Nghiên cứu khả năng cải thiện tính trạng hạt thông qua chỉnh sửa gen GS3 bằng công nghệ chỉnh sửa hệ gen CRISPR cas9

LỜI CẢM ƠNĐược sự đồng ý của Ban giám hiệu nhà trường, Ban chủ nhiệm khoa Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm, trong thời gian thực tập tốt nghiệp tại trường

TRƯƠNG THANH TÙNG

Tên đề tài:

NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG CẢI THIỆN TÍNH TRẠNG HẠT THÔNG

QUA CHỈNH SỬA GEN GS3 BẰNG CÔNG NGHỆ CHỈNH SỬA HỆ GEN

THÁI NGUYÊN, NĂM 2021

TRƯƠNG THANH TÙNG

Tên đề tài:

NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG CẢI THIỆN TÍNH TRẠNG HẠT

THÔNG QUA CHỈNH SỬA GEN GS3 BẰNG CÔNG NGHỆ

CHỈNH SỬA HỆ GEN CRISRP/CAS9

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

: CNSH - CNTP : 2017 - 2021

: PGS.TS Nguyễn Tiến Dũng

THÁI NGUYÊN, NĂM 2021

LỜI CẢM ƠN

Được sự đồng ý của Ban giám hiệu nhà trường, Ban chủ nhiệm khoa

Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm, trong thời gian thực tập

tốt nghiệp tại trường em đã thực hiện đề tài: “Nghiên cứu khả năng cải

thiện tính trạng hạt thông qua chỉnh sửa gen GS3 bằng công nghệ chỉnh sửa hệ gen CRISPR/Cas9.”.

Trước hết em xin gửi tới Ban giám hiệu nhà trường, Ban chủ nhiệm khoa Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm cùng các thầy cô giáo trong Khoa lời chúc sức khỏe và lời cảm ơn chân thành nhất, với sự dạy dỗ, quan tâm và đã tạo điều kiện thuận lợi cho em hoàn thành đề tài nghiên cứu này.

Em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến giảng viên hướng dẫn PGS.TS

Nguyễn Tiến Dũng, giảng viên khoa Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực

phẩm, thầy đã chỉ bảo, quan tâm giúp đỡ và hướng dẫn em hoàn thành tốt trong suốt quá trình thực hiện đề tài.

Đồng thời, em xin cảm ơn thầy giáo TS Lã Văn Hiền, giảng viên khoa

Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm đã hướng dẫn và tạo điều kiện tốt nhất cho em trong suốt thời gian thực hiện đề tài tốt nghiệp.

Cuối cùng, em xin cảm ơn gia đình đã tạo điều kiện và luôn là chỗ dựa tinh thần cho em trong suốt thời gian thực tập, cảm ơn bạn bè đã hết lòng động viên, giúp đỡ và đồng hành với tôi trong suốt thời gian qua.

Trong quá trình thực tập, cũng như làm báo cáo thực tập với điều kiện thời gian cũng như kinh nghiệm còn hạn chế không thể tránh được những sai sót Em rất mong nhận được sự chỉ bảo, đóng góp ý kiến của các thầy cô và các bạn để em có điều kiện bổ sung, nâng cao năng lực của mình để đề tài được hoàn thiện hơn, phục vụ tốt hơn cho việc học tập và công việc sau này.

Sau cùng, em xin kính chúc quý thầy, cô trong nhà trường, trong khoa Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm nhiều may mắn và dồi dào sức khỏe, tiếp tục sứ mệnh cao đẹp của mình là truyền đạt kiến thức cho thế hệ sau.

Em xin chân thành cảm ơn!

Thái Nguyên, ngày… tháng ….năm 2021

Sinh viên thực hiện

Trương Thanh Tùng

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN i

MỤC LỤC iii

DANH MỤC BẢNG v

DANH MỤC HÌNH vi

DANH MỤC TỪ VÀ THUẬT NGỮ VIẾT TẮT vii

Phần 1.MỞ ĐẦU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Mục tiêu của đề tài 2

1.2.1.Mục tiêu tổng quát 2

1.2.2 Mục tiêu cụ thể 2

1.3.Ý nghĩa khoa học và thực tiễn 2

1.3.1.Ý nghĩa khoa học của đề tài 2

1.3.2 Ý nghĩa thực tiễn của đề tài 2

Phần 2.TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

2.1 Giới thiệu về cây lúa 3

2.1.1 Vai trò của lúa gạo 3

2.1.2 Tình hình sản xuất lúa ở Việt Nam năm 2020 4

2.1.3 Giá trị kinh tế 4

2.1.4 Giá trị dinh dưỡng 6

2.1.5 Kĩ thuật chuyển gen thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens 8

2.1.6 Đặc điểm gen GS3 10

2.2 Tổng quan tình hình trong nước và trên thế giới 10

2.2.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới 10

2.2.2 Tình hình nghiên cứu trong nước 13

Phần 3 ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15

3.1 Đối tượng nghiên cứu và phạm vi nghiên cứu 15

3.1.1 Đối tượng nghiên cứu 15

3.1.2 Hóa chất thực hành 15

3.1.3 Thiết bị dụng cụ thực hành 17

3.2 Địa điểm và thời gian tiến hành thí nghiệm 17

3.3 Nội dung nghiên cứu 17

3.4 Phương pháp nghiên cứu 17

3.4.1 Phương pháp bố trí thí nghiệm 17

3.4.2 Phương pháp nghiên cứu chuyển cấu trúc CRISPR/Cas9-GS3 vào giống lúa Dongjin 18

3.4.3 Phương pháp nghiên cứu chọn lọc dòng đột biến bằng kĩ thuật PCR 19

3.4.4 Đánh giá đặc điểm nông sinh học của các dòng lúa 23

3.5 Các phương pháp xử lý số liệu 23

Phần 4 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 24

4.1 Kết quả nghiên cứu chuyển cấu trúc CRISPR/Cas9-GS3 vào giống lúa Dongjin 24

4.1.1 Chuyển gen CRISPR/Cas9 có chứa các trình tự định hướng trên cây lúa japonica Dongjin thông qua vi khuẩn Agrobacterium 24

