Nghiên cứu chuyển gen nghiên cứu chuyển gen IPT tạo Cytokinin nhằm làm tăng tuổi thọ hoa cẩm chướng (Dianthus caryophyllus L.) nhờ vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens

Lá cẩm chướng in vitro được cắt thành các mảnh kích thước 0,5  0,5cm và đặt trên môi trường tái sinh có TDZ 1,0 mg/l và NAA 0,1 mg/l, thời gian 5 ngày. Tiếp theo nuôi chung các mẫu mô lá với vi khuẩn chủng Agrobacterium tumefaciens LBA4404 chứa plasmid pVDH1396: promoter SAG12 mang gen ipt tạo enzyme isopentenyl transferase liên quan đến sinh tổng hợp cytokinin, gen hpt kháng hygromycin và gen gusA. Sau 5 ngày nuôi chung, mảnh lá được rửa sạch vi khuẩn và cấy truyền sang môi trường như trên có bổ sung cefotaxime 500 mg/l và hygromycin 5 mg/l để chọn lọc cá thể chuyển gen, qua 3 chu kỳ chọn lọc chúng tôi chọn được một số dòng cây chuyển gen. Các dòng chuyển gen được tách và cấy truyền qua môi trường MS có bổ sung IBA 0,5 mg/l và hygromycin 10 mg/l. Một số ít dòng chuyển gen giả định được kiểm tra mô hoá tế bào GUS cũng cho kết quả dương tính. Sự hiện hiện của gen ipt, hpt và gusA được xác định bằng phương pháp PCR, sự hiện diện của các băng DNA mong đợi tương ứng 615 bp; 508 bp; 365bp. Các dòng chuyển gen được lưu giữ cho thí nghiệm tiếp theo để xác định gen chuyển bền vững trong bộ gen cây hoa cẩm chướng bằng phương pháp Southern blot.

TẠP CHÍ SINH HỌC, 2012, 34(3SE): 227-233 NGHIÊN CỨU CHUYỂN GEN IPT TẠO CYTOKININ NHẰM LÀM TĂNG TUỔI THỌ HOA CẨM CHƯỚNG (Dianthus caryophyllus L.) NHỜ VI KHUẨN Agrobacterium tumefaciens Nguyễn Thị Thanh1*, Lê Thị Phương Quyên2, Nguyễn Phương Thảo2 (1*) Viện Sinh học nhiệt đới, Viện Khoa học Công nghệ Việt Nam, thanh.nguyen.itb@gmail.com Trường đại học Quốc tế, ĐHQG thành phố Hồ Chí Minh TĨM TẮT: Lá cẩm chướng in vitro cắt thành mảnh kích thước 0,5  0,5cm đặt môi trường tái sinh có TDZ 1,0 mg/l NAA 0,1 mg/l, thời gian ngày Tiếp theo nuôi chung mẫu mô với vi khuẩn chủng Agrobacterium tumefaciens LBA4404 chứa plasmid pVDH1396: promoter SAG12 mang gen ipt tạo enzyme isopentenyl transferase liên quan đến sinh tổng hợp cytokinin, gen hpt kháng hygromycin gen gusA Sau ngày nuôi chung, mảnh rửa vi khuẩn cấy truyền sang mơi trường có bổ sung cefotaxime 500 mg/l hygromycin mg/l để chọn lọc cá thể chuyển gen, qua chu kỳ chọn lọc chọn số dòng chuyển gen Các dòng chuyển gen tách cấy truyền qua môi trường MS có bổ sung IBA 0,5 mg/l hygromycin 10 mg/l Một số dòng chuyển gen giả định kiểm tra mơ hố tế bào GUS cho kết dương tính Sự hiện gen ipt, hpt gusA xác định phương pháp PCR, diện băng DNA mong đợi tương ứng 615 bp; 508 bp; 365bp Các dòng chuyển gen lưu giữ cho thí nghiệm để xác định gen chuyển bền vững gen hoa cẩm chướng phương pháp Southern blot Từ khóa: Agrobacterium tumefaciens, Dianthus caryophyllu, hoa cẩm chướng, gen hpt, gen ipt, gen gusA, GUS, PCR, promoter SAG12, TDZ MỞ ĐẦU Hoa cẩm chướng (Dianthus caryophyllus L.) thuộc họ Cẩm chướng (Caryophyllaceae), có nguồn gốc từ châu Âu Hoa cẩm chướng có nhiều màu sắc đa dạng, hình dạng phong phú, nhiều chủng loại, màu sắc mùi hương hấp dẫn