Nghiên cứu chuyển gen kháng sâu Cryiab vào cây cà chua (Lycopersicon esculentum Mill.) bằng phương pháp sử dụng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens

Mục đích của nghiên cứu này là chuyển gen kháng sâu cryIAb vào cây cà chua (Lycopersicon esculentum Mill.) bằng phương pháp sử dụng vi khuẩn Agrobacterium. Kháng sinh Kanamycin được dùng như một chất chọn lọc. Chủng Agrobacterium tumefaciens EHA105 mang plasmid CAMBIA2301cryIAb chứa gen kháng kanamycin (nptII), gen GusA và gen kháng sâu cryIAb. Chúng tôi nghiên cứu một vài yếu tố ảnh hưởng đến khả năng chuyển gen cà chua như nồng độ của vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens và nồng độ acetosyringone trong quá trình xâm nhiễm. Để phục vụ cho việc chuyển gen, lá mầm 10 ngày tuổi được dùng làm nguyên liệu. Sau 2 ngày xử lí chuyển gen lá mầm được rửa và cấy trên môi trường tái sinh MS có chứa chất sinh trưởng IAA (0,5 mg/l), BA (2 mg/l), chất chọn lọc kanamycin (100 mg/l) và 500 mg/l kháng sinh cefotaxime để diệt vi khuẩn. Sau vài tuần chọn lọc trong môi trường trên, các chồi kháng chất chọn lọc kanamycin sẽ được chuyển sang môi trường MS để phát triển và tạo rễ. Sự biểu hiện của gen GusA được kiểm tra bởi chất chỉ thị X-Glu. Sự hiện diện của gen nptII và gen cryIAb trong cây cà chua giả định chuyển gen đã được khẳng định bằng kỹ thuật PCR. Sự biểu hiện của độc tố tạo bởi gen kháng sâu cryIAb trong lá cây cà chua giả định chuyển gen đã được kiểm tra bởi Kit Quickstix strip của công ty Envirologix (Mỹ).

TẠP CHÍ SINH HỌC, 2012, 34(3SE): 205-211 NGHIÊN CỨU CHUYỂN GEN KHÁNG SÂU cryIAb VÀO CÂY CÀ CHUA (Lycopersicon esculentum Mill.) BẰNG PHƯƠNG PHÁP SỬ DỤNG VI KHUẨN Agrobacterium tumefaciens Lê Tấn Đức1*, Phạm Đức Trí1, Nguyễn Hữu Hổ1, Hà Trần Minh Dũng1, Dương Thị Ngọc Thi2 (1) Viện Sinh học nhiệt đới, Viện Khoa học Công nghệ Việt Nam, (*)tanduc2007@gmail.com (2) Trung tâm Nghiên cứu Phát triển Nơng nghiệp cơng nghệ cao Hồ Chí Minh TĨM TẮT: Mục đích nghiên cứu chuyển gen kháng sâu cryIAb vào cà chua (Lycopersicon esculentum Mill.) phương pháp sử dụng vi khuẩn Agrobacterium Kháng sinh Kanamycin dùng chất chọn lọc Chủng Agrobacterium tumefaciens EHA105 mang plasmid CAMBIA2301cryIAb chứa gen kháng kanamycin (nptII), gen GusA gen kháng sâu cryIAb Chúng nghiên cứu vài yếu tố ảnh hưởng đến khả chuyển gen cà chua nồng độ vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens nồng độ acetosyringone trình xâm nhiễm Để phục vụ cho việc chuyển gen, mầm 10 ngày tuổi dùng làm nguyên liệu Sau ngày xử lí chuyển gen mầm rửa cấy mơi trường tái sinh MS có chứa chất sinh trưởng IAA (0,5 mg/l), BA (2 mg/l), chất chọn lọc kanamycin (100 mg/l) 500 mg/l kháng sinh cefotaxime để diệt vi khuẩn Sau vài tuần chọn lọc môi trường trên, chồi kháng chất chọn lọc kanamycin chuyển sang môi trường MS để phát triển tạo rễ Sự biểu gen GusA kiểm tra chất thị X-Glu Sự diện gen nptII gen cryIAb cà chua giả định chuyển gen khẳng định kỹ thuật PCR Sự biểu độc tố tạo gen kháng sâu cryIAb cà chua giả định chuyển gen kiểm tra Kit Quickstix strip cơng ty Envirologix (Mỹ) Từ khóa: Agrobacterium