4.1.2 Tái sinh và chọn lọc các dòng lúa chuyển gen T0 25

4.2 Kết quả nghiên cứu chọn lọc dòng đột biến bằng kĩ thuật PCR 28

4.2.1 Kết quả tách chiết DNA tổng số 28

4.2.2 Kết quả sàng lọc cây chuyển gen bằng PCR 29

4.2.2.1 Kết quả chọn lọc chuyển gen bằng PCR 29

4.2.2.2 Xác định trình tự đột biến của gen GS3 trên cây lúa 31

4.3 Kết quả đánh giá đặc điểm hình thái các cây chỉnh sửa gen 32

4.3.1 Đánh giá đặc điểm nông sinh học của các dòng cây T0 32

4.3.1.1 Đặc điểm chiều cao cây, số nhánh/cây 32

4.3.1.2 Các yếu tố cấu thành năng suất 34

4.3.1.3 Kích thước hạt của các dòng lúa đột biến 36

Phần 5 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 40

5.1 Kết luận 40

5.2 Kiến nghị 40

TÀI LIỆU THAM KHẢO 41

DANH MỤC BẢNG

Bảng 3.1 Thành phần môi trường nuôi cấy lúa chuyển gen 16

Bảng 3.2 Thiết bị, dụng cụ nghiên cứu 17

Bảng 3.3 Mồi sử dụng cho PCR kiểm tra dòng lúa chỉnh sửa gen 21

Bảng 3.4 Thành phần phản ứng PCR 21

Bảng 4.1 Kết quả tạo vật liệu khởi đầu phục vụ biến nạp vào giống lúa Dongjin 24

Bảng 4.2 Kết quả biến nạp gen vào giống Dongjin 25

Bảng 4.3 Kết quả chọn lọc mô sẹo chuyển gen 26

Bảng 4.4 Kết quả chuyển gen 27

Bảng 4.5 Kết quả đo độ tinh sạch và nồng độ DNA 28

Bảng 4.6 Kết quả phân tích các dòng lúa chỉnh sửa gen bằng PCR 31

Bảng 4.7 Một số chỉ tiêu nông sinh học của các dòng đột biến thế hệ T0 33

Bảng 4.8 Kích thước hạt của các dòng lúa chỉnh sửa gen 36

Bảng 4.9 Kích thước hạt của các dòng lúa chỉnh sửa gen ưu tú 37

DANH MỤC HÌNH

Hình 2.1 Sản lượng lúa ở Việt Nam qua các năm 2011-2020[9] 5

Hình 2.2 Thị trường xuất khẩu gạo Việt Nam [9] 6

Hình 4.1 Kết quả tạo mô sẹo biến nạp gen 25Hình 4.2 Mô sẹo biến nạp gen và chọn lọc trên môi trường

có chứa kháng sinh hygromycin 26Hình 4.3 Tái sinh chồi từ mô sẹo, tạo cây chuyển gen hoàn chỉnh

và trồng trong nhà lưới 27Hình 4.4 Kết quả phân tích sự biểu hiện của gen chọn lọc Hyg

ở các chỉnh sửa gen bằng PCR 30

Hình 4.5 Cây chỉnh sửa gen và trình tự gen GS3 chỉnh sửa bởi gRNA1

ở dòng số 7 và số 11 32Hình 4.6 Biểu đồ thể hiện chiều cao cây và số nhánh của các dòng lúa đột biếnvà đối chứng (wt) 34Hình 4.7 Biểu đồ thể hiện một số yếu tố cấu thành năng suất

của các dòng lúa đột biến và đối chứng (wt) 35

Hình 4.8 Bông lúa ở cây hoang dại và cây chỉnh sửa gen GS3 35Hình 4.9 Biểu đồ thể hiện kích thước hạt của các dòng đột biến

so với đối chứng (wt) 38Hình 4.10 Biểu đồ thể hiện khối lượng 1000 hạt của các dòng lúa đột biến

và đối chứng (wt) 39

Hình 4.11 Kích thước hạt của các dòng lúa chỉnh sửa gen GS3 39

DANH MỤC TỪ VÀ THUẬT NGỮ VIẾT TẮT

2,4D 2,4 Dichlorophenoxyaceti

CTAB Cetyltrimethylammonium Bromide

NAA α- Naphthalenne Acetic Acid

dNTPs Deoxy Nucleoside Triphosphate

EDTA Ethylene Diamine Tetra Acetic acid

MS Murashige và Skoong (1962)

