 1: Phân oại thực vật Giới (kingdom): Plantae (kh ng ph n h ng): Angiosperms (kh ng ph n h ng): Monocots (kh ng ph n h ng): Commelinids B (order): Poales H (family): Poaceae Chi (genus): Zea Lo i (species): Z mays nhi u gi thuy t ượ ịnh: 1.Sự thu n h h v r v ngu n gốc c ng trực ti p từ cỏ teosinte 2.Ngu n gốc từ y l i giữ ng thu n ỏ teosinte 3.Tr i qua hai hay nhi u qu tr nh thu n h d i v teosinte 4.Ti n h 102] Những nghi n uv từ y l i c a Z diploperennis thu i truy n h g n n i l n nh n a c ng ho ng lo i Trips um [73, y ho qu tr nh thu n h i n r v o kho ng n m 7000 T N t i mi n trung Mexi o v t ti n ỏ teosinte ho ng s ng nghi n i g n giống với ng ng y n y nm ng n l lo i lưu vự ls s [36] George Beadle v o n m 1939 ã hi sẻ qu n iểm n y uc m nh v ngu n gố y ng [27] Trướ v o n m 1926 Vavilop ũng ã h ng minh mi n trung n m Mehi o l trung t m ph t sinh th v ... gốc ngô 1.2 T nh h nh nghiên cứu ngô th giới 1.3 T nh h nh nghiên cứu ngô Vi t Nam: 1.4 C sở ho học v nghiên cứu nạp gen vào thực vật ph ng ph p Agrobacterium tumefaciens. .. i ti n h nh mang gen isopentenyl transferase (ipt) huẩn Agrobacterium tumefaciens với m  Bi n n p th nh  Kiểm tra  ướ y tr ng K t u u t o giống ng t i Nghiên cứu tạo c c dòng ngô ằng ph ng... dùng chuy n gen 24 2.1.3 H 2.2 Ph chất thi t b sử d ng 24 ng ph p nghiên cứu 25 2.2.1 Quy tr nh chuy n gen vào phôi non thông qu vi huẩn Agrobacterium tumefaciens