tumefaciens, Lycopersicon esculentum, chuyển gen, plasmid, mầm, gen cryIA, PCR MỞ ĐẦU Cà chua loại rau ăn trồng phổ biến nhiều nước Đây loại rau ưa thích phẩm chất ngon dễ chế biến Tính đa dụng nhu cầu tiêu thụ cà chua tươi ngày lớn thúc đẩy phát triển cà chua loại trồng Ngồi ra, trồng cà chua mang lại hiệu kinh tế cao Ở Việt Nam, việc phát triển trồng cà chua cịn có ý nghĩa quan trọng mặt luân canh, tăng vụ tăng suất đơn vị diện tích, cà chua loại rau khuyến khích phát triển Tuy nhiên, cà chua thường bị hại sâu ăn lá, đục (Heliothis armigera Spodoptera litura) Một số loại thuốc hóa học bảo vệ thực vật áp dụng vào giai đoạn khác cà chua để bảo vệ trồng chống lại dịch hại Tuy nhiên, dư lượng chất hóa học loại thuốc tác hại đến người tiêu dùng Có nhiều báo cáo nghiên cứu chuyển gen cà chua tác giả Cortina et al (2004) [2], Park et al (2003) [11], Sarker et al (2009) [12] Trong nghiên cứu này, mầm thật dùng làm nguyên liệu cho việc chuyển gen cà chua thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens Theo hướng nghiên cứu này, tiến hành chuyển gen kháng sâu cryIAb vào cà chua (Lycopersicon esculentum Mill.) với hy vọng biểu gen chuyển cryIA có tác dụng góp phần làm giảm tác hại sâu hại cà chua PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Vật liệu Sử dụng giống cà chua vô hạn TN386, TN148 Công ty Trang Nông giống Hồng Châu Công ty Sygenta Phương pháp Môi trường nuôi cấy mô điều kiện nuôi cấy Môi trường gieo hạt 1/2MS [10] khơng chất điều hịa sinh trưởng Mơi trường tiền tái sinh MS với vitamin B5 [7] có chất điều hịa sinh trưởng 0,1 mg/l NAA, mg/l BA Môi trường tái sinh chồi từ mầm MS với 205 Le Tan Duc, Pham Duc Tri, Nguyen Huu Ho, Ha Tran Minh Dung, Duong Thi Ngoc Thi vitamin B5 có bổ sung chất điều hịa sinh trưởng mg/l IAA, mg/l BA Mơi trường chọn lọc mơi trường tái sinh có 100 mg/L kanamycin 500 mg/l cefotaxime Môi trường rễ MS Điều kiện nuôi cấy chiếu sáng/ngày, nhiệt độ 25-28oC Dịng vi khuẩn, mơi trường điều kiện ni cấy Sử dụng dịng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens EHA 105 mang plasmid pCAMBIA2301 chứa gen cryIAb, gen gusA (có intron, promoter CaMV35S) gen nptII (kháng kanamycin) với promoter CaMV35S Môi trường giữ giống vi khuẩn mơi trường LB có 50 mg/l kanamycin Để nhân giống cho nghiên cứu chuyển gen, vi khuẩn nuôi lắc qua đêm mơi trường AB [3] có nồng độ kanamycin 50 mg/l rifamycin Nhiệt độ nuôi cấy 28oC Nghiên cứu ảnh hưởng dịch nuôi vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens với nồng độ khác đến khả chuyển gen Sử dụng dịch vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens với nồng độ OD bước sóng 600 nm 0,5; 1,5 trình chuyển gen với giống cà chua TN386 Sau ngày xử lí chuyển gen, mẫu mầm nhuộm với dung dịch X-Gluc để kiểm tra khả chuyển gen thông qua biểu gen gusA Nghiên cứu ảnh hưởng nồng độ acetosyringone dịch nuôi vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens đến khả chuyển gen Để nâng cao tần số chuyển gen acetosyringone sử dụng với nồng độ 50, 100 150 µM trình chuyển gen với giống cà chua TN386 Sau ngày xử lí chuyển gen mẫu mầm nhuộm với dung dịch X-Gluc để kiểm