Bước đầu nghiên cứu chuyển gen kháng thuốc trừ cỏ glyphosate vào cây đậu tương nhờ vi khuẩn agrobacterium tumefaciens

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - NGUYỄN THỊ LIỄU “BƢỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU CHUYỂN GEN KHÁNG THUỐC TRỪ CỎ GLYPHOSATE VÀO CÂY ĐẬU TƢƠNG NHỜ VI KHUẨN AGROBACTERIUM TUMEFACIENS” LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội – Năm 2014 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - NGUYỄN THỊ LIỄU “Bƣớc đầu nghiên cứu chuyển gen kháng thuốc trừ cỏ glyphosate vào đậu tƣơng nhờ vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens” Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 60 42 0114 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS Đặng Trọng Lƣơng (Viện Di truyền Nông nghiệp Việt Nam) GS.TS Phan Tuấn Nghĩa (Đại học Khoa học Tự nhiên-ĐHQGHN) Hà Nội – Năm 2014 LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành luận văn tốt nghiệp này, trƣớc tiên xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành sâu sắc tới PGS.TS Đặng Trọng Lƣơng GS.TS Phan Tuấn Nghĩa tận tình giúp đỡ, hƣớng dẫn trình thực hoàn thành luận văn Tôi xin chân thành cảm ơn thầy cô giáo trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên – Đại học Quốc Gia Hà Nội truyền thụ kiến thức tạo điều kiện thuận lợi trình học tập Cuối cùng, xin gửi lời cảm ơn tới tập thể cán Bộ môn Kỹ thuật Di truyền - Viện Di truyền Nông nghiệp giúp đỡ nhiệt tình suốt thời gian thực đề tài Hà Nội, ngày 19 tháng 11 năm 2014 Học viên Nguyễn Thị Liễu I KÝ HIỆU VIẾT TẮT BAP: 6-benzylaminopurin CaMV: Virus khảm súp lơ (Cauliflower Mosaic Virus) Car: Carbenicillin CS: Cộng FAO: Tổ chức lƣơng thực Nông nghiệp (Food and Agriculture Organization) GA3: Gibberellic acid GFP: Green Fluorescent Protein GMC: Cây trồng biến đổi gen (Genetically modified crop) GMO: Sinh vật biến đổi gen (Genetically modified origanism) GUS: β-1,4-Glucuronidase IAA: Indoleacetic acid IBA: Indole-3-butyric acid ISAAA: Tổ chức quốc tế tiếp thu ứng dụng công nghệ sinh học (International Services for the Acquisition of Agri-Biotech Application) LB: Luria Bertani L-Cys: L-Cystein MS-B5: Môi trƣờng Murashige and Skoog có bổ sung vitamin B5 α-NAA: α-Napthalene acetic acid nptII: Neomycin Phosphotransferase II PCR: Phản ứng chuỗi trùng hợp (Polymerase Chain Reaction) T-DNA: Transfer-DNA Ti-plasmid: Tumor-including Plasmid TAE: Tris - acetate - EDTA USDA: Bộ Nông nghiệp Mỹ (The United States Department of Agriculture) Vir: Virulence II DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 Tình hình sản xuất đậu tƣơng giới năm gần Error! Bookmark not defined Bảng 1.2 Tình hình sản xuất đậu tƣơng Việt Nam năm gần Error! Bookmark not defined Bảng 1.3 Hệ thống gen chọn lọc (selectable marker genes) gen thị (screenable marker genes) Error! Bookmark not defined Bảng 3.1 Ảnh hƣởng H2O2 đến khả khử trùng hạt giống đậu tƣơng DT2008 giống ĐT26 39 Bảng 3.2 Ảnh hƣởng BAP IBA lên khả tạo cụm chồi từ mầm Error! Bookmark not defined Bảng 3.3 Khả kéo dài chồi hai giống đậu tƣơng DT2008 ĐT26 Error! Bookmark not defined Bảng 3.4 Ảnh hƣởng α-NAA đến khả rễ giống đậu tƣơng DT2008 Error! Bookmark not defined Bảng 3.5.Biểu tạm thời gen gus lây nhiễm chủng Agrobacterium khác với nốt mầm giống đậu tƣơng DT2008 ĐT26 Error! Bookmark not defined Bảng 3.6 Kết thí nghiệm nghiên cứu ảnh hƣởng mật độ dung dịch vi khuẩn (OD600) đến khả biểu gen gus DT2008 ĐT26 .50 Bảng 3.7 Hiệu suất biến nạp vào đậu tƣơng theo thời gian biến