PCR Polymerase Chain Reaction: phản ứng tổng hợp chuỗi

trùng hợpTAE Tris bazơ - Axit acetic – EDTA

T-DNA Tranfer – DNA: DNA chuyển

Ti - plasmid Tumor inducing plasmid

UV Ultraviolet: tia cực tím

Wt wild type: cây hoang dã

GE Genome editing: chỉnh sửa gen

MỞ ĐẦU Phần 1 1.1 Đặt vấn đề

Tính trạng kích thước và số lượng hạt là một trong những yếu tố quyết địnhđến năng suất cây trồng Kích thước hạt giống là mục tiêu của chọn lọc nhân tạotrong quá trình thuần hóa, nơi các hạt có kích thước lớn thường được ưa chuộng do

dễ thu hoạch và tăng cường sức sống của cây Ở lúa, các đặc điểm liên quan đến kíchthước và trọng lượng hạt có tác động lớn đến giá trị thị trường lúa gạo và đóng vaitrò quan trọng trong quá trình nghiên cứu, tạo chọn giống mới

Nghiên cứu tạo cây lúa tăng kích thước hạt được tiến hành ở nhiều nước trênthế giới và mang lại hiệu quả cao trong công tác chọn tạo giống Bằng các kỹ thuậtsinh học phân tử nhiều gen liên quan đến khả năng tăng kích thước hạt đã được sàng

lọc và phân tích trên cây trồng như GW2 , GS9 , GW5 ,GS3 và TGW6 [16-20].

GS3 (Grain size gene) là một gen quy định chiều dài ở hạt có mặt trong các cây

họ lúa GS3 bao gồm bốn vùng chức năng khác nhau tham gia vào quá trình điều

chỉnh kích thước hạt bao gồm: vùng điều chỉnh kích thước cơ quan (ORS), vùngxuyên màng, vùng thụ cảm/ vùng thụ thể yếu tố tăng trưởng (TNFR / NGFR) vàvùng yếu tố von Willebrand loại C (VWFC) Việc mất hoặc ảnh hưởng chức năngcủa miền OSR dẫn đến hạt dài, trong khi việc thay đổi cấu trúc của miền TNFR /NGFR và VWFC tạo ra tác dụng ngược lại [24] Ở nước ta lúa nước là cây lươngthực chính được trồng với diện tích lớn tuy nhiên hiện nay với sự gia tăng dân số,giảm diện tích đất canh tác, ô nhiễm môi trường và thời tiết khắc nghiệt thườngxuyên xảy ra, sản xuất lúa gạo đang phải đối mặt với những thách thức gay gắt ảnhhưởng tiêu cực đến sản xuất và xuất khẩu, trong khi gạo đang là mặt hàng có kimngạch xuất khẩu lớn nhất trong lĩnh vực nông, lâm, thủy sản Trong bối cảnh khí hậutoàn cầu đang biến đổi theo hướng bất lợi như hiện nay, sản xuất nông nghiệp đượcxem là một trong những lĩnh vực dễ bị tổn thương nhất từ đó đặt ra những thách thứckhông nhỏ cho nền nông nghiệp trong tương lai Để phục vụ công tác chọn tạo giốngcây trồng tăng năng suất, chất lượng có khả năng chống chịu với sự biến đổi khí hậu,việc ứng dụng các kỹ thuật hiện đại như công nghệ gen là rất cần thiết Vì vậy, xuất

phát từ nhu cầu thực tiễn chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Nghiên cứu khả năng cải thiện tính trạng hạt thông qua chỉnh sửa gen GS3 bằng công nghệ chỉnh sửa hệ gen CRISPR/Cas9”.

1.2 Mục tiêu của đề tài

1.2.1.Mục tiêu tổng quát

Nghiên cứu khả năng tăng kích thước hạt lúa thông qua chỉnh sửa gen GS3.

1.2.2 Mục tiêu cụ thể

- Nghiên cứu chuyển cấu trúc chỉnh sửa gen GS3 vào giống lúa Dongjin.

- Sàng lọc được cây đột biến thế hệ T0

- Đánh giá một số tính trạng hình thái hạt của cây đột biến thế hệ T0

1.3.Ý nghĩa khoa học và thực tiễn

1.3.1.Ý nghĩa khoa học của đề tài

- Giúp sinh viên củng cố và hệ thống lại những kiến thức đã học

- Giúp sinh viên rèn luyện kỹ năng nghiên cứu khoa học, phương pháp xử lý phân tích số liệu và cách trình bày một bài báo khoa học

- Nghiên cứu chuyển cấu trúc gen Cas9-gRNA1 vào giống lúa Dongjin thông

qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens.

- Chọn lọc gen chuyển bằng kĩ thuật PCR và đánh giá các chỉ tiêu nông học củadòng T0

1.3.2 Ý nghĩa thực tiễn của đề tài

- Nghiên cứu nâng cao năng suất lúa bằng kỹ thuật chỉnh sửa gen CRISPR/Cas9tại trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên

Phần 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Giới thiệu về cây lúa

2.1.1 Vai trò của lúa gạo

Lúa gạo là cây lương thực lâu đời nhất được trồng ở nhiều nơi trên thế giới.Lúa là một trong năm loại cây lương thực chính của thế giới cùng với ngô, lúa mì ,sắn và khoai tây Diện tích gieo trồng của cây lúa đứng thứ hai sau lúa mì, tổng sảnlượng lúa gạo đứng thứ ba sau lúa mì và ngô Lúa gạo là nguồn lương thực quantrọng cho khoảng 2/3 dân số trên thế giới, vì thế lúa gạo đã trở thành loại lương thựcđược con người tiêu thụ và ưa chuộng nhiều nhất Khoảng 40% dân số trên thế giớilấy lúa gạo làm nguồn lương thực chính Trên thế giới có hơn 110 quốc gia có sảnxuất và tiêu thụ gạo với các mức độ khác nhau Lượng lúa được sản xuất ra và mứctiêu thụ gạo cao tập trung ở khu vực Châu Á Hiện nay, diện tích trồng lúa chiếm trên1/10 diện tích đất trồng trên thế giới và có 15 nước trên thế giới trồng lúa với diệntích hơn hơn 1 triệu ha, trong đó có tới 13 nước ở Châu Á Riêng Trung Quốc và ẤnĐộ chiếm khoảng 50% diện tích trồng lúa và 56% sản lượng lúa toàn cầu [4]

Lúa gạo chiếm một vị trí quan trọng trong nền kinh tế quốc dân, không chỉ là nguồnlương thực mà còn là nguồn thu ngoại tệ cho sự phát triển của đất nước Điều này chỉ rõ

vị trí của lúa gạo trong cơ cấu lương thực thế giới và trong đời sống kinh tế quốc tế.Việt Nam là một trong những nước có nghề truyền thống trồng lúa nước cổ xưanhất thế giới với hơn 70% diện tích đất trên cả nước Nông nghiệp trồng lúa vừa đảmbảo an ninh lương thực quốc gia, vừa là cơ sở kinh tế sống còn của đất nước Dân sốnước ta đến nay hơn 90 triệu người, trong đó dân số ở nông thôn chiếm gần 80% vàlực lượng lao động trong nghề trồng lúa chiếm khoảng 70% lực lượng lao động cảnước Điều đó cho thấy lĩnh vực nông nghiệp trồng lúa nước thu hút đại đa số lựclượng lao động cả nước, đóng vai trò quan trọng trong nền kinh tế quốc dân Bêncạnh đó, ưu thế lớn của nghề trồng lúa còn thể hiện rõ ở diện tích canh tác trong tổngdiện tích đất nông nghiệp cũng như tổng diện tích trồng cây lương thực Ngành trồngtrọt chiếm 4/5 diện tích đất canh tác trong khi đó diện tích trồng lúa giữ vị trí độctôn, chiếm gần 85% diện tích lương thực Theo số liệu sơ bộ của Tổng cục Hải quan,tính chung cả năm 2019 cả nước xuất khẩu 6,37 triệu tấn gạo, tương đương 2,81 tỷ

USD, tăng 4,1% về lượng nhưng giảm 8,4% về kim ngạch so với năm 2018 Giá xuấtkhẩu đạt 440,7 USD/tấn, giảm 12,1% Kết quả báo cáo tổng kết 7 tháng đầu năm

2020, Việt Nam xuất khẩu khoảng 3,9 triệu tấn gạo, đạt kim ngạch 1,9 tỉ USD, tăng10,9% về giá trị so với cùng kỳ năm trước [9] Đặc biệt là giá gạo xuất khẩu của ViệtNam tăng cao, vượt Thái Lan, Ấn Độ và Pakistan

2.1.2 Tình hình sản xuất lúa ở Việt Nam năm 2020

Diện tích gieo trồng lúa mùa cả nước năm 2020 đạt 1.584,6 nghìn ha, bằng98,3% vụ mùa năm 2019 Trong đó, các địa phương phía Bắc gieo cấy 1.050,2 nghìn

ha, bằng 98,1%, riêng các tỉnh vùng Đồng bằng sông Hồng gieo cấy đạt 484,4 nghìn

ha, bằng 97,4%; các địa phương phía Nam gieo cấy 534,4 nghìn ha, bằng 98,8%.Quá trình chuyển đổi mục đích sử dụng đất, chuyển đổi cơ cấu sản xuất và do ảnhhưởng bởi các đợt nắng nóng kéo dài, thiếu nước tưới hoặc đất bị nhiễm mặn nêndiện tích gieo cấy lúa mùa 2020 giảm nhiều Một số địa phương có diện tích lúa mùagiảm nhiều là: Ninh Thuận giảm 2,9 nghìn ha; Thanh Hóa giảm 4,7 nghìn ha; Hà Nộigiảm 2,4 nghìn ha; Hải Phòng giảm 2,7 nghìn ha; Hưng Yên giảm 1,9 nghìn ha;…kéo theo sản lượng chung toàn vụ giảm Mặc dù thời tiết đầu vụ không thuận lợinhưng trong quá trình cây lúa sinh trưởng và phát triển, điều kiện thời tiết khá thuậnlợi nên cây lúa đẻ nhánh nhanh và đồng đều, các loại sâu bệnh xuất hiện nhưng đượcphòng trừ kịp thời nên năng suất tăng so với vụ mùa năm trước [8]

Số liệu thống kê này phản ánh trong điều kiện hiện nay, an ninh lương thựcnước ta được giữ vững, không những đảm bảo cho nhu cầu sử dụng trong nước màcòn tham gia đảm bảo an ninh lương thực trên phạm vi toàn cầu

2.1.3 Giá trị kinh tế

Trên thế giới cơ cấu sản xuất lương thực, lúa gạo chiếm 26,5% Sản lượng lúađã vượt lên đứng thứ nhất trong các cây lương thực với tổng sản lượng là 650 triệutấn/năm Mặc dù diện tích trồng lúa gạo đứng sau lúa mì nhưng sản lượng lúa năm

1993 đã đứng vị trí thứ nhất với tổng sản lượng là 573 triệu tấn/năm Đặc biệt trongnhững năm gần đây với sự phát triển của khoa học kỹ thuật trong công tác chọn tạogiống và canh tác, phân bón thì năng suất và chất lượng lúa gạo không ngừng tănglên [4]

Hình 2.1 Sản lượng lúa ở Việt Nam qua các năm 2011-2020 [9].

