Nghiên cứu chuyển gen tạo protein tái tổ hợp hiv 1 p24 vào lục lạp cây cà chua (lycopersicon esculentum mill )

Luận án tiến sĩ: Sinh học MỤC LỤC TRANG PHỤ BÌA LỜI CAM ĐOAN MỤC LỤC ……………………………………………………………………………….1 DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH DANH MỤC CÁC KÝ TỰ VIẾT TẮT MỞ ĐẦU CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 11 1.1 Đối tượng nghiên cứu: Cà Chua 12 1.2 Virus HIV type 14 1.3 Lạp thể - bào quan sống tế bào thực vật 16 1.4 Sản xuất protein dược liệu từ thực vật 26 1.5 Công nghệ chuyển gen lục lạp 29 1.5.1 Những thành tựu công nghệ chuyển gen lục lạp 29 1.5.2 Những ưu điểm khó khăn cơng nghệ chuyển gen lục lạp 30 1.5.3 Thiết kế vector chuyển gen lục lạp 32 1.6 Các phương pháp chuyển gen vào lục lạp 37 1.7 Các phương pháp loại bỏ gen chọn lọc 37 1.8 Những cơng trình chuyển gen HIV vào thực vật 40 1.9 Chuyển gen vào lục lạp cà chua 42 1.9.1 Lục lạp cà chua 42 1.9.2 So sánh với gen lục lạp thuốc 44 1.9.3 Những cơng trình chuyển gen vào lục lạp cà chua thành công 46 1.9.4 Vector chuyển gen vào lục lạp pITB-HIV-1-p24 50 CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU & PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 52 2.1 Khảo sát môi trường tái sinh 54 2.2 Khảo sát tính kháng spectinomycin mơ thật, tử diệp 55 2.3 Tách chiết DNA plasmid 56 2.4 Chuyển gen HIV-1-p24 vào lục lạp cà chua phương pháp bắn gen 57 2.5 Tách chiết DNA tổng số từ thực vật 61 2.6 Phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction) 61 2.7 Southern blot 66 U U U Luận án tiến sĩ: Sinh học 2.8 Trồng cà chua vườn ươm 73 2.9 Tách chiết protein tổng số 74 2.10 Định lượng protein tổng phương pháp Bradford 74 2.11 SDS-PAGE (Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide gel Electrophoresis) 75 2.12 Western blot 78 2.13 ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay) 81 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 86 3.1 Xác định tỉ lệ tái sinh 87 3.1.1 Xác định tỉ lệ tái sinh tử diệp 87 3.1.2 Xác định tỉ lệ tái sinh thật 90 3.2 Kết khảo sát ảnh hưởng nồng độ kháng sinh 94 3.2.1 Ảnh hưởng spectinomycin lên khả tái sinh thật 94 3.2.2 Ảnh hưởng spectinomycin lên khả tái sinh tử diệp 95 3.3 Kết bắn gen 96 3.3.1 Thí nghiệm bắn gen nồng độ spectinomycin ban đầu 50mg/l 96 3.3.2 Thí nghiệm bắn gen chọn lọc môi trường tái sinh trực tiếp 100 3.4 Kiểu hình cà chua chuyển gen lục lạp 103 3.5 Kết phân tích PCR dịng cà chua kháng spectinomycin 108 3.5.1 Kết phân tích PCR gen aadA 108 3.5.2 Kết phân tích PCR gen HIV-1-p24 109 3.6 Xác định gen HIV-1-p24 vào gen lạp thể cà chua 111 3.6.1 Kết phân tích PCR dịng cà chua chuyển nạp gen 111 3.6.2 Kết phân tích Southern blot dịng cà chua chuyển nạp gen 113 3.7 Phân tích Western blot 117 3.7.1 Hàm lượng protein tổng số mẫu khảo sát 117 3.7.2 Phân tích Western blot dịng cà chua chuyển nạp gen lục lạp 119 3.7.3 So sánh Western blot thuốc cà chua chuyển nạp gen lục lạp 122 3.8 ELISA 125 CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 132 TÀI LIỆU THAM KHẢO 136 PHỤ LỤC 155 PHỤ LỤC 164 Luận án tiến sĩ: Sinh học DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1: Những protein dược liệu tái tổ hợp tạo từ thực vật 27 Bảng 1.2: Những cơng trình chuyển gen vào lục lạp dùng aadA làm gen chọn lọc 35 Bảng 1.3: Những kết chuyển gen tạo protein HIV-1 vào thực vật 41 Bảng 1.4: So sánh gen lục lạp thuốc với gen lục lạp cà chua 44 Bảng 1.5: So sánh độ tương đồng gen lục lạp cà