nạp giống đậu tƣơng DT2008, ĐT26 Error! Bookmark not defined Bảng 3.8 Ảnh hƣởng thời gian đồng nuôi cấy đến biểu tạm thời gen gus Error! Bookmark not defined Bảng 3.9 Hiệu ức chế vi khuẩn A.tumefaciens ảnh hƣởng tổ hợp kháng sinh cefotaxim vancomycin đến khả tái sinh hai giống ĐT26 DT2008 Error! Bookmark not defined Bảng 3.10 Ảnh hƣởng kháng sinh kanamycin đến khả tái sinh mẫu mầm giống đậu tƣơng DT2008 ĐT26 Error! Bookmark not defined III IV DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1 Cấu trúc Ti-plasmid Error! Bookmark not defined Hình 1.2 Cấu trúc T-DNA Error! Bookmark not defined Hình 1.3 Quá trình chuyển gen vào thực vật Error! Bookmark not defined Hình 1.4 Sơ đồ cấu trúc vector liên hợp Error! Bookmark not defined Hình 1.5 Sơ đồ cấu trúc vector nhị phân Error! Bookmark not defined Hình 1.6 Cấu trúc chung vector pCAMBIA Error! Bookmark not defined Hình 1.7 Đột biến xảy EPSP-synthase làm cho kháng thuốc diệt cỏ glyphosate Error! Bookmark not defined Hình 2.1 Vector pCAMBIA2300 mang gen CP4-EPSPSError! Bookmark not defined Hình 3.1 Hình ảnh khử trùng đậu tƣơng H2O2 nồng độ 15% thời gian 10 phút .40 Hình 3.2 Hình ảnh cụm chồi môi trƣờng có bổ sung tổ hợp 2mg/l BAP + 0,1mg/l IBA sau tuần, tuần tuần nuôi cấyError! Bookmark not defined Hình 3.3 Hình ảnh kéo dài chồi đậu tƣơng sau tuần nuôi cấy 44 Hình 3.4 Hình ảnh rễ đậu tƣơng môi trƣờng bổ sung 0,5 mg/l αNAA………………………………………………………….…………46 Hình 3.5 Sơ đồ quy trình tái sinh hai giống đậu tƣơng DT2008 ĐT26….…….47 Hình 3.6 Biểu tạm thời gen gus đậu tƣơng DT2008 sau lây nhiễm với chủng khuẩn Error! Bookmark not defined Hình 3.7 Kết thí nghiệm nghiên cứu ảnh hƣởng mật độ dung dịch vi khuẩn đến khả biểu gen gus hai giống đậu tƣơng DT2008 ĐT26 50 Hình 3.8 Ảnh hƣởng thời gian biến nạp đến biểu tạm thời gen gus đậu tƣơng DT2008 ĐT26 Error! Bookmark not defined Hình 3.9 Các mẫu giống đậu tƣơng môi trƣờng đồng nuôi cấy Error! Bookmark not defined V Hình 3.10 Các mẫu đậu tƣơng công thức đối chứng (A, B), giống DT2008, ĐT26 sau rửa khuẩn (C, D) môi trƣờng chọn lọc sau tuần nuôi cấy (E, G) Error! Bookmark not defined Hình 3.11 Ảnh hƣởng nồng độ kanamycin đến khả tái sinh chồi từ mầm giống đậu tƣơng DT2008 Error! Bookmark not defined Hình 3.12 Sơ đồ quy trình chuyển gen kháng thuốc trừ cỏ CP4-EPSPS thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens 60 Hình 3.13 Một số hình ảnh quy trình chuyển gen CP4-EPSPS vào đậu tƣơng thông qua vi khuẩn Agrobacterium Error! Bookmark not defined Hình 3.14 Sản phẩm điện di phản ứng PCR nhân gen CP4-EPSPS từ mẫu DNA genome đậu tƣơng DT2008 biến nạpError! Bookmark not defined Hình 3.15 Sản phẩm điện di phản ứng PCR nhân gen CP4-EPSPS từ mẫu DNA genome đậu tƣơng ĐT26 biến nạpError! Bookmark not defined VI MỤC LỤC MỞ ĐẦU Error! Bookmark not defined CHƢƠNG I - TỔNG QUAN TÀI LIỆU Error! Bookmark not defined 1.1 Giới thiệu chung đậu tƣơng Error! Bookmark not defined 1.1.1 Nguồn gốc Error! Bookmark not defined 1.1.2 Phân loại Error! Bookmark not defined 1.1.3 Vai trò đậu tƣơng Error! Bookmark not defined 1.1.4 Tình hình sản xuất đậu tƣơng giới Việt Nam Error! Bookmark not defined 1.1.4.1 Tình hình sản xuất đậu tƣơng giớiError! Bookmark not Bookmark not defined 1.4.2 Tình hình sản xuất đậu tƣơng Việt NamError! defined 1.2 Tổng quan trồng chuyển gen đậu tƣơng chuyển gen giới Việt Nam Error! Bookmark not defined 1.2.1 Tổng quan trồng chuyển gen giới Việt Nam Error! Bookmark not defined 1.2.2 Tổng quan đậu tƣơng chuyển gen giới Việt