tra khả chuyển gen Quy trình chuyển gen Các mẫu mầm 10 ngày tuổi từ in vitro sử dụng làm vật liệu chuyển gen Các bước chuyển gen: Ni cấy mầm mơi trường MS có 0,1 mg/l NAA mg/l 206 BA thời gian ngày; Gây nhiễm mẫu mầm với vi khuẩn thời gian 20 phút; vớt mẫu ra, thấm bớt dịch vi khuẩn thừa giấy lọc; Nuôi chung mẫu mầm với vi khuẩn ngày; sử dụng mơi trường có 100 µM acetosyringone; Rửa thật vi khuẩn nước cất dung dịch kháng sinh 500 mg/l cefotaxime (kết hợp lắc nhẹ); Vớt mẫu ra, thấm nước cấy mẫu mầm môi trường tái sinh có chọn lọc Thời gian ni 15 ngày/chu kỳ chọn lọc; Khi xuất chồi tái sinh (cao khoảng 1-2 cm) cấy truyền sang môi trường MS không chất sinh trưởng đến vươn chồi tạo cây, thời gian nuôi khoảng tháng Kiểm tra chuyển gen Thử GUS [6]: Dùng để kiểm tra biểu gen thị gusA mã hóa enzyme βglucoronidase mô tế bào thực vật chuyển gen Lá mầm sau chuyển gen ngày chồi tái sinh ngâm dung dịch X-Gluc (5-bromo-4-cloro-3-indolyl-β-D-glucuronide) nhiệt độ 37oC 20 loại bỏ dung dịch thay cồn 70% điểm xanh xuất rõ ràng Phân tích phương pháp sinh học phân tử PCR: Cây sau tái sinh chọn lọc tách chiết DNA nhiễm sắc thể từ theo phương pháp Dellaporta et al (1983) [4] Sự diện gen nptII gen cryIAb kiểm tra dùng cặp mồi đặc hiệu Gen nptII: Mồi (F): 5’-GCACA ACAGA CAATC 3’, Mồi (R): 5’-CCGCC AAGCT CTTCA - 3’; chương trình nhiệt: 94C: phút; 35 chu kỳ (94C: phút, 58C: phút, 72C: phút); 72C: phút; khuếch đại đoạn DNA 600 bp Gen cryIA(b) : Mồi (F): 5’ - TTC CT T GGA CGA AAT CCC ACC - 3’, Mồi (R): 5’ - GCC AGA ATT GAA CAC ATG AGC GC - 3’; chương trình nhiệt: 94C: phút; 35 chu kỳ (94C: 30 giây, 54C: 60 giây, 72C: phút 30 giây); 72C: 10 phút; khuếch đại đoạn DNA 559 bp Kiểm tra biểu gen cryIAb: Kit Công ty Envirologix Quickstix (Hoa Kỳ) sử dụng để phát protein độc tố tạo gen cry1Ab cà chua chuyển gen Lá tươi cà chua nghiền TẠP CHÍ SINH HỌC, 2012, 34(3SE): 205-211 tube 1,5 ml đến bị vỡ nát cho thêm dung dịch tách chiết protein cung cấp công ty Tiếp tục nghiền Que thử nhúng vào tube khoảng phút cho kết có mặt độc tố tạo gen cryIAb xuất hai vạch (dương tính) que thử có mơt vạch âm tính Các thí nghiệm bố trí theo khối hoàn toàn ngẫu nhiên với lần lặp lại Phần mềm MSTAT-C dùng để phân tích kết thí nghiệm KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Giống cà chua TN 386 dùng thí nghiệm yếu tố ảnh hưởng đến khả chuyển gen Theo tác giả Abida Yasmeen et al (2009) [1] trước chuyển gen đặt mầm vào mơi trường MS có 0,1 mg/l NAA mg/l BA thời gian ngày giúp tăng khả tái sinh tần số chuyển gen nên trước cho xử lí chuyển gen đặt mầm 10 ngày tuổi dùng làm nguyên liệu nuôi cấy môi trường Lá mầm cắt phần đầu phần cuống để tạo vết thương giúp vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens dễ dàng xâm nhiễm Khoảng 80% mầm có phát triển cách phình to sau ngày, mầm sử dụng làm nguyên liệu chuyển gen Nghiên cứu ảnh hưởng OD600nm dịch nuôi vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens đến khả chuyển gen Sau mầm giống cà chua TN 386 tạo vết thương xâm nhiễm vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens mang plasmidCAMBIA2301cryIAb plasmid có