Năm 2020, mặc dù năng suất và sản lượng giảm so với năm 2019 nhưng dochất lượng gạo được cải thiện nên đã thúc đẩy hoạt động xuất khẩu gạo, giá trị xuấtkhẩu ngày càng được cải thiện, tạo nên sức lan toả mạnh mẽ của “hương vị” gạo ViệtNam trên thị trường hàng nông sản thế giới đưa Việt Nam trở lại vị số một về xuấtkhẩu gạo Lúa không chỉ được mùa ở các mùa vụ mà còn được giá, đánh dấu sựchuyển mình của sản xuất lúa gạo, hiệu quả sản xuất tăng lên đáng kể Trong bốicảnh dịch bệnh Covid-19, hầu hết các mặt hàng nông sản xuất khẩu bị ảnh hưởng,tuy nhiên xuất khẩu gạo của Việt Nam giữ được đà tăng trưởng về sản lượng, quantrọng hơn là giá xuất khẩu đạt mức cao Riêng tháng 8/2020, giá trung bình đạt 502,6USD/tấn, tăng 3,8% so với tháng 7/2020 [2]

Hình 2.2 Thị trường xuất khẩu gạo Việt Nam [9].

Một trong những điểm nhấn đáng lưu ý nhất là mức giá xuất khẩu gạo Việtsang thị trường EU đã chạm tới con số kỷ lục hơn 1.000 USD/tấn sau khi Hiệp địnhthương mại tự do Việt Nam-EU (EVFTA) có hiệu lực Chỉ trong 10 tháng năm 2020,Việt Nam đã xuất khẩu được gần 5,3 triệu tấn gạo (đạt hơn 80% kế hoạch xuất khẩugạo năm 2020 là đạt từ 6,5 đến 6,7 triệu tấn gạo), tương đương với kim ngạch đạt 2,6

tỷ USD, tăng 8,2% so với cùng kỳ năm 2019 Chất lượng gạo cũng được tăng lên,loại gạo 5% tấm của Việt Nam đã có lúc vượt giá gạo Thái Lan, vươn lên dẫn đầuthế giới Trong suốt thời gian dài xuất khẩu lúa gạo, đây là lần đầu tiên giá gạo ViệtNam cao hơn gạo Thái Lan đến 20 USD/tấn

2.1.4 Giá trị dinh dưỡng

Gạo là một loại thực phẩm giàu dinh dưỡng So với lúa mì, gạo có thành phầntinh bột và protein thấp hơn, nhưng năng lượng tạo ra cao hơn do chứa nhiều chấtbéo hơn Ngoài ra, nếu tính trên đơn vị 1 hecta, gạo cung cấp nhiều calo hơn lúa mì

do năng suất lúa cao hơn nhiều so với lúa mì Giả sử một người trung bình cần 3200calo mỗi ngày thì một hecta lúa có thể nuôi 2055 người/ngày hoặc 5,63 người/năm,trong khi lúa mì chỉ nuôi được 3,67 người /năm, bắp 5,3 người/năm Hơn nữa, trong

gạo lại có chứa nhiều acid amin, thiết yếu như: Lysine, Threonine, Methionine,Tryptophan… hơn hẳn lúa mì [11].

Theo Yoshida (1981) [10], tinh bột là thành phần chủ yếu chiếm trên 80%trong hạt gạo, nó được hình thành từ hai đại phân tử là amylose và amylopectin Hàmlượng amylose có thể được coi là tính trạng quan trọng nhất trong phẩm chất cơm vì

nó có tính chất quyết định tới việc cơm dẻo, mềm hay cứng Hàm lượng amylosecàng thấp thì cơm càng mềm Hàm lượng tinh bột trong hạt gạo thường có mối tươngquan nghịch với hàm lượng đạm Nếu hàm lượng đạm trong hạt tăng thì hàm lượngtinh bột trong hạt gạo thường giảm Liều lượng phân bón thích hợp không những làmgiảm hàm lượng đạm mà còn làm tăng hàm lượng tinh bột