NamError! Bookmark not defined 1.3 Ứng dụng nuôi cấy mô tế bào việc xây dựng hệ thống tái sinh đậu tƣơng Error! Bookmark not defined VII 1.4 Vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens trình chuyển T-DNA vi khuẩn vào tế bào thực vật Error! Bookmark not defined 1.4.1 Khái quát chung vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens Error! Bookmark not defined 1.4.2 Ti-plasmid Error! Bookmark not defined 1.4.3 Quá trình vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens chuyển T-DNA vào tế bào thực vật tự nhiên Error! Bookmark not defined 1.5 Quá trình chuyển gen thực vật thông qua Agrobacterium tumefaciens Error! Bookmark not defined 1.5.1 Khái quát chung chuyển gen thực vật Error! Bookmark not defined 1.5.2 Hệ thống vector chuyển gen thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens Error! Bookmark not defined 1.5.3 Các gen chọn lọc gen thị Error! Bookmark not defined 1.5.4 Các yếu tố ảnh hƣởng đến hiệu biến nạp thông qua A.tumefaciens Error! Bookmark not defined 1.6 Nghiên cứu chuyển gen kháng thuốc trừ cỏ glyphosate đậu tƣơng Error! Bookmark not defined 1.6.1 Cơ chế kháng glyphosate Error! Bookmark not defined 1.6.2 Đậu tƣơng chuyển gen kháng glyphosate Error! Bookmark not defined 1.7 Phƣơng pháp PCR việc xác định chuyển genError! Bookmark not defined 1.7.1 Kỹ thuật PCR yếu tố cần thiết Error! Bookmark not defined 1.7.2 Xác định có mặt gen đƣợc chuyển kỹ thuật PCR Error! Bookmark not defined CHƢƠNG II: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨUError! Bookmark not defined 2.1 Vật liệu nghiên cứu Error! Bookmark not defined 2.1.1 Vật liệu thực vật Error! Bookmark not defined 2.1.2 Vật liệu vi khuẩn Error! Bookmark not defined VIII 2.2 Hóa chất thiết bị Error! Bookmark not defined 2.2.1 Hóa chất môi trƣờng Error! Bookmark not defined 2.2.2 Các thiết bị thí nghiệm Error! Bookmark not defined 2.3 Địa điểm thời gian tiến hành Error! Bookmark not defined 2.3.1 Địa điểm………………………………………………………………….28 2.3.2 Thời gian tiến hành Error! Bookmark not defined 2.4 Nội dung nghiên cứu Error! Bookmark not defined 2.5 Phƣơng pháp nghiên cứu Error! Bookmark not defined CHƢƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Error! Bookmark not defined 3.1 Xây dựng quy trình tái sinh đậu tƣơng Error! Bookmark not defined 3.1.1 Kết nghiên cứu ảnh hƣởng H2O2 đến khả khử trùng hạt Error! Bookmark not defined 3.1.2 Kết nghiên cứu ảnh hƣởng tổ hợp BAP IBA đến khả tạo chồi từ mầm nốt mầm giống đậu tƣơng nghiên cứu Error! Bookmark not defined 3.1.3 Kết nghiên cứu ảnh hƣởng GA3 đến khả kéo dài chồi giống đậu tƣơng nghiên cứu Error! Bookmark not defined 3.1.4 Kết nghiên cứu ảnh hƣởng α-NAA đến khả hình thành rễ giống đậu tƣơng nghiên cứu Error! Bookmark not defined 3.2 Tối ƣu hóa trình chuyển gen xây dựng quy trình chuyển gen kháng thuốc trừ cỏ vào hai giống đậu tƣơng DT2008 ĐT26 thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens Error! Bookmark not defined 3.2.1 Kết nghiên cứu xác định chủng vi khuẩn Agrobacterrium tumefaciens phù hợp để chuyển gen CP4-EPSPS vào giống đậu tƣơng DT2008, ĐT26 Error! Bookmark not defined 3.2.2 Kết nghiên cứu ảnh hƣởng mật độ dung dịch vi khuẩn (OD) đến hiệu chuyển gen vào giống DT2008 ĐT26Error! defined IX Bookmark not 3.2.3 Kết nghiên cứu ảnh hƣởng thời gian lây nhiễm vi khuẩn A tumefaciens đến hiệu chuyển gen giống đậu tƣơng DT2008, ĐT26 Error! Bookmark not defined 3.2.4 Kết nghiên cƣ́u ảnh hƣởng của thời gian đ ồng nuôi cấy đến hiệu chuyển gen vào DT2008 