chua, thuốc 45 Bảng 2.1: Thành phần cho phản ứng PCR 50µl 70 Bảng 2.2: Thành phần resolving gel stacking gel 77 Bảng 3.1: Kết tỉ lệ tái sinh tử diệp môi trường khảo sát sau tuần 87 Bảng 3.2: Kết tỉ lệ tái sinh thật môi trường khảo sát sau tuần 92 Bảng 3.3: Thí nghiệm bắn gen nồng độ spectinomycin chọn lọc ban đầu 50mg/l 97 Bảng 3.4: Kết OD nồng độ BSA dùng làm đường chuẩn 117 Bảng 3.5: Hàm lượng protein tổng mẫu khảo sát 119 Bảng 3.6: Kết OD nồng độ protein p24 (AG 6054) dùng làm đường chuẩn 125 Bảng 3.7: Nồng độ protein tổng protein HIV-1-p24 mẫu khảo sát 126 Bảng 3.8: Phần trăm nồng độ protein HIV-1-p24 protein tổng 129 Luận án tiến sĩ: Sinh học DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1: Cấu trúc Virus HIV 15 Hình 1.2: Sự diện protein HIV-1-p24 huyết theo thời gian 16 Hình 1.3: Sự biệt hóa lục lạp từ tiền lạp thể 18 Hình 1.4: Cấu tạo lục lạp 20 Hình 1.5: Sơ đồ DNA lạp thể 23 Hình 1.6: Sơ đồ mRNA lạp thể 26 Hình 1.7: Sơ đồ cấu tạo vector chuyển gen lục lạp 36 Hình 1.8: Sơ đồ cấu trúc gen lục lạp cà chua 42 Hình 1.9: Vector mang gen aadA Ruf S et al 2001 47 Hình 1.10: Vector chuyển gen nhóm Wurbs et al năm 2007 47 Hình 1.11: Vector chuyển gen nhóm Apel Bock năm 2009 49 Hình 1.12: Vector chuyển gen nhóm Zhou F et al năm 2008 49 Hình 1.13: Cấu trúc vector pITB-HIV-1-p24 tác giả Nguyễn Thị Thanh 50 Hình 2.1: Sơ đồ thí nghiệm 57 Hình 2.2: Bộ Hepta adaptor (Bio-Rad, Mỹ) 57 Hình 2.3: Hệ thống súng bắn gen PDS-1000/He (Bio-Rad, Mỹ) 58 Hình 2.4: Mẫu chuẩn bị bắn gen 59 Hình 2.5: Phản ứng PCR tạo Probe DIG 66 Hình 2.6: Sơ đồ miêu tả phương pháp Southern blot 69 Hình 2.7: Sơ đồ sản phẩm DNA sau xử lý enzyme BglII 71 Hình 2.8: Nguyên lý Western blot 78 Hình 2.9: Chuyển protein qua màng Semi-dry blotter 80 Hình 2.10: Nguyên lý ELISA Sandwich 82 Hình 3.1: Kết tỉ lệ tái sinh tử diệp môi trường khảo sát sau tuần 88 Hình 3.2: Kết tỉ lệ tái sinh thật môi trường khảo sát sau tuần 93 Hình 3.3: Khảo sát khả tái sinh thật mơi trường có spectinomycin 94 Hình 3.4: Khảo sát khả tái sinh tử diệp mơi trường có spectinomycin 95 Hình 3.5: a,b,c: Mơ sẹo sống mơi trường có Spectinomycin 99 Hình 3.6: a,b,c: Mơ sẹo chuyển màu xanh chuyển sáng 99 Hình 3.7: a,b,c,d,e: Chồi chuyển gen hình thành mơi trường tái sinh 100 Hình 3.8: Quy trình chuyển gen vào lục lạp cà chua phương pháp bắn gen 102 Luận án tiến sĩ: Sinh học Hình 3.9: So sánh dịng kháng spectinomycin với đối chứng khơng chuyển gen 103 Hình 3.10: Các dòng cà chua chuyển gen in vitro 104 Hình 3.11: Cây cà chua trồng Versatile Environmental Test Chamber tuần 105 Hình 3.12: Các dịng cà chua chuyển gen trồng vườn ươm 30 ngày 106 Hình 3.13: Cây cà chua 386 cà chua chuyển gen trái vườn ươm 106 Hình 3.14: Hạt cà chua chuyển gen nẩy mầm mơi trường có spectinomycin 107 Hình 3.15: Kết điện di sản phẩm PCR gen aadA 109 Hình 3.16: Kết phân tích PCR gen HIV-1 p24 110 Hình 3.17: Kết phân tích PCR cặp mồi gen lục lạp cà chua 112 Hình 3.18: PCR probe lai DNA gen lục lạp psaB 113 Hình 3.19: Điện di gel agarose mẫu phân tích Southern blot 114 Hình 3.20: Kết Southern blot dịng cà chua chuyển gen 116 Hình 3.21: Tái tổ hợp gen lục lạp 117 Hình 3.22: Đồ thị đường chuẩn BSA 118 Hình 3.23: SDS-PAGE dòng cà chua chuyển gen HIV-1-p24 vào lục lạp 120 Hình 3.24: Western blot dịng cà chua chuyển gen HIV-1-p24 vào lục lạp 121 Hình 3.25: SDS-PAGE dòng cà chua thuốc chuyển gen HIV-1-p24 123 Hình 3.26: Western blot cà chua thuốc chuyển gen HIV-1 p24 124 