mang gen gusA (gen thị) nên sử dụng biểu gen để đánh giá kết chuyển gen thí nghiệm Kết sau chuyển gen ngày nhuộm mần để xem biểu gen GusA cho thấy mức độ chuyển gen thông qua biểu gen gusA gia tăng hay giảm tùy thuộc nồng độ dịch nuôi vi khuẩn phù hợp với miêu tả trước tác giả Fillatti et al (1987) [5] Biểu tạm thời cao gen gusA (hình 1) OD600nm 1,0 với tần suất 40,55%, OD600nm 0,5 biểu gen gusA giảm OD600nm tăng 1,5 biểu gen gusA không tăng theo số OD (bảng 1) Hình Biểu gen gusA mầm Bảng Ảnh hưởng dịch nuôi vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens đến khả biểu tạm thời gen gusA Số lượng mầm xử lí Số lượng mầm biểu % mầm biểu OD600nm chuyển gen gen gusA gen gusA b* 0,5 30 19,17  6,29 a 1,0 30 12 40,56  10,05 1,5 30 26,67  2,89 ab 207 Le Tan Duc, Pham Duc Tri, Nguyen Huu Ho, Ha Tran Minh Dung, Duong Thi Ngoc Thi * Các số trung bình cột với mẫu tự khác khác biệt có nghĩa với p = 0,05 Nghiên cứu ảnh hưởng nồng độ acetosyringone dịch nuôi vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens đến khả chuyển gen Sự có mặt acetosyringone làm tăng khả chuyển gen nhiều loại trồng có cà chua Vì vậy, acetosyringone cho vào giai đoạn xử lý ngâm dung dịch vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens với mầm giống cà chua TN386 nồng độ 50, 100 150 µM Kết cho thấy nồng độ acetosyringone 100 µM cho tần số chuyển gen cao tăng lên 150 µM làm giảm tần số chuyển gen (bảng 2) Bảng Ảnh hưởng nồng độ acetosyringone đến khả biểu tạm thời gen gusA 50 Số lượng mầm xử lí chuyển gen 25 Số lượng mầm biểu gen gusA % mầm biểu gen gusA b* 24,07  1,61 100 25 36,11  2,41 150 25 15,74  5,61 Nồng độ Acetosyringone a b * Các số trung bình cột với mẫu tự khác khác biệt có nghĩa với p = 0,01 Hình Biểu gen gusA chồi cà chua Nghiên cứu chuyển gen Lá mầm giống cà chua TN 386, 148 Hồng Châu sau xử lí chuyển gen đặt vào mơi trường tái sinh chồi có bổ sung chất chọn lọc 100 mg/l kanamycin, kết sau hai tuần số mầm có mơ sẹo phát triển tái sinh chồi sau 4-6 tuần mầm đối chứng (khơng xử lí chuyển gen) hồn tồn khơng phát triển mơ sẹo chồi sau tuần môi trường chọn lọc Các chồi tái sinh môi trường chọn lọc chọn ngẫu nhiên để kiểm tra biểu gen gusA đồng thời quan sát chồi không chuyển gen Kết 208 Hình Tái sinh chồi cà chua mơi trường chọn lọc cho thấy, khoảng 60% mẫu chồi giả định chuyển gen kiểm tra gen gusA có đốm xanh chàm mức độ đậm nhạt khác cho thấy, việc biểu gen gusA (hình 2) không đồng chồi chuyển gen, đó, mẫu khơng chuyển gen khơng có vệt xanh Đồng thời, tần số chuyển gen dựa khả tái sinh môi trường chọn lọc 100 mg/l kanamycin cho thấy phụ thuộc vào giống, giống TN 386 TN148 khả tái sinh chồi tạo dịng kháng kanamycin (hình 3) 5,22% 4,11% theo thứ tự, riêng với Hồng Châu, tỷ lệ tái sinh thấp 2,45% (bảng 3) Các chồi kháng kanamycin TẠP CHÍ SINH HỌC, 2012, 34(3SE): 205-211 có biểu gen gusA cấy chuyền vào môi trường MS để chồi phát triển thành rễ Bảng Tần số chuyển gen mầm thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens số giống cà chua Giống cà chua TN 386 Số lượng mầm xử lí chuyển gen 350 Số lượng chồi tái sinh môi trường chọn lọc 18 Phần