Với ưu điểm trên, cẩm chướng trở thành bốn loại hoa cắt cành phổ biến giới, chiếm 17% sản lượng hoa cắt cành Italia nước có diện tích trồng hoa cẩm chướng lớn giới với sản lượng 2.500 triệu cành vào năm 1995, Hà Lan đứng thứ hai với sản lượng 1.800 triệu cành, Ba Lan đứng thứ ba với sản lượng 400 triệu cành Colombia xem thiên đường hoa cẩm chướng với chất lượng hoa tốt giới Các nước khác sản xuất hoa cẩm chướng với số lượng đáng kể, Israel, Trung Quốc [24] Hiện nay, cẩm chướng trồng làm hoa cảnh nước xuất có khoảng 20 giống, chủ yếu trồng nhiếu Đà Lạt Hàng năm, Đà Lạt cung cấp khoảng 0,5 triệu cành cẩm chướng loại xuất qua nước: Nhật Bản, Trung Quốc, Ôxtrâylia, Đài Loan, Pháp, Đức, Nga [23] Trên giới Việt Nam, nhân giống cẩm chướng phục vụ sản xuất phương pháp nuôi cấy mô, việc nghiên cứu tạo giống giống kháng nấm, virus có hoa màu sắc lạ, tươi lâu vấn đề quan tâm Nghiên cứu tạo giống công nghệ gen thực có nhiều cơng trình công bố kết nghiên cứu giới chuyển số gen có ý nghĩa khoa học thực tiễn đối tượng cẩm chướng gen ACC, bar, gusA, nptII, LEACO1, PttKN1, rolC, [1, 2, 3, 6, 7, 13, 22] Trong chất điều hoà sinh trưởng auxin, cytokinin, gibberellin, acid abscisic ethylen có vai trò định điều hồ lão hố Trong đó, cytokinin đóng vai trò quan trọng hạn chế q trình lão hóa Trong nghiên cứu ni cấy mơ tế bào thực vật, cytokinin có vai trò rõ rệt q trình giữ cho mơ tách rời chậm thoái hoá diệp lục tố, xanh tươi lâu Ví dụ, cytokinin liên quan mật thiết đến tươi lâu rau vừa thu hoạch kéo dài tuổi thọ hoa cắt cành, mang ý nghĩa kinh tế cao Các nghiên cứu công bố giới nhà khoa học nghiên cứu chuyển gen mã hóa enzyme 227 Nguyen Thi Thanh, Nguyen Thi Phuong Quyen, Nguyen Phuong Thao isopentenyl transferase (ipt) tạo sinh tổng hợp cytokinin isopentenyl adenin, zeatin dihydrozeatin vào trồng với mục đích làm mơ tế bào tự sản xuất cytokinin: hoa giả yên (Petunia), cải bông, hoa cúc, hoa hướng dương, rau cải xà lách, khoai tây, thuốc [4, 9, 10, 14, 15, 16, 17, 20] Tác dụng cytokinin nội sinh làm tăng hoạt chất artemisinin hao chuyển nạp gen ipt lên 70% so với đối chứng khơng chuyển gen [8] Ngồi ra, nghiên cứu chuyển nạp gen ipt tạo chuyển gen có khả chống lại điều kiện bất lợi thời tiết khô hạn, trường hợp thuốc [18, 21] Kế thừa nghiên cứu giới chuyển gen ipt vào thực vật, nghiên cứu chuyển gen ipt vào hoa cẩm chướng với hy vọng biểu gen chuyển có tác dụng làm tăng tuổi thọ hoa giống cẩm chướng PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Tạo nguyên liệu nuôi cấy in vitro Hạt giống cẩm chướng CCF cơng ty Trang Nơng (tp Hồ Chí Minh) khử trùng với cồn 70% phút, sau với sodium hypochloride 30% [5,0 g/l (w/v), Cơng ty CP hóa mỹ phẩm Mỹ Hảo, Hồ Chí Minh] 10 phút rửa nước cất vô trùng Sau cùng, hạt khử trùng gieo môi trường 1/2 MS, để tối khoảng tuần, nhiệt độ 27-28 oC Khi hạt bắt đầu nảy mầm, cấy chuyển tháng lần mơi trường MS khơng chất điều hồ sinh trưởng (ĐHST) Môi trường điều kiện nuôi cấy mô Môi trường 1, môi trường nuôi nhân giống cẩm chướng MS (Murashige-Skoog, 1962), vitamin B5 (Gamborg B5 vitamin) [MSB5] không