Hình 3.27: Đường chuẩn protein HIV-1 p24 (AG 6054 Aalto Bio Reagents) 125 Hình 3.28: Đồ thị biểu diễn hàm lượng protein HIV-1-p24 mẫu khảo sát… 127 Hình 3.29: Đồ thị biểu diễn phần trăm protein HIV-1-p24 protein tổng số 130 Luận án tiến sĩ: Sinh học DANH MỤC CÁC KÝ TỰ VIẾT TẮT aadA aminoglycoside 3'-adenylytransferase gene AIDS Acquired Immune Deficiency Syndrome APS Ammonium persulfate BA Benzyl Adenine bp Base pairs BSA Bovine Serum Albumin DIG Digoxigenin DIG-AP Digoxigenin-Alkaline Phosphatase DMSO Dimethyl sulfoxide DNA Deoxyribonucleic acid dNTPs deoxyribonucleotide triphosphates EDTA Ethylenediaminetetraacetic acid ELISA Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay HEPES 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid HIV Human Immunodeficiency Virus HRP Horseradish peroxidase IAA Indole-3-acetic acid IR Inverted Repeat kDa Kilo Dalton Luận án tiến sĩ: Sinh học LB Luria Broth LSC Large Single Copy MS Murashige and Skoog NAA 1-Naphthaleneacetic acid NT Nghiệm thức PBS Phosphate Buffer Saline PBST Phosphate Buffer Saline Tween 20 PCR Polymerase Chain Reaction PMSF Phenylmethanesulfonyl fluoride pNPP p-Nitrophenyl Phosphate Prrn ribosomal RNA operon promoter PVDF Polyvinylidene difluoride RNA Ribonucleic acid SDS Sodium Dodecyl Sulphate SDS-PAGE Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis SSC Saline Sodium Citrate SSC Small Single Copy TBS Tris Buffered Saline TBST Tris Buffered Saline Tween 20 UTR Untranslated region Luận án tiến sĩ: Sinh học MỞ ĐẦU Luận án “Nghiên cứu chuyển gen tạo protein tái tổ hợp HIV-1-p24 vào lục lạp cà chua (Lycopersicon esculentum Mill.)” thực Phịng Cơng nghệ Gen, Phịng thí nghiệm trọng điểm phía Nam cơng nghệ tế bào thực vật - Viện Sinh học Nhiệt đới, với tài trợ kinh phí từ Văn phịng Chương trình Khoa học Cơng nghệ trọng điểm cấp Nhà nước, ban chủ nhiệm Chương trình KC.04/06-10 Tính cấp thiết luận án Hội nghị quốc tế AIDS lần thứ 19 nhóm họp Washington D.C từ ngày 22-27 tháng năm 2012 đưa tuyên bố chung “Together we will end AIDS” [71] cho thấy mối quan tâm toàn nhân loại đại dịch HIV/AIDS Tại Việt Nam, tính đến ngày 31 tháng 12 năm 2011, tất 63 tỉnh, 98% số huyện 77% số xã phát có người nhiễm HIV Tổng số ca tích lũy từ ghi nhận ca nhiễm HIV thời điểm 249.660 ca, với 197.335 người nhiễm HIV sống 52.325 ca tử vong liên quan đến AIDS [4] Cùng đóng góp việc tìm phương pháp phịng chống bệnh HIV/AIDS, cơng nghệ chuyển gen thực vật có nhiều cơng trình chuyển gen tạo nhiều dòng mang gen tạo protein tái tổ hợp HIV (bảng 1.3) Nổi bật, tìm vaccine phòng chống HIV hướng nghiên cứu tiến hành protein HIV-1p24 thành phần khơng thể thiếu vaccine phịng chống HIV Do vậy, hướng nghiên cứu tạo protein tái tổ hợp HIV-1-p24 quan tâm phát triển Bên cạnh đó, nhu cầu lượng protein HIV-1-p24 tinh để ứng dụng kit chẩn đoán tạo miễn dịch thu nhận kháng thể đơn dịng ln ln có Luận án hướng đến việc tạo protein tái tổ hợp HIV-1-p24 từ thực vật đường chuyển gen Luận án tiến sĩ: Sinh học Tuy nhiên, rủi ro đáng lo ngại việc phát triển thực vật chuyển gen phát tán gen môi trường qua hạt phấn chuyển gen Phương pháp chuyển gen vào lục lạp giải tình trạng phát tán gen chế di truyền theo mẹ Hay nói cách khác, hạt phấn chuyển gen lục lạp khơng mang gen chuyển nạp Vì vậy, nghiên cứu tạo protein HIV-1 p24 tái tổ hợp từ thực vật phương pháp chuyển gen vào lục lạp đáp ứng tính cấp thiết luận án Mục đích luận án Chuyển gen HIV-1-p24 vào lục lạp