ĐT26 Error! Bookmark not defined 3.2.5 Nghiên cứu ảnh hƣởng tổ hợp kháng sinh cefotaxim vancomycin đến hiệu ức chế vi khuẩn Error! Bookmark not defined 3.2.6 Kết nghiên cứu ảnh hƣởng nồng độ kanamycin đến sức sống khả tái sinh mẫu mầm giống DT2008 ĐT26Error! Bookmark not defined 3.3 Kiểm tra có mặt gen CP4-EPSPS mẫu đậu tƣơng DT2008 ĐT26 biến nạp Error! Bookmark not defined 3.3.1 Kết kiểm tra có mặt gen CP4-EPSPS mẫu đậu tƣơng DT2008 biến nạp Error! Bookmark not defined 3.3.2 Kết kiểm tra có mặt gen CP4-EPSPS mẫu đậu tƣơng ĐT26 biến nạp Error! Bookmark not defined Chƣơng IV - KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ Error! Bookmark not defined TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC X TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT Đái Duy Ban, Lữ Thị Cẩm Vân (1994), Công nghệ gen công nghệ sinh học ứng dụng nông nghiệp đại, NXB Nông nghiệp, tr 11-22 Báo cáo tóm tắt số 39-2008 ISAAA (2008), “Hiện trạng trồng CNSH/cây trồng chuyển gen toàn cầu năm 2008”, http://agbiotech.com.vn/ Lê Trần Bình, Hồ Hữu Nhị, Lê Thị Muội (1997), Công nghệ sinh học thực vật cải tiến giống trồng, NXB Nông nghiệp Hà Nội, tr 62-78 Nguyễn Đức Doanh (1998), “Tổng quan chuyển gen từ 1986- 1997” Báo cáo Hội nghị toàn quốc lần thứ công nghệ sinh học lúa, Huế, tháng 5/1998 Trần Quốc Dung, Nguyễn Hoàng Lộc, Trần Thị Lệ (2006), Công nghệ chuyển gen (động vật, thực vật), NXB Đại học Huế, tr 117-120 Trần Văn Điền (2007), Giáo trình Đậu tương, NXB Nông Nghiệp Hà Nội, tr 3-8 Lê Tấn Đức, Nguyễn Hữu Hổ, Nguyễn Văn Uyển (2003), “Tạo Hông (Paulownia fortunei) chuyển gen kháng sâu thông qua Agrobacterium tumefaciens”, Hội nghị công nghệ sinh học toàn quốc 2003, tr 1088-1090 Phạm Thị Hạnh, Lê Đức, Nguyễn Hữu Hổ, Nguyễn Văn Uyển (2005), Khảo sát khả tái sinh cải (Brassica integrifolia) từ mầm trụ mầm phục vụ cho nghiên cứu chuyển gen, NXB Khoa học kỹ thuật Hà Nội, tr 498450 Nguyễn Thị Lan Hoa, Doãn Thị Hòa, Đặng Trọng Lƣơng, Vũ Đức Quang, Phí Công Nguyên, Đặng Thị Minh Trang, Đỗ Minh Huy (2003), “Những kết ban đầu chuyển gen Anti-ACO vào hoa cúc”, Thông tin công nghệ sinh học ứng dụng, Bộ Nông nghiệp Phát triển nông thôn-Viện Di truyền Nông nghiệp, 2+3/2003, tr 20-26 10 Trần Thị Cúc Hòa (2008), “Hiệu tạo dòng đậu tƣơng biến đổi gen từ giống MTĐ 176, KL202, Maverick William 82 phƣơng pháp nốt mầm qua trung gian Agrobacterium tumefaciens”, Tạp chí Nông nghiệp phát triển nông thôn, 1, tr 14-19 11 Trần Thị Cúc Hòa (2008),“Tối ƣu hóa trình chuyển gen đậu tƣơng cải tiến phƣơng pháp lây nhiễm với Agrobacterium tumefaciens”, Tạp chí Nông nghiệp phát triển nông thôn, 9, tr 8-11 12 Phạm Xuân Hội, Trần Duy Quý (2002), “Công nghệ gen việc tăng sản lƣợng lúa”, Thông tin công nghệ sinh học ứng dụng, Bộ Nông nghiệp Phát triển nông thôn - Viện Di truyền Nông nghiệp, 3+4/2002, tr 1-10 13 Lê Thị Ánh Hồng (2000), Cơ sở khoa học công nghệ chuyển gen thực vật, NXB Nông Nghiệp, tr 51- 84 14 Lê Thị Thu Hiền (2003), Tạo chủng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens mang gen kháng côn trùng để chuyển vào trồng, Luận án tiến sĩ sinh học, Viện khoa học Công nghệ Việt Nam 15 Nguyễn Thị Thuý Hƣờng, Trần Thị Ngọc Diệp, Nguyễn Thu Hiền, Chu Hoàng Mậu (2009), “ Phát triển hệ thống tái sinh in vitro đậu tƣơng (Glycine max (L.) Merill) phục vụ chuyển gen”, Tạp chí khoa học & công nghệ, 52(4), tr 89-93 16 Trần Bích Lan, Nguyễn Đức Doanh, Nguyễn Lan Hƣơng, Vũ Đức Quang, Trần Duy Quý (1998),“Kết bƣớc đầu nghiên cứu chuyển gen vào giống lúa