chất (ĐHST); Môi trường 2, môi trường tái sinh MSB5 có TDZ mg/l + NAA 0,1 mg/l (v/v); Môi trường 3, môi trường tạo vươn chồi rễ MSB5 + IBA 0,5 mg/l Điều kiện nuôi cấy với chiếu sáng/ngày, nhiệt độ 25-27oC Chủng vi khuẩn, môi trường điều kiện nuôi cấy Sử dụng dòng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens LBA4404 chứa plasmid pVDH1396 (kích thước 15,9 kb) mang gen ipt tạo enzyme isopentenyl transferase điều khiển promoter SAG12 (senescence associated gene 12, từ Arabidopsis thaliana), gen gusA (có intron, promoter CaMV 35S), gen kháng hygromycin hpt điều khiển promoter CaMV35S (hình 1) chúng tơi thiết kế Môi trường nhân giữ chủng vi khuẩn mơi trường LB có bổ sung 50 mg/l kanamycin Nhân giống vi khuẩn sử dụng cho nghiên cứu chuyển gen, ni lắc 200 vòng/phút qua đêm mơi trường LB lỏng có bổ sung kanamycin 50 mg/l, nhiệt độ 28oC Hình Sơ đồ plasmid VDH1396 kích thước 15,890 kb RB LB bờ phải bờ trái; hpt gen chọn lọc kháng hygromycin (Tnos/hpt/p35S); ipt gen ipt (pSAG12/ipt/Tnos) gen gusA (T35S/gus/p35S) Chuyển gen vào cẩm chướng nhờ khuẩn Agrobacterium tumefaciens Lá khoảng 4-6 tuần tuổi cắt thành mảnh có kích thước khoảng 0,5  05 cm 228 sử dụng làm vật liệu chuyển nạp gen Các bước thí nghiệm tiến hành sau: Nuôi cấy mẫu mô môi trường số thời gian ngày; Gây nhiễm mẫu mô với vi khuẩn tỉ lệ 1:10 (v/v) vòng 30 TẠP CHÍ SINH HỌC, 2012, 34(3SE): 227-233 phút; Vớt mẫu ra, thấm bớt dịch vi khuẩn thừa giấy lọc vô trùng; Nuôi chung mô với vi khuẩn 2-3 ngày Sử dụng mơi trường số lỏng có bổ sung acetosyringone 100 µM Sau ngày ni cấy chung, rửa vi khuẩn nước cất có bổ sung dung dịch cefotaxime 500 mg/l, lắc nhẹ Vớt mẫu ra, thấm khô nước cấy mẫu mô mơi trường chọn lọc (số 2) có bổ sung hygromycin mg/l, cefotaxime 500 mg/l Sau tuần, chuyển qua mơi trường chọn lọc có bổ sung hygromycin 510 mg/l, cefotaxime 500 mg/l Tiếp tục chu kỳ tăng nồng độ hygromyicn từ 5-10 mg/l, tiếp tục chọn lọc thêm chu kỳ (3 tuần/chu kỳ) Cấy truyền mẫu mô kháng hygromycin qua môi trường số chứa hygromycin 10 mg/l, đến vươn chồi, thời gian khoảng tháng Kiểm tra phát triển cá thể chuyển gen mơi trường có hygromycin Tách dòng chuyển gen kháng hygromycin cấy chuyển qua môi trường số có bổ sung hygromycin 10 mg/l, theo dõi sinh trưởng Thử GUS [20]: Ngâm mẫu mô vào dung dịch thuốc thử GUS, hút thấm chân không, 37oC 16 Phân tích PCR Tách chiết tinh DNA dòng cẩm chướng khơng chuyển gen dòng chuyển gen DNesasy plant Mini kit (QIAGEN, Đức) Kiểm tra có mặt gen ipt hpt, gusA dòng cẩm chướng chuyển gen giả định cặp mồi đặc hiệu gen sau: hpt-1: 5’-AGCTGCGCCGATGGTTT CTACAA-3’ hpt-2: 5’-ATCGCCTCGCTCCA GTCAATG-3’ Sản phẩm PCR khuếch đại có kích thước đoạn DNA 508 bp; gusA-1:5’CCTGTAGAAACCCCAACCCGG-3.’ gusA-2: 5’-CCCGGCAATAACATACGGCG TG-3’ Sản phẩm PCR khuếch đại đoạn DNA có kích thước 365 bp; ipt-1: 5’-TCGGTCCAAC TTGCACAGGAA-3’ ipt-2: 5’-TACTCCTG AGCGATCCCAT-3’ Sản phẩm PCR khuếch đại đoạn DNA có kích thước 615 bp Chương trình ln nhiệt: 95 oC: phút; 30 chu kỳ (95oC: phút, 52 -55oC: phút, 72oC: phút) 72 oC: phút, sau bảo quản sản phẩm PCR 4oC KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Nghiên cứu tính chống chịu tự nhiên mô kháng sinh hygromycin Kết nghiên cứu tính chống chịu tự nhiên mẫu mơ giống cẩm chướng CCF có khả kháng hygromycin tự nhiên mg/l Vì vậy, chúng tơi sử dụng nồng độ hygromycin chọn lọc dòng chuyển nạp gen, nồng độ từ thấp lên cao từ 5-10 mg/l (đối chứng hygromycin mg/l, gây chết mẫu mơ sau tuần ni cấy) Ở thí nghiệm chúng tôi, chọn lúc đầu nồng độ hygromycin 10 mg/l khơng thu nhận kết Giai đoạn nuôi chung mẫu mô với vi khuẩn Nhiều nghiên cứu công bố giới dùng phương pháp chuyển nạp gen vào trồng, thời gian nuôi cấy chung khoảng 2-3 ngày [8, 10, 15] Nhưng đối tượng cẩm chướng, thời gian nuôi chung với vi khuẩn sau 2-3 ngày nuôi cấy mọc yếu [3, 5] Vì vậy, chúng tơi tăng thời gian ni ủ chung với vi khuẩn lên ngày Có nhiều khả năng, q trình ni cấy chung với vi khuẩn số giống cẩm chướng tiết phenol gây cản trở phát triển vi khuẩn Chính lý này, thí nghiệm chúng tơi ni chung mẫu mô với vi khuẩn tốt thời gian ngày nồng độ kháng sinh hygromycin bước đầu cho chọn lọc các thể chuyển nạp gen giả định mg/l Chọn lọc cá thể chuyển nạp gen Sau giai đoạn nuôi chung với vi khuẩn, cấy chuyển mẫu mô môi trường tái sinh có bổ sung hygromycin 10 mg/l, mẫu mơ bị chết (số liệu chưa cơng bố) Vì vậy, chế độ chọn lọc tế bào chuyển nạp gen từ thấp đến cao (hygromycin 5-10 mg/l) Sau khoảng tháng chọn lọc, có nhiều mẫu mơ bị chết, có hình thành số cụm callus tăng sinh mơi trường có hygromycin 5mg/l Tiếp theo, cấy chuyển callus qua mơi trường có hygromycin 6-10 mg/l tăng dần lần chọn lọc thứ 10 mg/l (hình 2) Sau chu kỳ chọn lọc triệt để, thu nhận dòng chuyển gen giả định từ 135 mẫu mơ Tần số chuyển gen 3,7% 229 Nguyen Thi Thanh, Nguyen Thi Phuong Quyen, Nguyen Phuong Thao Kiểm tra khả phát triển rễ mơi trường có hygromycin Năm dòng chuyển gen giả định thu nhận mơi trường chọn lọc có hygromycin 10 mg/l cấy chuyển qua mơi trường số có bổ sung hygromycin 10 mg/l Kết chồi phát triển rễ tốt (hình 2) Hình Chọn lọc tái sinh dòng cẩm chướng chuyển gen kiểm tra tính kháng hygromycin cá thể chuyển gen a (DC đối chứng không chuyển gen; CG Callus phát triển môi trường tái sinh có hygromycin mg/l); b: Callus kháng hygromycin; c Chồi phát triển môi trường tái sinh có hygromycin mg/l; d, e chuyển gen mơi trường có hygromycin 10 mg/l; g Cẩm chướng đối chứng không chuyển gen Thử GUS: Lấy ngẫu nhiên dòng cẩm chướng chuyển gen giả định (CCF-T1; CCF-T3 CCFT5) thử với X-GUC Kết quả, hầu hết mơ cẩm chướng kháng hygromycin có kết dương tính với thuốc thử GUS (hình 3d) Phân tích PCR gen ipt, hpt gen gusA Các dòng cẩm chướng kháng hygromycin sinh trưởng bình thường mơi trường có hygromycin 10 mg/l tách chiết DNA kiểm tra PCR Kết PCR cho thấy, gen ipt, hpt gen gusA với cặp mồi đặc hiệu cho thấy diện băng DNA khuếch đại tương ứng 615 bp, 508 bp 365 bp (hình 3a, 3b, 3c) KẾT LUẬN Nghiên cứu chuyển nạp gen vào mẫu mô 230 cẩm chướng phương pháp gián tiếp nhờ vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens LBA 4404 chứa plasmid pVDH1396 mang gen, hpt, ipt