Theo IRRI (2013), hàm lượng amylose khác nhau ở các giống lúa, hàm lượngnày càng thấp thì cơm càng mềm dẻo Các giống lúa nếp thường có hàm lượngamylose nhỏ hơn 2%, các giống lúa tẻ thường có hàm lượng amylose cao hơn Cácgiống lúa thuộc nhóm Japonica có hàm lượng amylose thấp hơn các giống thuộcnhóm Indica Hàm lượng amylose cũng tham gia quyết định tới độ bạc của hạt gạo.Những giống có hàm lượng amylopectin cao thường có cấu trúc phân tử khá lỏng lẻo

vì thế đã tạo ra rất nhiều lỗ nhỏ trên bề mặt tinh bột và kết quả là toàn bộ nội nhũ cómàu trắng đục, do đó hàm lượng amylose tỷ lệ nghịch với độ bạc của hạt gạo ự biếnđộng hàm lượng amylose của một số giống lúa dưới tác động của môi trường chỉ daođộng trong khoảng 6% Amylose có cấu tạo mạch thẳng không phân nhánh tạo thành

từ 300 - 1000 gốc glucose nhờ vào liên kết α-(1-4) glucose Amylose phân bố bêntrong hạt tinh bột nên tan trong nước nóng, nhưng độ nhớt không cao, dễ lắng cặn,gây phản ứng tủa với butanol và pentanol, bị nhiệt hóa hồ Ở lúa, amylose có trọnglượng phân tử là 100-200 kDa, chuỗi amylose tạo thành có dạng xoắn lò xo với 6 gốcglucose trên một vòng, mỗi vòng xoắn hấp thụ một phân tử iodine vào bên trong tạothành dung dịch màu xanh, khi đun nóng thì iodine tách ra làm mất màu xanh Người

ta đã dựa vào đặc tính này để xác định hàm lượng amylose có trong tinh bột Mặc dùhàm lượng protein trong gạo chỉ dao động khoảng 7%, nhưng protein trong lúa gạovẫn được coi là protein có phẩm chất cao, do nó có hàm lượng lysine cao Với cácnước coi lúa gạo là thức ăn chính thì hàm lượng protein cao trong lúa gạo là nguồn

bổ sung protein cực kỳ quan trọng Hàm lượng protein trong gạo bị chi phối bởi cácđiều kiện nhiệt độ không khí hoặc nhiệt độ nước trong ruộng cao sau khi lúa trỗ sẽlàm tăng hàm lượng protein và tỷ lệ hạt chắc Qua đó làm tăng năng suất hạt và năngsuất protein trên một đơn vị diện tích Bên cạnh đó, hàm lượng protein cũng có quanhệ chặt chẽ với lượng phân bón đặc biệt là phân đạm Phân đạm có tác dụng tăngcường quá trình tổng hợp protein mà không làm ảnh hưởng đến đặc tính của giống.

2.1.5 Kĩ thuật chuyển gen thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens

Agrobacterium tumefaciens là tác nhân gây ra khối u ở hơn 140 loài thực vật

hai lá mầm thực sự Đây là vi khuẩn dạng que, Gram âm trong đất Triệu chứng bệnhlà do một đoạn DNA nhỏ được chèn vào tế bào cây, gắn vào một vị trí bán bất kìtrong bộ gen [6]

Chuyển gen thông qua A tumefaciens ngày càng được ứng dụng rộng rãi để

chuyển một hay nhiều gen vào cây trồng Tính ưu việt của hệ thống chuyển gen nàylà hiệu quả tạo cây chuyển gen bền vững cao mà không cần đến thiết bị cũng như hệ

thống nuôi cấy phức tạp Trước đây, phương pháp chuyển gen thông qua vi khuẩn A.

tumefaciens không được xem là có hiệu quả với cây một lá mầm Nhưng trong những

năm gần đây có nhiều công trình nghiên cứu báo cáo việc biến nạp gen thành công

vào lúa nhờ vi khuẩn A tumefaciens Hiện nay, phương pháp biến nạp gen vào lúa nhờ vi khuẩn A tumefaciens là phương pháp được lựa chọn sử dụng hơn cả, do số

bản sao của gen biến nạp được chèn vào nhiễm sắc thể của tế bào chủ thấp, bềnvững Đặc biệt, phương pháp này cho hiệu quả chuyển gen cao, khả năng chuyểnđược đoạn DNA có kích thước lớn và chi phí thấp [3], [5]

Agrobacterium có 3 thành phần di truyền cần thiết cho quá trình chuyển gen:

- Vùng T-DNA: là đoạn DNA chuyển từ vi khuẩn Agrobacterium vào tế bào

thực vật Đặc điểm của vùng này là xâm nhập ổn định vào bộ gen của cây chủ, không mãhóa cho các sản phẩm trợ giúp quá trình biến nạp, độ dài thay đổi khác nhau ở

các Ti-plasmid tự nhiên và mang rất nhiều gen có thể biểu hiện trong quá trình chuyển hóa của tế bào thực vật [3], [13]

- Vùng gây độc Vir (Virulence Region): gồm 24 gen vir được sắp xếp trong 8 operon từ virA đến virH, mỗi operon chứa một số gen Vùng Vir có vai trò kích thích

việc biến nạp của T-DNA Trong đó Vir A; B; D; G có ý nghĩa đặc biệt quan trọng trong quá trình biến nạp ở tế bào thực vật, Vir C; E; F; H có tác dụng làm tăng

cường hiệu quả quá trình biến nạp gen [14], [15]

- Nhiễm sắc thể (NST) của Agrobacterium: Vùng Vir có vai trò chủ yếu trong

quá trình biến nạp T- DNA, tuy nhiên NST của vi khuẩn cũng rất cần thiết đối với quátrình này Chúng tác dụng lên bề mặt của tế bào vi khuẩn, cụ thể giúp tạo ra

exopolysaccarid, chế biến và bài tiết ra ngoài (pscA/exoC, chvA, hvB) đồng thời gắn

vi khuẩn vào tế bào thực vật (tt gens) Ầ Ngoài ra những gen khác như mia A đóng

vai trò thứ yếu hơn trong quá trình biến nạp [17]