trồng Việt Nam qua Agrobacterium tumefaciens”, Báo cáo hội nghị toàn quốc công nghệ sinh học lúa, Huế, tháng 5/1998 17 Đặng Trọng Lƣơng, Vũ Đức Quang, Nguyễn Đức Doanh, Nguyễn Hữu Đống (2000), “Nghiên cứu chuyển gen CryIAc kháng sâu vào số giống cải bắp”, Kết nghiên cứu khoa học 1999 – 2000, Viện Di Truyền Nông Nghiệp, tr 120-128 18 Lã Tuấn Nghĩa, Trần Lan Hƣơng, Nguyễn Đức Doanh, Vũ Đức Quang, Trần Duy Quý (1995), “Bƣớc đầu nghiên cứu chuyển gen vào cà chua qua Agrobacterium”, Tạp chí công nghệ sinh học ứng dụng, 2, tr 18-23 19 Đỗ Tiến Phát, Đinh Thị Phòng, Chu Hoàng Hà (2008), “Đánh giá ảnh hƣởng thời gian nhiễm khuẩn tới hiệu chuyển gen vào (Gossypium hirsutum L.) thông qua Agrobacterium tumefaciens”, Tạp chí công nghệ sinh học, 6(4A), tr 689-695 20 Đinh Thị Phòng, Nguyễn Thị Thu (2007),“Chuyển gen gus vào đỉnh phôi hạt chín giống đậu tƣơng ĐT12 thông qua Agrobacterium tumefaciens”, Tạp chí Công nghệ sinh học, 4, tr 471-478 21 Nguyễn Đỗ Phúc, Nguyễn An Huy (2010), “Đánh giá sàng lọc có mặt GMO sản phẩm bắp đậu nành”, Tạp chí y học TP Hồ Chí Minh, 14 (2) 22 Khuất Hữu Thanh (2006), Cơ sở di truyền phân tử kỹ thuật gen, NXB Khoa học kỹ thuật Hà Nội, tr 156-160 23 Quyền Đình Thi, Nông văn Hải (2008), Những kỹ thuật PCR ứng dụng phân tích gen, NXB Khoa học tự nhiên Công nghệ, tr 43-58 24.Nguyễn Thị Thƣ, Đỗ Tiến Phát, Lê Thị Muội, Đinh Thị Phòng (2007), “Tái sinh in vitro qua phôi soma từ mầm hạt chƣa chín đậu tƣơng (Glycine Max (L.) Merrill)”, Tạp chí công nghệ sinh học, 5(2), tr 247-253 25 Tổng cục thống kê (2012), Niên giám thống kê 2011, NXB Thống kê, Hà Nội 26 Trung tâm thông tin PTNNNT-Viện sách chiến lƣợc PTNNNTBộ Nông nghiệp & PTNT (2010), Bản tin tháng 3/2010 ngành hàng lương thực, Bộ NN&PPNT Hà Nội 27 Vietrade (2013), “Sản xuất tiêu thụ đậu nành Việt Nam 2013 số dự báo”, http://www.vietrade.gov.vn/nong-sn-khac/4258-nganh-u-tng-vit-nam-nm- 2013-va-mt-s-d-bao.html TÀI LIỆU TIẾNG ANH 28 Baerson S., Rodriguez D., Tran M., Feng Y., Biest N., Dill G (2002), “Glyphosate-resistant goosegrass Identification of a mutation in the target enzyme 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase”, Plant Physiology, 129, pp 12651275 29 Bayer CropScience (2009),“Bayer CropScience expands Global R&D activities in seeds and traits by setting up new research focus area in cereals”, Bayer Crop Scienc, July 21, 2009 30 Bertheau Y., Diolez A., Kobilinsky A., Magin K (2002), “Detection methods and performance criteria for gennetically modified organisms”, Journal of AOAC International, 85 (3), pp 801-808 31 Carlson R (2009), “The Market Value of GM Products”, Nature Biotechnology, 27, pp 984 32 Cheng M., Lowe B.A., Spencer T.M., Ye X.D and Armstrong C.L (2004), "Factors influencing Agrobacterium-mediated transformation of monocotyledonous species In Vitro Cellular and Developmental”, BiologyPlant, 40(1), pp 31-45 33 NagadharaD., RameshS., PasaluI C., Kondala R Y., KrishnalahN V., SarmaN P., BownD P., GatehouseJ.A., Reddy V D and Rao K V (2003), “Transgenic indica rice resistant to sap-sucking insests”, Plant Biotechnology Journal, 1, pp 231-240 34 FAOSTAT (2009), Agricultural data, available from: http://faostat.fao.org./ 35 Finer J.J (1988), “Apical proliferation of embryogenic tissue of soybean [Glycine max (L.) Merrill]”, Plant Cell Reports, 7, pp 238-241 36 Frame B.R., McMurray J.M., Fonger T.M., Main M.L., Taylor K.W., Torney F.J., Paz M.M., Wang K (2006), “Improved Agrobacterium-mediated transformation of maize