gen gusA, nhận số dòng chuyển nạp gen Qua phân tích dòng sinh trưởng in vitro bình thường mơi trường có hygromycin 10mg/l, nhuộm xanh với thuốc thử GUS Phân tích PCR gen hpt, ipt gen gusA cho thấy, băng DNA dương tính 508 bp, 615 bp 365 bp Các dòng chuyển nạp gen tiếp tục giữ giống để phục vụ bước nghiên cứu tiếp theo, phân tích có mặt gen chuyển gen hoa cẩm chướng kỹ thuật Southern bot trồng thử nghiệm nhà lưới, theo dõi đánh giá khả tăng tuổi thọ hoa dòng chuyển gen TẠP CHÍ SINH HỌC, 2012, 34(3SE): 227-233 Hình Phân tích PCR thử GUS dòng cẩm chướng chuyển gen gián tiếp nhờ vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens (a) gen ipt dương tính với băng DNA 615 bp; M Thang chuẩn 1,0 kb (BioLabs, Mỹ); Đối chứng âm (cây không chuyển gen); Đối chứng dương (plasmid); Đối chứng dương tính dòng phong lan chuyển gen ipt), 2, 3, 4, Các dòng chuyển nạp gen (b) gen hpt dương tính với băng DNA 508 bp; M Thang chẩn DNA 100 bp (Sigma, Mỹ); Đối chứng âm (cây không chuyển gen); Đối chứng dương (plasmid); Đối chứng dương tính dòng phong lan chuyển gen hpt); 2, 3, 4, Các dòng chuyển nạp gen (c) gen gusA dương tính với băng DNA 365 bp; M Thang chuẩn kb (BioLabs, Mỹ); 1, Các dòng cẩm chướng chuyển gen; Đối chứng âm (cây không chuyển gen) (d) Biểu gen gusA sau nhuộm với thuốc thử GUS; -ve đối chứng không chuyển nạp gen; 1, dòng cẩm chướng chuyển nạp gen Lời cảm ơn: Các tác giả xin chân thành cảm ơn Đại học quốc gia Hồ Chí Minh hỗ trợ kinh phí; Phòng Thí nghiệm trọng điểm Cơng nghệ Tế bào thực vật phía Nam, Viện Sinh học nhiệt đới, Viện Khoa học Công nghệ Việt Nam hỗ trợ trang thiết bị cho nghiên cứu microprojectile bombardment Sci Hortic, 64:177-185 TÀI LIỆU THAM KHẢO Amir Zucker, Ahroni A., Tzfira T., BenMeir H., Vainstein A 1999 Wounding by bombardment yields highly efficient Agrobacterium - mediated transformation of carnation (Dianthus caryophyllus L.) Mol Breed, 5: 367-375 Amir Zucker A., Chang R F L., Ahroni A., Cheah K., Woodson W R., Bressan R A., Watad A A., Hasegawa P M., Vainstein A., 2010 Transformation of carnation by Chalermsri Nontaswatsri., Seiichi F., Masanori G 2003 Revised cocultivation conditions produce effective Agrobacterium - mediated genetic transformation of 231 Nguyen Thi Thanh, Nguyen Thi Phuong Quyen, Nguyen Phuong Thao carnation (Dianthus caryophyllus L.) Plant Sci., 166: 59-68 Chang H., Jones M L., Baz G M., Clarke D G., 2003 Overproduction of cytokinin in Petunia flowers transformed with PSAG12IPT delays Corolla senescence and decrease sensitivity to ethylene Plant Physiol., 132: 2174-2138 Chin-Yi L., Greg N., Terese W.R., Stephen F.C., Richard Y Michael J D 1999 Agrobacterium-mediated transformation of carnation (Dianthus caryophyllus L.) Nature Biotech., 9:864-868 Estopa M., Marfa V., Mele E and Messeguer J., 2001 Study of different antibiotic combination for use in the elimination Agrobacterium with kanamycin selection in carnation Plant Cell Tiss Org., 65: 211-220 Eva C., Ana E V., Amir Z., Belen F., Alexander V., Maria I T., Lluisa M., 2004 rolC-transgenic carnation