Cơ chế chuyển gen thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens: Quá trình

chuyển T-DNA được bắt đầu ở vị trắ biên phải và kết thúc ở vị trắ biên trái Nếukhông có sự định hướng này, hiệu quả của quá trình chuyển gen sẽ rất thấp Đoạn T-DNA mang gen muốn được chuyển, trước tiên nó phải được hoạt hóa nhờ hoạt động

của các gen vir Hiện tượng này xảy ra khi Agrobacterium tumefaciens bắt đầu tiếp

xúc với hợp chất chứa phenol được tiết ra từ vết thương của cây hoặc từ tế bào nuôicấy

Khi nhận được các phân tử tắn hiệu từ vết thương thực vật: hợp chất phenolic(cacbolic acid), acetosyringone (AS), hydroxy acetosyringone (OH-AS), flavonoid,đường đơn hoặc các tắn hiệu khác như pH axit (pH 5 - 5,5),phosphat và opine, làm

dẫn dụ Agrobacterium gắn vào thành tế bào thực vật (AS, OH-AS được tinh sạch từ

môi trường nuôi cấy tế bào lúa - giống như những sản phẩm của chuyển hoá phenylpropanoid - một khâu chủ yếu trong chu trình tạo các chất thứ cấp như lignin và cácchất thơm Những chất này rất quan trọng đối với thực vật trong các điều kiện stressvà bị thương, ta gọi là hợp chất dẫn dụ) Trong quá trình tiếp xúc giữa tế bào thực vật

và Agrobacterium, vi khuẩn tạo ra các sợi cellulose và các sợi này kết tụ thành bó

gắn lên bề mặt tế bào thực vật Quá trình này làm cảm ứng và hoạt hoá các gen vùng

vir Sự thể hiện gen vir xảy ra nhờ hệ thống truyền cảm ứng gồm các sản phẩm của virA và virG Chắnh các sản phẩm protein của các gen vir đã làm nhiệm vụ vận

chuyển T-DNA Một số bằng chứng chứng tỏ T-DNA được vận chuyển tới nhân tế

bào thực vật và gắn hoá trị vào genome thực vật, sau đó T-DNA được phiên mã nhờ RNA polymerase II [14], [16].

Quá trình chuyển T-DNA cho tế bào thực vật gồm ba sự kiện quan trọng:

• Sự kiện thứ nhất: Hình thành khối u là quá trình biến đổi tế bào thực vật doxâm nhập và hợp nhất của T-DNA vào tế bào thực vật, sau đó biểu hiện các gen

trong vùng T-DNA

• Sự kiện thứ hai: Các gen nằm trong vùng T-DNA sao chép trong các tế bào bị xâm nhiễm và không có vai trò trong quá trình chuyển

• Sự kiện thứ ba: Vùng DNA lạ đặt giữa các vùng biên của T-DNA có thể được chuyển cho tế bào cây trồng.

2.1.6 Đặc điểm gen GS3

GS3 (Grain size gen) là gen có vị trí nằm trong vùng tâm động của nhiễm sắc thể số

3 ở lúa thường được xác định là một định lượng tính trạng chính cho cả trọng lượng

hạt (tính trạng năng suất) và chiều dài hạt (tính trạng chất lượng) GS3 có kích thước khoảng 5,6kb có 5 vùng exon nhỏ được xen kẽ bởi 4 vùng intron lớn Gen GS3 nằm

ở nhiễm sác thể số 3 trong vùng từ 16,729,501 đến 16,735,109 bp bao gồm bốn vùngchức năng khác nhau tham gia vào quá trình điều chỉnh kích thước hạt bao gồm: vùngđiều chỉnh kích thước cơ quan (ORS), vùng xuyên màng, vùng thụ cảm/ vùng thụ thể yếutố tăng trưởng (TNFR / NGFR) và vùng yếu tố von Willebrand loại C

(VWFC) Việc mất hoặc ảnh hưởng chức năng của miền OSR dẫn đến hạt dài, trongkhi việc thay đổi cấu trúc của miền TNFR / NGFR và VWFC cho thấy tác dụng ứcchế chức năng OSR; đột biến mất chức năng của những vùng này tạo ra hạt rất ngắn

Các nghiên cứu đã chỉ ra ra rằng gen GS3 có thể hoạt động như một bộ điều chỉnh

tiêu cực đối với kích thước hạt, việc nhân bản một gen như vậy đã tạo cơ hội choviệc mô tả đầy đủ các đặc điểm của cơ chế điều hòa và các quá trình liên quan trongquá trình phát triển của hạt [19], [20]

2.2 Tổng quan tình hình trong nước và trên thế giới về chỉnh sửa gen

2.2.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới

Trên thế giới các nghiên cứu về chỉnh sửa gen lúa cải thiện tính trạng năng suấtđã vô cùng phát triển trong những năm trở lại đây do những áp lực về biến đổi khí

hậu và mức độ đô thị hóa Trên thế giới đã có rất nhiều công trình nghiên cứu vềchỉnh sửa gen lúa và đã đạt được nhiều thành công Chỉnh sửa gen lúa không phải làý tưởng hoàn toàn mới Năm 1999, các nhà khoa học đã phát triển Dự án GoldenRice để giải quyết tình trạng thiếu hụt vitamin A dẫn đến mù lòa ở nhiều quốc gia cógạo là lương thực chính Bên cạnh đó, các nghiên cứu về tăng hiệu quả quang hợp,khả năng chịu hạn và giảm khí mê-tan của lúa cũng được thực hiện [29].