embryos using a standard binary vector system”, Plant Cell Report, 129, pp 13-22 37 Fu Yuqing, LucchinM and Lupotto E (1995), "Rapid and efficient regeneration from cotyledonary explants of soybean cultivars (Glycine max L,)", Journal of Genetics and Breeding, 49(4), pp 339-342 38 Heather A Fitzgerald, Patrick E Canlas, Maw-Sheng Chern and Pamela C Ronald (2005), “Alteration of TGA factor activity in rice results in enhanced tolerance to Xanthomonas oryzae pv.”, The Plant Journal, 43, pp 335-347 39 Hirofumi Uchimiya, SeiichiFujii, Jirong Huang, Takaomi Fushimi, Masanori Nishioka, Kyung-Min kim, Mawai Yamada, Takamitsukurusu, Kazuyuki Kuchitsu and Michito Tagawa (2002), “Transgenic rice plants conferring increased tolerance to rice blast and multiphe environmental stresses”, Molecular Breeding, 9, pp 25-31 40 Hsu-Yang Lin, Lih-Chiueh, Daniel Yang-Chih Shih (2000), “Detection of genetically modified soybeans and maize by the Polymerase chain reaction method”, Journal of Food and Drug Analysis, 8(3), pp 200-207 41 Hymowitz T and Newell C.A (1981), “Taxonomy of the genus Glycine domestication and uses of soybeans”, Economic Botany, 35, pp 272-288 42 ISAAA (2009), “ISAAA Celebrates the Life of its Founding Patron, Nobel Peace Laureate Dr Norman E Borlaug (1914-2009")”, ISAAA Brochure available from: http://www.isaaa.org/kc/cropbiotechupdate/tribute/borlaug/ISAAATribute.pdf 43 Jones E.D., and Mullin J.M (1974), “The effect of potato virus X on susceptibility of potato tubers to Fusarium roseum”, “Avenaceum”, American Journal of Potato Research, 51, pp 209-251 44 Li D., Chen P., Alloatti J., Shi A and Chen Y F (2010),“Identification of New Alleles for Resistance to Soybean Mosaic Virus in Soybean”, Published in Crop Science, 50, pp 649-655 45 Liu S.J., Wei Z.M., Huang J.Q (2008), “The effect of co-cultivation and selection parameters on Agrobacterium-mediated transformation of Chinese soybean varieties”, Plant Cell Reports, 28, pp 489-498 46 Mayolo G.A., Maximova S.N., Piskak S., Guiltinan M.J (2003), “Moxalactam as a counter-selection antibiotic for Agrobacterium-mediated transformation and its positive effects on Theobroma cacao somatic embryogenesis”, Plant Science Amsterdam, 164, pp 607-615 47 Olhoft P.M., Flagel L.E., Donovan C.M., Somers D.A (2003), "Efficient soybean transformation using hygromycine B selection in the cotylendonarynode method", Planta, 216, pp 723-735 48 TinjuangjunP., LocN.T., GatehouseA.M.R., Gatehouse J.A and Christou P (2000), “Enhanced insect resistance in Thai rice varieties generated by particle bombardment”, Molecular Breeding, 6, pp 391-399 49 Pierick R.L.M (1997), "In vitro culture of higher plants”, Plant cell, tissue and organ culture, pp 45–46 50 Priestman, M., Healy, M., Becker, A., Alberg, D., Bartlett, P., Lushington G., Schonbrunn E (2005), “Interaction of phosphonate analogues of the tetrahedral reaction intermediate with 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase in atomic detail”, Biochemistry, 44, pp 3241 – 3248 51 Phundan Singh (2001), “Genetics Today”, Kalyani Publishers, pp 88 52 Ranch JP., Oglesby L., Zielinski AC (1985), “Plant regeneration from embryo derived tissue cultures of soybean”, In Vitro Cell and Dev Biol, 21, pp 653-658 53 Silva J.A.T.; Nhut D.T.; Tanaka M.; Fukai S (2003), “The effect of antibiotics on the in vitro growth response of chrysanthemum and tobacco stem transverse thin cell layer (tTCLs)”, Scientia Horticulturae Amsterdam, 97, pp 397-410 