plants: adventitious organogenesis and levels of endogenous auxin and cytokinins Plant Sci., 167: 551-560 Geng Sa., Ma M., Ye H., Liu B., Li G., Chong Kang, 2001 Effects of ipt gene expression on the physiological and chemical characteristics of Artemisia annua L Plant Sci., 160: 691-698 Hsiang Chang, Michelle L J., Gary M B., and David G C., 2003 Overproduction of cytokinins in Petunia flowers transformed with pSAG12- IPT delays corolla senescence and decreases sensitivity to Ethylene Plant Physiol., 132: 2174-2183 10 Kim-Hong Nguyen., Wilco J., Kees Van D, Frank S., Evert D., Geert S., Philip J Dix., and Eugene J K., 2008 Delayed senescence in cauliflower transformed with an autoregulated isopentenyl transferase gene Int J Plant Sci., 169(3): 339-347 11 Lai-Sheng Meng., Jiang-Ping S., Shao-Bu S., Chong-Ying W., 2009 The ectopic PttKN1 gene causes pleiotropic alternating of morphology in transgenic carnation (dianthus caryophyllus L.) Act Physiol 232 Plant, 31(6): 1155-1164 12 Long-Fang O., Chen, Jia-Yuan H., YeeYung C., Chi-Wen S., Shang-Fa Ya., 2001 Transformation of broccoli (Brassica oleracea var italica) with isopentenyltransferase gene via Agrobacterium tumefaciens for post-harvest yellowing retardation Mol Breed, 7: 243-257 13 Mariya K., Degang Z., William S., Yi Li, Richard McAvoy, 2006 Expression of ipt gene controlled by an ethylene and auxin responsise fragment of the LEACO1 promoter increases flower number in transgenic Nicotiana tabacum Plant Cell Rep., 25: 1181-1192 14 Mariya K., Radomira V., Jiri M., Aizhen L., Yi Li, Richard McAvoy, 2009 Enhancement of flowering and branching phenotype in chrysanthemum by expression of ipt under the control of a 0.821 kb fragment of the LEACO1 gene promoter Plant Cell Rep., 28: 1351-1362 15 Matthew S McCabe., Lee C G., Frank S., Wilco J R M Jordi, Geert M S., Evert D., J Hans A van R., J Brian P., Michael R D., 2001 Effects of PSAG12-IPT gene expression on development and senescence in transgenic lettuce Plant Physiol., 127: 505-516 16 Molinier J., Thomas C., Brignou M., Hahne G., 2002 Transient expression of ipt gene enhances regeneration and transformation rates of sunflower shoot apices (Helianthus annuus L.) Plant Cell Rep., 21: 251-256 17 Nigel E Gapper., Marian J M., Mary C C., Robert H B., Simon A C., Ross E L, Paula E J., 2002 Agrobacterium tumefaciens - mediated transformation to alter ethylene and cytokinin biosynthesis in broccoli Plant Cell, Tiss and Organ Cul., 70: 41-50 18 Rivero R M., Kojima M., Gepstein A., Sakakibara H., Mittler R., Gepstein S., Blumwald E., 2007 Delayed leaf senescence induces extreme drought tolerance in a flowring plant Proc Natl Acad Sci USA, 104: 19631-19636 TẠP CHÍ SINH HỌC, 2012, 34(3SE): 227-233 19 Song Z., Li-Hua Z., Xue-Yuan L., Annelie A., Margareta W., 2004 Infection by Agrobacterium tumefaciens increased the resistance of leaf explants to selective agent in carnation (Dianthus caryophyllus L and D chinensis) Plant Sci., 168: 137-144 20 Thanh T Nguyen., Philip J Dix, Greg D Nugent, 2010 Transformation of