cà chua Nội dung luận án Xác định tỉ lệ tái sinh cho thật tử diệp cà chua mơi trường có nồng độ chất điều hòa sinh trưởng thực vật khác Khảo sát ngưỡng ức chế khả tái sinh gây chết spectinomycin thật, tử diệp cà chua Đề xuất qui trình chuyển gen vào lục lạp cà chua phương pháp bắn gen Minh chứng mặt di truyền dòng cà chua chuyển gen lục lạp kỹ thuật sinh học phân tử (PCR, Southern blot) phân tích biểu gen HIV1- p24 cà chua chuyển gen lục lạp phương pháp Western blot ELISA Ý nghĩa khoa học thực tiễn luận án Ứng dụng thành công kỹ thuật chuyển gen vào lục lạp để tạo cà chua chuyển gen lục lạp đồng lạp thể mang gen HIV-1-p24 Việc xây dựng quy trình chuyển gen vào lục lạp hoàn chỉnh, từ khâu bắn gen đến chọn lọc mẫu sau bắn gen tái sinh thành hoàn chỉnh, mở hướng ứng dụng kỹ thuật chuyển gen vào lục lạp Luận án tiến sĩ: Sinh học đối tượng khác với gen hữu dụng khác Đối với công tác nghiên cứu khoa học, luận án đóng vai trị góp xây dựng, hồn thiện quy trình chuyển gen vào lục lạp điều kiện Việt Nam Với thân, sau thực luận án, nắm vững kỹ thuật chuyển gen phương pháp bắn gen, đúc kết nhiều kinh nghiệm để thực tốt kỹ thuật phân tích sinh học phân tử, sinh hóa PCR, Southern blot, Western blot, ELISA Tính luận án Đây cơng trình nghiên cứu chuyển gen HIV-1-p24 vào lục lạp cà chua Việt Nam Bên cạnh việc dùng thật nghiên cứu chuyển gen vào lục lạp cà chua tác giả nước ngồi, luận án nhận dịng cà chua chuyển gen dùng tử diệp làm mẫu chuyển gen Cấu trúc luận án Luận án chia thành phần: mở đầu trang; chương 1: Tổng quan tài liệu 40 trang; chương 2: Vật liệu phương pháp nghiên cứu 33 trang; chương 3: Kết thảo luận 45 trang; chương 4: Kết luận kiến nghị trang; tài liệu tham khảo 20 trang; phụ lục 10 trang Luận án có 15 bảng số liệu; 52 hình bao gồm sơ đồ, đồ thị, hình ảnh; 189 tài liệu tham khảo hai thứ tiếng Việt Anh Có cơng trình nghiên cứu liên quan đến luận án đăng tạp chí hội nghị chuyên ngành nước 10 Luận án tiến sĩ: Sinh học 187 Ye G.N., Hajdukiewicz P.T., Broyles D., Rodriquez D., Xu C.V., Nehra N., StaubJ.M (2001) Plastid-expressed 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase genes provide high level glyphosate tolerance in tobacco Plant J 25 261-270 188 Yohn C.B., Cohen A., Rosch C., Kuchka M.R., and Mayfield S.P., (1998) Translation of the Chloroplast psbA mRNA Requires the Nuclear-encoded Poly(A)-binding Protein RB47 The Journal of Cell Biology 142(2), 435-442 189 Yusibov V., Modelska A., Steplewski K., Agadjanyan M., Weiner D., Hooper D.C., Koprowski H., (1997) Antigens produced in plants by infection with chimeric plant viruses immunize against rabies virus and HIV-1 Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America 94, 57845788 190 Zerges W., and Rochaix J.D., (1994) The 5' Leader of a Chloroplast mRNA Mediates the Translational Requirements for Two Nucleus-Encoded Functions in Chlamydomonas reinhardtii Molecular and Cellular Biology 14(8), 52685277 191 Zghidi W., Merendino L., Cottet A., Mache R., Lerbs-Mache S., (2006) Nucleusencoded plastid sigma factor SIG3 transcribes specifically the psbN gene in plastids Nucleic Acids Research 35(2), 455-464 192 Zhang B., Liu D., Bao Z., Chen B., Li C., Jiang H., Wang X., Mi Z., An X., Lu J., Tong Y., (2011) High level soluble expression, one-step purification and characterization of HIV-1 p24 protein Virology Journal, 8:316 193 Zhang G., Leung C., Murdin L., Rovinski B., White K.A., (2000) In