Thiết lập quy trình cảm ứng tạo rễ tơ bạch đàn phục vụ nghiên cứu chuyển gen và chỉnh sửa hệ gen

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT TRƯỜNG ĐẠI HỌC LÂM NGHIỆP NGUYỄN THỊ HUYỀN THIẾT LẬP QUY TRÌNH CẢM ỨNG TẠO RỄ TƠ BẠCH ĐÀN PHỤC VỤ NGHIÊN CỨU CHUYỂN GEN VÀ CHỈNH SỬA HỆ GEN CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC MÃ NGÀNH: 8420201 LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS ĐỖ TIẾN PHÁT TS NGUYỄN THỊ HỒNG GẤM Hà Nội, 2023 i CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM Độc lập - Tư - Hạnh phúc LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan nội dung luận văn với số liệu kết đạt trung thực chưa công bố công trình nghiên cứu khác Nếu nội dung nghiên cứu tơi trùng lặp với cơng trình nghiên cứu cơng bố, tơi xin hồn tồn chịu trách nhiệm tuân thủ kết luận đánh giá luận văn Hội đồng khoa học Hà Nội, ngày tháng năm 2023 NGƯỜI CAM ĐOAN Nguyễn Thị Huyền ii LỜI CẢM ƠN Tôi xin chân thành gửi lời cảm ơn đến Thầy Cô giáo Viện Công nghệ sinh học Lâm nghiệp, Trường Đại học Lâm nghiệp trang bị kiến thức tạo điều kiện thuận lợi cho tơi suốt q trình học tập trường Tơi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến Ban Lãnh đạo Tập thể cán Bộ môn Sinh học phân tử Viện Nghiên cứu Giống Công nghệ sinh học Viện Khoa học Lâm nghiệp Tập thể cán phịng Cơng nghệ tế bào thực vật - Viện Công nghệ sinh học - Viện Hàn lâm Khoa học & Công nghệ Việt Nam tạo điều kiện thuận lợi giúp đỡ tơi suốt q trình học tập thực đề tài luận văn Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới Thầy hướng dẫn TS Đỗ Tiến Phát (Viện Công nghệ sinh học - Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam), Cô hướng dẫn TS Nguyễn Thị Hồng Gấm (Viện Công nghệ sinh học Lâm nghiệp - Trường Đại học Lâm nghiệp) Nghiên cứu sinh Bùi Phương Thảo (Viện Công nghệ sinh học - Viện Hàn lâm Khoa học Cơng nghệ Việt Nam) tận tình hướng dẫn, bảo giúp đỡ tơi suốt q trình thực luận văn Đề tài nghiên cứu nhận trợ giúp vật liệu, hóa chất học thuật từ Đề tài “Hỗ trợ hoạt động nghiên cứu khoa học cho nghiên cứu viên cao cấp năm 2022-2023", mã số NCVCC08.01/22-23 GS.TS Chu Hoàng Hà làm Chủ nhiệm Cuối cùng, tơi xin bày tỏ lịng biết ơn tới gia đình bạn bè giúp đỡ, động viên khích lệ tơi suốt q trình học tập thực luận văn thạc sĩ Hà Nội, ngày tháng năm 2023 TÁC GIẢ Nguyễn Thị Huyền iii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN ii MỤC LỤC iii DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT vi DANH MỤC CÁC BẢNG viii DANH MỤC CÁC HÌNH ix MỞ ĐẦU 1 Lý chọn đề tài Mục tiêu nghiên cứu Ý nghĩa khoa học đề tài Chương TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU 1.1 Tổng quan Bạch đàn lai 1.1.1 Giới thiệu chung bạch đàn số giống sản xuất 1.1.2 Tình hình trồng khảo nghiệm bạch đàn lai Việt Nam 1.1.3 Tình hình nghiên cứu nhân giống bạch đàn lai Việt Nam 1.2 Nghiên cứu chuyển gen chỉnh sửa gen bạch đàn 1.2.1 Nghiên cứu chuyển gen 1.2.2 Nghiên cứu chỉnh sửa gen 1.3 Phương pháp đánh giá hoạt động cấu trúc chỉnh sửa gen 10 1.3.1 Hệ thống biểu tạm thời 10 1.3.2 Hệ thống tế bào trần 10 1.3.3 Hệ thống cảm ứng rễ tơ 11 1.4 Vi khuẩn Rhizobium Rhizogenes 12 1.4.1 Giới thiệu vi khuẩn R rhizogenes 12 1.4.2 Cơ chế chuyển gen 15 1.4.3 Các nghiên cứu chuyển gen tạo rễ tơ bạch đàn 17 iv Chương NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19 2.1 Đối tượng nghiên cứu 19 2.1.1 Vật liệu thực vật 19 2.1.2 Chủng vi khuẩn 19 2.2 Địa điểm thực 19 2.3 Nội dung nghiên cứu 19 2.3.1 Đánh giá ảnh hưởng môi trường nuôi cấy, ánh sáng chủng vi khuẩn đến cảm ứng tạo rễ tơ bạch đàn thông qua vi khuẩn R rhizogenes 19 2.3.2 Đánh giá tác động yếu tố trình lây nhiễm tới cảm ứng tạo rễ tơ bạch đàn thông qua vi khuẩn R rhizogenes 19 2.3.3 Kiểm tra đánh giá hiệu chuyển gen quy trình tạo rễ tơ thiết lập 20 2.4 Phương pháp nghiên cứu 20 2.4.1 Phương pháp tiến hành 20 