potato via Agrobacterium coated microparticle bombardment Biologia Plantarum., 54(1): 141-144 21 Yan Xu., Jiang T., Thomas G., Bingru H., 2009 Effects of SAG12-ipt expression on cytokinin production, growth and senescence of creeping bentgrass (Agrostis stolonifera L.) under heat stress Plant Growth Regul., 57: 281-291 22 Yusuke K., Kenichi S., Nanako T., Yujiro I., Atsushi M., Toshihito Y., Teruyoshi H., Shigeru S., 2000 Expression of genes responsible for ethylene production and wilting are differently regulated in carnation (Dianthus caryophyllus L.) petals Plant Sci., 158:139-145 23 http://www.rauhoaquavietnam.vn 24 Đặng văn Thông, Đinh Thế Lộc, 2005 Hoa Cẩm Chướng Nxb Lao Động - Xã Hội A STUDY ONE ISOPENTENYL TRANSFERASE GENE BY USING Agrobacterium tumefaciens TO INCREASE THE LONGEVITY OF CARNATION (Dianthus caryophyllus L.) Nguyen Thi Thanh1*, Nguyen Thi Phuong Quyen2, Nguyen Phuong Thao2 (1) (2) Institute of Tropical Biology, VAST International University, Vietnam National University-Ho Chi Minh City SUMMARY In vitro leaves of carnation (cut-off flower) variety CCF cut into small pieces about 1x1cm in size were precultured for days and were co-cultivated with the Agrobacterium tumefaciens strain LBA 4404 harbouring the plasmid pVDH1396 contained the β-glucuronida gene (gusA), hygromycin phosphotransferase gene (hpt) under the control of cauliflower Mosaic virus 35S promoters, terminators, and an isopentenyl transferase (ipt) gene from Agrobacterium tumefaciens, driven by the SAG12 promoter from senescence associated gene 12 of Arabidopsis thaliana and its terminator After days of co-cultivation, explants were transferred onto the MS selection medium containing 1.0mg/l TDZ and 0.1mg/l NAA, 5mg/l hygromycin, 500 mg/l cefotaxime Some putative shoots were tested for GUS assay Putative shoots were transferred on MS medium containing 0.5 mg/l IBA and 10 mg/l hygromycin PCR analyses on hygromycin resistant shoots generated via Agrobacterium tumefaciens transformation to confirm the presence of the, ipt, hpt and gusA genes with expected bands 615bp, 508bp and 365bp Analysis of putative carnation transformants to confirm that the foreign genes are inserted into the carnation genome by Southern blot analyses will be done in the future Keywords: Agrobacterium tumefaciens, carnation, hpt, gusA, ipt, GUS, mediated transformation, PCR, promoter SAG12, TDZ Ngày nhận bài: 21-6-2012 233 ... chuyển gen ipt vào hoa cẩm chướng với hy vọng biểu gen chuyển có tác dụng làm tăng tuổi thọ hoa giống cẩm chướng PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Tạo nguyên liệu nuôi cấy in vitro Hạt giống cẩm chướng CCF... nghiên cứu chuyển nạp gen ipt tạo chuyển gen có khả chống lại điều kiện bất lợi thời tiết khô hạn, trường hợp thuốc [18, 21] Kế thừa nghiên cứu giới chuyển gen ipt vào thực vật, nghiên cứu chuyển gen. .. hpt gen chọn lọc kháng hygromycin (Tnos/hpt/p35S); ipt gen ipt (pSAG12 /ipt/ Tnos) gen gusA (T35S/gus/p35S) Chuyển gen vào cẩm chướng nhờ khuẩn Agrobacterium tumefaciens Lá khoảng 4-6 tuần tuổi