54 Stachel S.E., Nester E.W., and Zambryski P (1986), “A plant cell factor induces Agrobacterium tumefaciensvir gene expression”, Proceedings of the National Academy of Sciences of USA, 83, pp 379– 383 55 Susumu Hiraga, Hiroshi Minakawa, Koji Takahashi, Ryoji Takahashi, Akita Hajika, Kyuya Harada, Norihiro Ohtsubo (2007), “Evaluation of somatic embryogenesis from immature cotyledons of Japanese soybean cultivars” Plant Biotechnology, 24, 435-440 56 Suryadevara S.R., Lewamy M., Matt M., Raghuveer P., Prachuab K and David H (2009), “Non-antibiotic selection systems for soybean somatic embryos: the lysine analog aminoethyl-cysteine as a selection agent”, BMC Biotechnology, 94, pp.1472-1489 57 Tran Thi Cuc Hoa, Tran Vu Hai and La Cao Thang (2008), “Transformation efficiencies of the Soybean Variety PC 19 [Glycine max (L.) Merrill] using Agrobacterium tumefaciens and the cotyledonary node method”, Omorice, 16, pp 1-8 58 Tzu-Ming Pan (2002), “Current status and detection of genetically modified organism”, Journal of Food and Drug Analysis, 10(4/2002), pp 229-241 59 USDA National Agriculture Statistics Service (NASS) (2009), “Adoption of Genetically Engineered Crops in the National Agriculture Statistics”,http://www.ers.usda.gov/Data/BiotechCrops/ 60 Wang Z., Libault M., Joshi T., Valliyodan B., Nguyen H T., Xu D., Stacey G., Cheng J (2010), “A knowledge database of soybean transcription factors”, BMC Plant Biology, pp.10-14 61 Wei D and Zhi-ming W (2007), “An optimized Agrobacterium-mediated transformation for soybean for expression of binary insect resistance genes”, Plant Science, 173( 4), pp 381-389 62 Wiebke B., Ferreira F., Pasquali G., Bodanese-Zanettini M.H., Droste A (2006), “Influence of antibiotics on embryogenic tissue and Agrobacterium tumefaciens suppression in soybean genetic transformation”, Bragantia, 65 (4) B (2006), “A 63 Xue R G., Xie H.F., Zhang multi-needle-assisted transformation of soybean cotyledonary node cells”, Biotechnology Letters, 28, pp 1551-1557 64 Young Jin Kim,Tae II Park, Hyun Soon Kim, Ho Ki Park, Sang Uk Chon, Song Joong Yun (2004), “Factors affecting soma embryogenesis from immature cotyledon of soybean”, Journal of Plant Biotechnology, 6, pp 45-50 65 Yoichi Kita, Keito Nishizawa, Masakazu Takahashi, Masahiko Kitayama, Masao Ishimoto (2007), “Genetic improvement of the somatic embryogenesis and regeneration in soybean and transformation of the improved breeding lines”, Plant Cell Reports, 26, pp 439–447 66 Zeng P., Vadnais D.A., Zhang Z., Polacco J.C (2004), “Refined glufosinate selection in Agrobacterim-mediated transformation of soybean (Glycine max (L.) Merrill)”, Plant Cell Reports, 22, pp 478-482 67 ZHU Chengsong, GU Heping and CHEN Xin (1999), "Advances in the Genetic Engineering of Insect-Resistant Soybeans", Soybean Science Journal, 18(3), pp 260-264 [...]... thuốc trừ cỏ vào hai giống đậu tƣơng DT2008 và ĐT26 thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens Error! Bookmark not defined 3.2.1 Kết quả nghiên cứu xác định chủng vi khuẩn Agrobacterrium tumefaciens phù hợp để chuyển gen CP4-EPSPS vào giống đậu tƣơng DT2008, ĐT26 Error! Bookmark not defined 3.2.2 Kết quả nghiên cứu ảnh hƣởng của mật độ dung dịch vi khuẩn (OD) đến hiệu quả chuyển gen vào. .. giống đậu tƣơng nghiên cứu Error! Bookmark not defined 3.1.3 Kết quả nghiên cứu ảnh hƣởng của GA3 đến khả năng kéo dài chồi của các giống đậu tƣơng nghiên cứu Error! Bookmark not defined 3.1.4 Kết quả nghiên cứu ảnh