Planta Expression of HIV-1 p24 Protein Using an RNA Plant Virus-Based Expression Vector Molecular Biotechnology 14, 99-107 194 Zhang G., Rodrigues L., Rovinski B., White K.A., (2002) Production of HIV-1 p24 Protein in Transgenic Tobacco Plants Molecular Biotechnology 20, 131136 195 Zhou F., Badillo-Corona J.A., Karcher D., Gonzalez-Rabade N., Piepenburg K., Borchers A.M., Maloney A.P., Kavanagh TA., Gray J.C., Bock R., (2008) High-level expression of human immunodeficiency virus antigens from the tobacco and tomato plastid genomes Plant Biotechnology Journal 6, 897-913 196 Zubko M.K., Zubko E.I., van Zuilen K., Meyer P., Day A., (2004) Stable transformation of petunia plastids Transgenic Res 13, 523-530 154 Luận án tiến sĩ: Sinh học PHỤ LỤC Data file: LA MAM Title: TAI SINH Function: ANOVA-1 Data case no to 27 One way ANOVA grouped over variable (NT) with values from to Variable (TS) ANALYSIS OF VARIANCE TABLE Degrees of Sum of Mean Freedom Squares Square F-value Prob Between 2649.333 331.167 60.416 0.0000 Within 18 98.667 5.481 Total 26 2748.000 Coefficient of Variation = 3.07% Var V A R I A B L E No Number Sum Average SD SE -1 3.00 186.000 62.000 1.73 1.35 3.00 197.000 65.667 2.31 1.35 3.00 220.000 73.333 3.51 1.35 3.00 227.000 75.667 2.31 1.35 3.00 283.000 94.333 2.31 1.35 3.00 267.000 89.000 1.73 1.35 3.00 240.000 80.000 3.00 1.35 3.00 234.000 78.000 1.73 1.35 3.00 207.000 69.000 1.73 1.35 -Total 27.00 2061.000 76.333 10.28 1.98 Within 2.34 Bartlett's test Chi-square = 2.002 155 Luận án tiến sĩ: Sinh học Number of Degrees of Freedom = Approximate significance = 0.981 Data File : Keyboard Function : RANGE Error Mean Square = 5.481 Error Degrees of Freedom = 18 No of observations to calculate a mean = Duncan's Multiple Range Test LSD value = 5.502 s_ = 1.352 at alpha = 0.010 Original Order Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean 1= 2= 3= 4= 5= 6= 7= 8= 9= 62.00 65.67 73.33 75.67 94.33 89.00 78.00 69.00 69.00 Ranked Order E DE BC B A A B CD CD Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean 5= 6= 7= 4= 3= 8= 9= 2= 1= 94.33 89.00 78.00 75.67 73.33 69.00 69.00 65.67 62.00 A A B B BC CD CD DE E Data file: LA MAM Title: TRUNG BINH CHOI Function: ANOVA-1 Data case no to 27 One way ANOVA grouped over variable (Lan) with values from to Variable (Choi) ANALYSIS OF VARIANCE TABLE Degrees of Sum of Mean Freedom Squares Square F-value Prob Between 4.603 0.575 6.068 0.0007 Within 18 1.707 0.095 Total 26 6.310 156 Luận án tiến sĩ: Sinh học Coefficient of Variation = 20.58% Var V A R I A B L E No Number Sum Average SD SE -1 3.00 3.100 1.033 0.25 0.18 3.00 3.400 1.133 0.15 0.18 3.00 3.000 1.000 0.17 0.18 3.00 5.700 1.900 0.40 0.18 3.00 6.300 2.100 0.30 0.18 3.00 6.100 2.033 0.50 0.18 3.00 5.000 1.667 0.21 0.18 3.00 4.200 1.400 0.35 0.18 3.00 3.600 1.200 0.26 0.18 -Total 27.00 40.400 1.496 0.49 0.09 Within 0.31 Bartlett's test Chi-square = 3.971 Number of Degrees of Freedom = Approximate significance = 0.860 Data File : Keyboard Function : RANGE Error Mean Square = 0.09500 Error Degrees of Freedom = 18 No of observations to calculate a mean = Duncan's Multiple Range Test LSD value = 0.7244 s_ = 0.1780 at alpha = 0.010 Original Order Mean Mean Mean Mean Mean Mean 1= 2= 3= 4= 5= 6= 1.030 1.130 1.000 1.900 2.100 2.030 Ranked Order C BC C AB A A Mean Mean Mean Mean Mean Mean 157 5= 6= 4= 7= 8= 9= 2.100 2.030 1.900 1.670 1.400 1.200 A A AB ABC ABC BC Luận án