2.4.2 Các cơng thức thí nghiệm 25 2.4.3 Thu thập xử lý số liệu 28 Chương KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 29 3.1 Kết đánh giá ảnh hưởng môi trường nuôi cấy, ánh sang chủng vi khuẩn đến cảm ứng tạo rễ tơ bạch đàn thông qua vi khuẩn R rhizogenes 29 3.2 Kết đánh giá tác động yếu tố trình lây nhiễm tới cảm ứng tạo rễ tơ bạch đàn thông qua vi khuẩn R rhizogenes 34 3.2.1 Ảnh hưởng loại vật liệu đến hiệu chuyển gen 34 3.2.2 Ảnh hưởng mật độ vi khuẩn đến hiệu chuyển gen 38 3.2.3 Ảnh hưởng thời gian lây nhiễm đến hiệu chuyển gen 41 3.2.4 Ảnh hưởng thời gian đồng nuôi cấy đến cảm ứng tạo rễ tơ 43 3.3 Kiểm tra đánh giá hiệu chuyển gen quy trình tạo rễ tơ thiết lập 45 v 3.3.1 Kiểm tra đánh giá biểu gen thị phương pháp nhuộm X-Gluc 45 3.3.2 Kiểm tra có mặt gen chuyển phương pháp phân tử 47 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 49 DANH MỤC CƠNG TRÌNH CỦA TÁC GIẢ 50 TÀI LIỆU THAM KHẢO 61 PHỤ LỤC vi DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT Viết đầy đủ Từ viết tắt A tumefaciens ABT AS BAP Bộ NN & PTNN bp CRISPR Agrobacterium tumefaciens Transplantone (chất kích thích rễ) Acetonsyringone 6-Benzyl Amino Purine Bộ Nông nghiệp Phát triển Nông thôn Base pair (cặp bazơ nitơ) Clustered regularly interspaced short palindromic repeats CTAB Cetyltrimethylammonium bromide DNA Deoxyribonucleic Acid IAA Indole-3-acetic acid IBA Indole-3-Butyric Acid LB Left border (bờ trái) MS Môi trường nuôi cấy Murashige & Skoog NAA 1-Naphthyl Acetic Acid NST Nhiễm sắc thể OD Optical Density (mật độ quang học) PCR Polymerase Chain Reaction (phản ứng chuỗi polymerase) PCR Polymerase Chain Reaction PCR-RFLP Restriction Fragment Length Polymorphism R rhizogenes Rhizobium rhizogenes RB Right border (bờ phải) Ri-plasmid RNA Rol SgRNA Ss T-DNA TB Root induction plasmid (plasmid cảm ứng rễ) Ribonucleic Acid Root locus Single guied RNA Single stranded T-DNA (sợi đơn T-DNA) Trung bình vii Viết đầy đủ Từ viết tắt UP Eucalyptus urophylla x Eucalyptus pellita Vir Virulence genes (gen độc) X-Gluc 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-beta-D-glucuronic acid YEP Yeast Extract Peptone YMB Yeast Manitol Broth viii DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 Các nghiên cứu chuyển gen đối tượng bạch đàn Bảng 2.1 Môi trường sử dụng nghiên cứu nuôi cấy rễ tơ bạch đàn lai 20 Bảng 2.2 Trình tự mồi đặc hiệu sử dụng nghiên cứu 25 Bảng 3.1 Kết ảnh hưởng điều kiện đến cảm ứng tạo rễ tơ bạch đàn lai 33 Bảng 3.2 Kết tối ưu loại vật liệu đến hiệu chuyển gen 35 Bảng 3.3 Kết ảnh hưởng mật độ vi khuẩn đến hiệu chuyển gen39 Bảng 3.4 Kết tối ưu thời gian lây nhiễm đến trình chuyển gen bạch đàn lai 41 Bảng 3.5 Kết ảnh hưởng thời gian đồng ni cấy đến q trình chuyển gen bạch đàn lai 43 Bảng 3.6 Kết đánh giá quy trình cảm ứng tạo rễ tơ bạch đàn lai in vitro với điều kiện tối ưu thiết lập 45 ix DANH MỤC CÁC HÌNH Sơ đồ 2.1 Tóm tắt quy trình cảm ứng tạo rễ tơ bạch đàn lai UP………….22 Hình 3.1 Kết ảnh hưởng mơi trường đến cảm ứng tạo rễ tơ bạch đàn 30 Hình 3.2 Kết ảnh hưởng ánh sáng đến cảm ứng tạo rễ tơ bạch đàn in vitro sau 21 ngày 31 Hình 3.3 Kết ảnh hưởng chủng vi khuẩn đến cảm ứng tạo rễ tơ bạch đàn 33 Hình 3.4 Vị trí lấy mẫu sử dụng để biến nạp bạch đàn lai UP54 in vitro 35 Hình 3.5 Kết cảm ứng tạo rễ tơ loại vật liệu bạch đàn lai 36 Hình 3.6 Kết nhuộm X-Gluc loại vật liệu lây nhiễm 37 Hình 3.7 Kết ảnh hưởng mật độ vi khuẩn đến cảm ứng tạo rễ tơ bạch đàn in vitro 40 Hình 3.8 Kết ảnh hưởng thời gian lây nhiễm đến cảm ứng mẫu tạo rễ tơ bạch đàn in vitro 42 Hình 3.9 Kết ảnh hưởng thời gian đồng nuôi cấy đến cảm ứng tạo rễ tơ bạch đàn in vitro 44 Hình 3.10 Các bước quy trình cảm ứng tạo rễ tơ in vitro bạch đàn lai UP thông qua vi khuẩn R rihzogenes ATCC 46 Hình 3.11 Kết điện di sản phẩm PCR xác định có mặt gen chuyển bạch đàn lai UP với chủng R rihzogenes ATCC 15834 48