hƣởng của α-NAA đến khả năng hình thành rễ của các giống đậu tƣơng nghiên cứu Error! Bookmark not defined 3.2 Tối ƣu hóa quá trình chuyển gen và xây dựng quy trình chuyển gen kháng thuốc. .. Quý (1998),“Kết quả bƣớc đầu nghiên cứu chuyển gen vào giống lúa trồng ở Vi t Nam qua Agrobacterium tumefaciens , Báo cáo hội nghị toàn quốc về công nghệ sinh học cây lúa, Huế, tháng 5/1998 17 Đặng Trọng Lƣơng, Vũ Đức Quang, Nguyễn Đức Doanh, Nguyễn Hữu Đống (2000), Nghiên cứu chuyển gen CryIAc kháng sâu vào một số giống cải bắp”, Kết quả nghiên cứu khoa học 1999 – 2000, Vi n Di Truyền Nông Nghiệp,... 14 Lê Thị Thu Hiền (2003), Tạo chủng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens mang gen kháng côn trùng để chuyển vào cây trồng, Luận án tiến sĩ sinh học, Vi n khoa học và Công nghệ Vi t Nam 15 Nguyễn Thị Thuý Hƣờng, Trần Thị Ngọc Diệp, Nguyễn Thu Hiền, Chu Hoàng Mậu (2009), “ Phát triển hệ thống tái sinh in vitro ở cây đậu tƣơng (Glycine max (L.) Merill) phục vụ chuyển gen , Tạp chí khoa học & công nghệ,... quả nghiên cứu ảnh hƣởng của thời gian lây nhiễm vi khuẩn A tumefaciens đến hiệu quả chuyển gen trên giống đậu tƣơng DT2008, ĐT26 Error! Bookmark not defined 3.2.4 Kết quả nghiên cƣ́u ảnh hƣởng của thời gian đ ồng nuôi cấy đến hiệu quả chuyển gen vào DT2008 và ĐT26 Error! Bookmark not defined 3.2.5 Nghiên cứu ảnh hƣởng của tổ hợp kháng sinh cefotaxim và vancomycin đến hiệu quả ức chế vi. .. “Bƣớc đầu nghiên cứu chuyển gen vào cà chua qua Agrobacterium , Tạp chí công nghệ sinh học ứng dụng, 2, tr 18-23 19 Đỗ Tiến Phát, Đinh Thị Phòng, Chu Hoàng Hà (2008), “Đánh giá ảnh hƣởng của thời gian nhiễm khuẩn tới hiệu quả chuyển gen vào cây bông (Gossypium hirsutum L.) thông qua Agrobacterium tumefaciens , Tạp chí công nghệ sinh học, 6(4A), tr 689-695 2 20 Đinh Thị Phòng, Nguyễn Thị Thu (2007), Chuyển. .. Trần Quốc Dung, Nguyễn Hoàng Lộc, Trần Thị Lệ (2006), Công nghệ chuyển gen (động vật, thực vật), NXB Đại học Huế, tr 117-120 6 Trần Văn Điền (2007), Giáo trình cây Đậu tương, NXB Nông Nghiệp Hà Nội, tr 3-8 7 Lê Tấn Đức, Nguyễn Hữu Hổ, Nguyễn Văn Uyển (2003), “Tạo cây Hông (Paulownia fortunei) chuyển gen kháng sâu thông qua Agrobacterium tumefaciens , Hội nghị công nghệ sinh học toàn quốc 2003, tr 1088-1090... Nguyễn Văn Uyển (2005), Khảo sát khả năng tái sinh cây cải ngọt (Brassica integrifolia) từ lá mầm và trụ mầm phục vụ cho nghiên cứu chuyển gen, NXB Khoa học và kỹ thuật Hà Nội, tr 498450 9 Nguyễn Thị Lan Hoa, Doãn Thị Hòa, Đặng Trọng Lƣơng, Vũ Đức Quang, Phí Công Nguyên, Đặng Thị Minh Trang, Đỗ Minh Huy (2003), “Những kết quả ban đầu chuyển gen Anti-ACO vào cây hoa cúc”, Thông tin công nghệ sinh học ứng... defined 2.4 Nội dung nghiên cứu Error! Bookmark not defined 2.5 Phƣơng pháp nghiên cứu Error! Bookmark not defined CHƢƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Error! Bookmark not defined 3.1 Xây dựng quy trình tái sinh cây đậu tƣơng Error! Bookmark not defined 3.1.1 Kết quả nghiên cứu ảnh hƣởng của H2O2 đến khả năng khử trùng hạt Error! Bookmark not defined 3.1.2 Kết quả nghiên cứu ảnh hƣởng của... (2008), “Hiện trạng cây trồng CNSH /cây trồng chuyển gen trên toàn cầu năm 2008”, http://agbiotech.com.vn/ 3 Lê Trần Bình, Hồ Hữu Nhị, Lê Thị Muội (1997), Công nghệ sinh học thực vật trong cải tiến giống cây trồng, NXB Nông nghiệp Hà Nội, tr 62-78 4 Nguyễn Đức Doanh (1998), “Tổng quan về cây chuyển gen từ 1986- 1997” Báo cáo Hội nghị toàn quốc lần thứ nhất về công nghệ sinh học cây lúa, Huế, tháng 5/1998