tiến sĩ: Sinh học Mean = 1.670 ABC Mean = 1.400 ABC Mean = 1.200 BC Mean = 1.130 BC Mean = 1.030 C Mean = 1.000 C Data file: LATHAT Title: TAI SINH Function: ANOVA-1 Data case no to 36 One way ANOVA grouped over variable (NT) with values from to 12 Variable (TS) ANALYSIS OF VARIANCE TABLE Degrees of Sum of Mean Freedom Squares Square F-value Prob Between 11 7983.524 725.775 21.777 0.0000 Within 24 799.867 33.328 Total 35 8783.391 Coefficient of Variation = 9.31% Var V A R I A B L E No Number Sum Average SD SE -1 3.00 160.000 53.333 6.67 3.33 3.00 173.330 57.777 3.85 3.33 3.00 200.000 66.667 6.67 3.33 3.00 166.670 55.557 7.70 3.33 3.00 246.670 82.223 3.85 3.33 3.00 280.000 93.333 6.67 3.33 3.00 233.330 77.777 3.85 3.33 3.00 193.330 64.443 7.70 3.33 3.00 133.340 44.447 3.85 3.33 10 3.00 166.660 55.553 3.85 3.33 11 3.00 153.340 51.113 7.70 3.33 12 3.00 126.670 42.223 3.85 3.33 -Total 36.00 2233.340 62.037 15.84 2.64 Within 5.77 158 Luận án tiến sĩ: Sinh học Bartlett's test Chi-square = 3.848 Number of Degrees of Freedom = 11 Approximate significance = 0.985 Data File : Keyboard Function : RANGE Error Mean Square = 33.33 Error Degrees of Freedom = 24 No of observations to calculate a mean = Duncan's Multiple Range Test LSD value = 13.18 s_ = 3.333 at alpha = 0.010 Original Order Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean 1= 2= 3= 4= 5= 6= 7= 8= 9= 10 = 11 = 12 = Ranked Order 53.33 DEFG 57.78 DEF 66.67 CD 55.56 DEFG 82.22 AB 93.33 A 77.78 BC 64.44 CDE 44.45 FG 55.55 DEFG 51.11 EFG 42.22 G Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean 6= 5= 7= 3= 8= 2= 4= 10 = 1= 11 = 9= 12 = 93.33 A 82.22 AB 77.78 BC 66.67 CD 64.44 CDE 57.78 DEF 55.56 DEFG 55.55 DEFG 53.33 DEFG 51.11 EFG 44.45 FG 42.22 G Data file: LA THAT Title: TRUNG BINH CHOI Function: ANOVA-1 Data case no to 36 One way ANOVA grouped over variable (lan) with values from to 12 Variable (choi) 159 Luận án tiến sĩ: Sinh học ANALYSIS OF VARIANCE TABLE Degrees of Sum of Mean Freedom Squares Square F-value Prob Between 11 5.376 0.489 9.563 0.0000 Within 24 1.227 0.051 Total 35 6.603 Coefficient of Variation = 17.89% Var V A R I A B L E No Number Sum Average SD SE -1 3.00 3.100 1.033 0.25 0.13 3.00 3.000 1.000 0.26 0.13 3.00 3.700 1.233 0.32 0.13 3.00 4.300 1.433 0.21 0.13 3.00 6.300 2.100 0.20 0.13 3.00 5.300 1.767 0.31 0.13 3.00 5.100 1.700 0.26 0.13 3.00 3.700 1.233 0.15 0.13 3.00 2.700 0.900 0.20 0.13 10 3.00 3.000 1.000 0.20 0.13 11 3.00 2.800 0.933 0.12 0.13 12 3.00 2.500 0.833 0.12 0.13 -Total 36.00 45.500 1.264 0.43 0.07 Within 0.23 Bartlett's test Chi-square = 3.765 Number of Degrees of Freedom = 11 Approximate significance = 0.986 Data File : Keyboard Function : RANGE Error Mean Square = 0.05100 Error Degrees of Freedom = 24 No of observations to calculate a mean = 160 Luận án tiến sĩ: Sinh học Duncan's Multiple Range Test LSD value = 0.5157 s_ = 0.1304 at alpha = 0.010 Original Order Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean 1= 2= 3= 4= 5= 6= 7= 8= 9= 10 = 11 = 12 = Ranked Order 1.030 CD 1.000 CD 1.230 BCD 1.430 BC 2.100 A 1.770 AB 1.700 AB 1.230 BCD 0.9000 CD 1.000 CD 0.9300 CD 0.8300 D Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean 5= 6= 7= 4= 8= 3= 1= 2= 10 = 11 = 9= 12 = 2.100 A 1.770 AB 1.700 AB 1.430 BC 1.230 BCD 1.230 BCD 1.030 CD 1.000 CD 1.000 CD 0.9300 CD 0.9000 CD 0.8300 D Data file: BRADFORD Title: PROTEIN TONG Function: ANOVA-1 Data case no to 33 