trăm chồi tái sinh môi trường chọn lọc (%) a* 5,22  0,69 TN148 350 14 4,11  0,84 ab b Hồng Châu 250 2,45  0,43 * Các số trung bình cột với mẫu tự khác khác biệt có nghĩa với p = 0,01 Phân tích PCR gen nptII cryIAb Các dòng chồi tái sinh phát triển tốt môi trường tái sinh có chất chọn lọc kanamycin tách chiết nhiễm sắc thể để kiểm tra diện gen chuyển phản ứng PCR Hình PCR gen cryIAb dương tính với băng DNA 559 bp M Thang DNA chuẩn kb; PC ĐC dương (plasmid); NC âm (cây không chuyển gen); 1, 2, 3, 4, Cây chuyển gen Kiểm tra biểu gen cryIAb Chọn dòng cà chua giả định chuyển gen phát triển tốt môi trường chọn lọc 100 mg/l kanamycin để kiểm tra biểu gen cryIAb thông qua Kit Công ty Envirologix Quickstix (Mỹ) cách phát protein độc tố tạo gen cry1Ab cà chua chuyển gen Lá giả định chuyển gen đối chứng nghiền dung dịch tách chiết protein, que thử nhúng vào tube khoảng phút cho kết có mặt độc tố Bt (Bacillus thuringiensis) khẳng định xuất hai vạch (dương tính) que thử cà chua chuyển Kết PCR gen cryIAb nptII với cặp mồi đặc hiệu cho thấy có diện băng DNA khuếch đại tương ứng 559 bp (hình 4) 600 bp (hình 5) dịng cà chua giả định chuyển gen Hình PCR gen nptII dương tính với băng DNA 600 bp M Thang DNA chuẩn kb; PC Đối chứng dương (plasmid); NC âm (cây không chuyển gen); 1, 2, 3, 4, 5: Cây chuyển gen gen mẫu đối chứng 209 Le Tan Duc, Pham Duc Tri, Nguyen Huu Ho, Ha Tran Minh Dung, Duong Thi Ngoc Thi có vạch (âm tính) (hình 6) KẾT LUẬN Qua nghiên cứu chuyển nạp gen nhờ vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens giống cà chua, chúng tơi nhận thấy, nồng độ thích hợp cho vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens trình xử lí chuyển gen OD600nm nồng độ acetosyringone cho hiệu chuyển gen cao 100 µM Đã nhận nhiều dòng cà chua mang gen nptII cryIAb có mặt gen chuyển kiểm tra dương tính phân tích PCR Đồng thời biểu độc tố Bt kiểm tra que thử công ty Envirologix Quickstix (Hoa Kỳ) TÀI LIỆU THAM KHẢO Abida Yasmeen, 2009 An improved protocol for the regeneration and transformation of tomato (cv Rio Grand), Acta Physiol Plant, 31: 1271-1277 Cortina C., Culiánez-Macià F A., 2004 Tomato transformation and transgenic plant production Plant Cell, Tissue and Organ Culture, 76: 269-275 Chilton M D., Currier T C., Farrand S K., Bendich A J., Gordon M P., Nester E W., 1974 Agrobacterium tumefaciens DNA and P58 bacteriophage DNA not detected in crown gall tumours Proc Natl Acad Sci USA, 71: 3672-3676 210 Hình Kiểm tra biểu gen cryIAb que thử Envirologix Quickstix Dellaporta S., Wood J., Hicks J B., 1983 A plant DNA minipreparation: version II Plant Molecular Biology Reporter, 1(4): 19-21 Fillatti, JoAnne J., Kiser John, Rose Ronald, Comai Luca, 1987 Efficient transfer of a glyphosate tolerance gene into tomato using a binary Agrobacterium tumefaciens vector Nature Biotechnology, 5(7): 726-730 Jefferson R A., Kavanagh T A., Bevan B W., 1987 GUS fusion: -glucuronidase as a sensitive and versatile gene fusion marker in higher plants EMBO, 6: 3901-3907 Gamborg O., Miller R., Ojima K., 1968 Nutrient requirement suspensions cultures of soybean root