One way ANOVA grouped over variable (lan) with values from to 11 Variable (Tong) ANALYSIS OF VARIANCE TABLE Degrees of Sum of Mean Freedom Squares Square F-value Prob Between 10 323.285 32.329 178.596 0.0000 Within 22 3.982 0.181 Total 32 327.267 Coefficient of Variation = 4.85% 161 Luận án tiến sĩ: Sinh học Var V A R I A B L E No Number Sum Average SD SE -1 3.00 32.811 10.937 0.45 0.25 3.00 32.189 10.730 0.25 0.25 3.00 33.628 11.209 0.36 0.25 3.00 30.975 10.325 0.57 0.25 3.00 21.672 7.224 0.61 0.25 3.00 22.006 7.335 0.48 0.25 3.00 21.383 7.128 0.30 0.25 3.00 32.777 10.926 0.51 0.25 3.00 29.875 9.958 0.36 0.25 10 3.00 31.870 10.623 0.44 0.25 11 3.00 0.465 0.155 0.06 0.25 -Total 33.00 289.651 8.777 3.20 0.56 Within 0.43 Bartlett's test Chi-square = 7.119 Number of Degrees of Freedom = 10 Approximate significance = 0.714 Data File : Keyboard Function : RANGE Error Mean Square = 0.1810 Error Degrees of Freedom = 22 No of observations to calculate a mean = Duncan's Multiple Range Test LSD value = 0.9792 s_ = 0.2456 at alpha = 0.010 162 Luận án tiến sĩ: Sinh học Original Order Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean 1= 2= 3= 4= 5= 6= 7= 8= 9= 10 = 11 = Ranked Order 10.94 AB 10.73 AB 11.21 A 10.33 AB 7.220 C 7.340 C 7.130 C 10.93 AB 9.960 B 10.62 AB 0.1600 D Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean 3= 1= 8= 2= 10 = 4= 9= 6= 5= 7= 11 = 11.21 A 10.94 AB 10.93 AB 10.73 AB 10.62 AB 10.33 AB 9.960 B 7.340 C 7.220 C 7.130 C 0.1600 D Data file: ELISA Title: PROTEIN P24 Function: ANOVA-1 Data case no to 27 One way ANOVA grouped over variable (lan) with values from to Variable (ham luong) ANALYSIS OF VARIANCE TABLE Degrees of Sum of Mean Freedom Squares Square F-value Prob Between 0.097 0.012 143.399 0.0000 Within 18 0.002 0.000 Total 26 0.099 Coefficient of Variation = 3.76% 163 Luận án tiến sĩ: Sinh học Var V A R I A B L E No Number Sum Average SD SE -1 3.00 0.799 0.266 0.01 0.01 3.00 0.722 0.241 0.01 0.01 3.00 0.865 0.288 0.01 0.01 3.00 0.686 0.229 0.01 0.01 3.00 0.861 0.287 0.01 0.01 3.00 0.964 0.321 0.01 0.01 3.00 0.297 0.099 0.00 0.01 3.00 0.758 0.253 0.01 0.01 3.00 0.652 0.217 0.01 0.01 -Total 27.00 6.604 0.245 0.06 0.01 Within 0.01 Bartlett's test Chi-square = 2.940 Number of Degrees of Freedom = Approximate significance = 0.938 164 Luận án tiến sĩ: Sinh học PHỤ LỤC Tách chiết plasmid DNA qui mô lớn Qiagen plasmid Mega kit Lấy khuẩn lạc cho vào 20ml mơi trường LB có bổ sung 100mg/l ampicillin ni lắc 280 vịng/phút nhiệt độ 37oC khoảng 8giờ Lấy 1ml dung dịch LB nuôi cấy bỏ vào 500ml mơi trường LB có chứa 100mg/l ampicillin ni lắc 280 vịng/phút 37oC qua đêm Thu nhận tế bào vi khuẩn cách ly tâm dung dịch LB nuôi vi khuẩn nuôi qua đêm với tốc độ 2.500 vòng/phút 15 phút nhiệt độ 40C máy Avanti® J-E centrifuge với rotor JLA-16.250 (Beckman Coulter) Hoà vi khuẩn 50ml dung dịch buffer P1 có thêm RNase A Thêm 50ml dung dịch buffer P2, trộn cách đảo ngược ống tube 46 lần (đảo nhẹ xuất màu xanh) Để nhiệt độ phòng (15250C) phút Thêm 50ml dung dịch buffer P3 lạnh vào trộn cách đảo nhẹ 4-6 lần (đảo nhẹ màu xanh lyseBlue đi) Ủ đá 30 phút Ly tâm với tốc độ 10.000 vịng/phút máy Avanti® J-E centrifuge với rotor JLA-16.250 30 phút 40C Hút cẩn thận lấy phần dịch phía Ly tâm lần với tốc độ 10000 vòng/phút 15 phút 40C Hút lấy phần dịch phía Cân QIAGEN-tip 2500 35ml dung dịch buffer QBT Đưa phần dịch thu nhận bước vào cột Bỏ phần dịch chảy qua cột Rửa QIAGEN-tip