cells Experimental Cell Research, 50(1): 151-158 Murashige T., Skoog F., 1962 A revised medium for rapid growth and bioassay with tobacco tissue culture Physiol Plant, 15: 473-497 Park S H., Morris J L., Park J E., Hirschi K D., Smith R H., 2003 Efficient and genotype-independent Agrobacteriummediated tomato transformation J Plant Physiol., 160: 1253-1257 10 Sarker R H., Islam K., Hoque M I., 2009 In vitro regeneration and Agrobacteriummediated genetic transformation of tomato Plant Tissue Cult., 19(1): 101-111 TẠP CHÍ SINH HỌC, 2012, 34(3SE): 205-211 A STUDY ON GENETIC TRANSFORMATION OF TOMATO (Lycopersicon esculentum Mill.) WITH AN INSECT RESISTANCE GENE CRY1AB BY Agrobacterium tumefaciens Le Tan Duc1, Pham Duc Tri1, Nguyen Huu Ho1 , Ha Tran Minh Dung1, Duong Thi Ngoc Thi2 (1) (2) Institute of Tropical Biology, VAST Research and Development Center for Hi-tech Agriculture SUMMARY Damage caused by insects to crops is a major problem for the agricultural economy in the tropics The main objective of this study was to transfer the gene cryIAb into tomato by using an Agrobacterium-mediated transformation method Kanamycin was used as the transformant selectable agent Agrobacterium tumefaciens strain EHA105, containing plasmidCAMBIA2301cryIAb that consists of kanamycin resistance gene, gusA gene and cry1Ab gene encoding for delta endotoxin of Bacillus thuringiensis, was used Conditions such as bacterial concentration and concentration of acetosyringone were studied For genetic transformation, the cotylendons were infected and co-cultivated with the Agrobacterium tumefaciens After the day cocultivation, the cotylendons were washed by the cefotaxime solution and transferred to the MS medium containing IAA (0.5 mg/l), BA (2 mg/l) and kanamycin (100 mg/l) for selection After a few weeks, putative transformed explants, able to grow on the kanamycin-containing medium, were transferred to MS medium for root development Expression of GusA was detected by the X-glu substrate in the GUS assay The presence of nptII and cry1Ab in the putative transformed tomatoes was confirmed by polymerase chain reaction analysis Transgenic tomatoes were able to produce Bt endotoxin in the leaf tissue, revealed by the Envirologix Quickstix strip test Keywords: Agrobacterium tumefaciens, Bacillus thuringiensis, Lycopersicon essculentum, genetic transformation Ngày nhận bài: 21-6-2012 211 ... KẾT LUẬN Qua nghiên cứu chuyển nạp gen nhờ vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens giống cà chua, nhận thấy, nồng độ thích hợp cho vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens q trình xử lí chuyển gen OD600nm... acetosyringone dịch nuôi vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens đến khả chuyển gen Để nâng cao tần số chuyển gen acetosyringone sử dụng với nồng độ 50, 100 150 µM q trình chuyển gen với giống cà chua TN386 Sau... đến khả chuyển gen Sau mầm giống cà chua TN 386 tạo vết thương xâm nhiễm vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens mang plasmidCAMBIA230 1cryIAb plasmid có mang gen gusA (gen thị) nên sử dụng biểu gen để