với x 100ml dung dịch buffer QC 165 Luận án tiến sĩ: Sinh học Thôi DNA khỏi cột 35ml dung dịch buffer QF Thu nhận dịch DNA chảy qua cột vào tube 10 Kết tủa DNA cách thêm vào 24ml isopropanol nhiệt độ phòng vào dịch thu Ly tâm với tốc độ 6.000 vòng/phút với rotor JA-25.50 30 phút 40C Cẩn thận loại bỏ phần dịch 11 Rửa tủa DNA 7ml ethanol 70% nhiệt độ phòng ly tâm với tốc độ 6000 vòng/phút với rotor JA-25.50 10 phút 40C Cẩn thận loại bỏ phần dịch 12 Để khơ tủa DNA từ 10-20 phút, sau hòa tan dung dịch TE pH 8.0 Bảo quản -20oC Tách chiết DNA tổng số từ thực vật Phương pháp Dellaporta cải biến Cân 100mg cà chua mô sẹo bỏ vào ống Eppendorf 2ml Nghiền mẩu nitrogen lỏng Thêm 1ml dung dịch tách chiết (100mM Tris pH 8, 50mM EDTA pH 8, 500mM NaCl 10mM β-mercaptoethanol) Thêm vào 100μl 20% SDS trộn ủ 65oC 10 phút Thêm vào 500μl 5M Potassium acetate, lắc ủ 0oC 20 phút Ly tâm với tốc độ 14.000 vòng/phút máy Hermle Z 300 20 phút Chuyển phần dịch sang eppendorf cho thêm 1ml isopropanol Trộn ủ -20oC 30 phút Ly tâm với tốc độ 13.000 vòng/phút 15 phút Đổ bỏ phần dịch úp eppendorf xuống giấy thấm 166 Luận án tiến sĩ: Sinh học Hòa tan tủa 0,2ml dung dịch chứa 50mM Tris, 10mM EDTA, pH Ly tâm 10 phút với tốc độ 13000 vòng/phút để loại bỏ phần không tan Cho vào 0,2ml Chloroform/isoamyl alcohol 24:1 Trộn đều, ly tâm 10 phút với tốc độ 13.000 vòng/phút 10 Nhẹ nhàng hút lấy phần sang tube Thêm vào 1/10 thể tích 3M sodium acetate 100µl isopropanol Trộn đều, ly tâm thu nhận tủa DNA 11 Rửa tủa DNA 0,2ml ethanol 80% lạnh Để tủa DNA khơ hịa tan 100µl dung dịch 10mM Tris, 1mM EDTA, pH 12 Ủ với 2µl RNAase 37oC 30 phút 13 Đo nồng độ DNA máy quang phổ bước sóng λ260/λ280 Bảo quản DNA -20oC Phương pháp dùng DNeasy plant mini Kit Cân 100mg cà chua mô sẹo bỏ vào ống Eppendorf 2.0ml Nghiền mẫu nitrogen lỏng Thêm 400µl dung dịch buffer AP1 µl Rnase A Vortex, trộn ủ 10 phút 65oC Trộn 2-3 lần thời gian ủ Thêm 130µl buffer AP2 trộn ủ phút nước đá Ly tâm với tốc độ 14.000 vòng/phút máy Hermle Z 300 phút Chuyển phần dịch vào cột (QIAshredder spin column), đặt cột vào ống ly tâm 2ml Ly tâm với tốc độ 14.000 vòng/phút phút Chuyển dung dịch thu vào ống thêm 1.5 thể tích buffer AP3 có ethanol vào trộn (Ví dụ: 450µl dịch chiết thêm 675µl AP3) 167 Luận án tiến sĩ: Sinh học Chuyển 650µl dung dịch bước vào ống DNeasy mini spin column đặt tube ly tâm Ly tâm với tốc độ 5000 vòng/phút phút Loại bỏ dung dịch Lập lại bước với phần dịch dư bước Đặt DNeasy mini spin column vào ống ly tâm Thêm 500µl buffer AW vào cột, ly tâm với tốc độ 5000 vòng/phút phút Loại bỏ dịch Thêm 500µl buffer AW vào cột, ly tâm 14.000 vòng/phút phút 10 Đặt cột lại vào ống ly tâm Cho 100µl buffer AE vào cột, ủ phút nhiệt độ phòng Ly tâm tốc độ 5.000 vòng/phút phút để thu nhận DNA 11 Đo nồng độ DNA máy quang phổ bước sóng λ260/λ280 bảo quản DNA - 20oC 168 ... cà chua chuyển gen HIV- 1- p24 vào lục lạp 12 0 Hình 3.24: Western blot dịng cà chua chuyển gen HIV- 1- p24 vào lục lạp 12 1 Hình 3.25: SDS-PAGE dòng cà chua thuốc chuyển gen HIV- 1- p24 12 3 Hình... 10 9 3.6 Xác định gen HIV- 1- p24 vào gen lạp thể cà chua 11 1 3.6 .1 Kết phân tích PCR dịng cà chua chuyển nạp gen 11 1 3.6.2 Kết phân tích Southern blot dịng cà chua chuyển nạp gen 11 3... virus, PVX- potato virus X 41 Luận án tiến sĩ: Sinh học 1. 9 Chuyển gen vào lục lạp cà chua 1. 9 .1 Lục lạp cà chua Kích thước DNA lục lạp cà chua 15 5,461bp Bộ gen lục lạp cà chua gồm bốn phần đặc trưng