Một trong những quốc gia đi đầu trong lĩnh vực cải thiện tính trạng lúa thôngqua chỉnh sửa gen đó là Trung Quốc Một trong những nghiên cứu đầu tiên về côngnghệ chỉnh sửa gen đã phân tích bốn yếu tố điều hòa chính ảnh hưởng đến tính trạngnăng suất trên lúa, thông qua loại bỏ hoàn toàn chức năng gen nhờ CRISPR/Cas9.Kết quả của nghiên cứu đã đưa ra một số đặc tính giúp cải thiện giống, như tăng sốlượng hạt, độ cứng của thân cũng như tăng kích thước hạt Một nỗ lực khác đã đượcghi nhận trong việc loại bỏ chức năng của 8 gen quy định tính trạng năng suất trênlúa bằng kỹ thuật chuyển gen đa mục tiêu thông qua CRISPR/ Cas9 đã thu được cáckiểu hình khác nhau tương ứng với đơn và đa đột biến khi tiến hành thử nghiệm trênđồng ruộng [22] Trong một nghiên cứu khác, các nhà khoa học đã chỉnh sửa 4 gen ởlúa lai và thu được những cây có thể nhân giống vô tính thông qua hạt [23] Điều này

có thể giúp tăng năng suất lúa lai và thay đổi mô hình nhân giống cây trồng và ngànhcông nghiệp hạt giống trong tương lai, theo một nhà nghiên cứu từ Viện Thông tinNông nghiệp thuộc Học viện Khoa học Nông nghiệp Trung Quốc

Công ty Agrisea ở New Zealand đã và đang tiến hành nghiên cứu và thực hiện

mô hình sản xuất giống lúa chịu mặn và xây dựng các nông trại nổi trên mặt biển vàonăm 2021 với mô hình thí điểm xuất hiện vào cuối năm 2020 Qua phương phápchỉnh sửa gen tăng cường khả năng chịu mặn của lúa, họ muốn trồng loại cây nàytrên đại dương Lúa chịu mặn có thể sống trong nước biển mà không cần đất, phânbón hoặc nước ngọt Thay vì cấy ghép gen từ các loài khác, các nhà khoa học tạiAgrisea đã xác định phần gen kiểm soát mức độ chịu mặn, phần gen bảo vệ DNA vàtăng cường khả năng của các gen đó

Bên cạnh đó còn rất nhiều công trình nghiên cứu khác về chỉnh sửa gen lúabằng kĩ thuật CRISPR/Cas9 như:

Cải tiến tăng năng suất và khả năng chịu lạnh ở lúa bằng kĩ thuật chỉnh sửa ba

gen, OsPIN5b, GS3, OsMYB30 với hệ thống CRISPR/Cas9 “Rational Improvement

of Rice Yield and Cold Tolerance by Editing the Three Genes OsPIN5b, GS3, and

OsMYB30 With the CRISPR-Cas9 System” Zeng và cộng sự (2020)” Nhóm nghiên

cứu đã báo cáo một giống lúa đột biến mới có năng suất cao và khả năng chịu lạnh

tốt được tạo ra bằng cách chỉnh sửa đồng thời 3 gen, OsPIN5b (gen chiều dài bông),

GS3 (gen kích thước hạt) và OsMYB30 (gen chịu lạnh) với kĩ thuật CRISPR/Cas9.

Kết quả cho thấy thế hệ T 2 của đột biến này cho năng suất cao hơn và khả năng chịurét tốt hơn so với kiểu hoang dã Kết quả này đã chứng minh rằng các giống lúa mớivới năng suất được cải thiện và khả năng chống chịu stress phi sinh học có thể đượctạo ra thông qua các kỹ thuật chỉnh sửa gen và có thể được áp dụng để tạo giống lúa.Ngoài ra, nghiên cứu này đã chứng minh rằng các đặc điểm nông học toàn diện củacây lúa có thể được cải thiện với hệ thống CRISPR/Cas9 [25]

Cải thiện khả năng chống chịu mặn của lúa thông qua chỉnh sửa gen OsRR22

bằng kĩ thuật CRISPR-Cas9 “Enhanced rice salinity toleranc via

CRISPR/Cas9-targeted mutagenesis of the OsRR22 gene”, Zhang và cộng sự (2019) Độ mặn là một

trong những căng thẳng phi sinh học quan trọng nhất ảnh hưởng đến sản xuất lúa gạothế giới Việc trồng các giống cây trồng chịu mặn là cách tiếp cận hiệu quả nhất vềchi phí và thân thiện với môi trường để kiểm soát độ mặn Trong nghiên cứu này đãbáo cáo sự cải thiện khả năng chịu mặn của lúa bằng kỹ thuật đưa một vector biểu

hiện Cas9-OsRR22-gRNA, nhắm mục tiêu vào gen OsRR22 trên cây lúa Hai dòng

đột biến đồng hợp tử T2 được kiểm tra thêm về khả năng chịu mặn và các đặc điểmnông học Kết quả cho thấy, ở giai đoạn cây con, khả năng chịu mặn của các dòngđột biến đồng hợp tử T2 được nâng cao rõ rệt so với cây dại Hơn nữa, không tìmthấy các đặc điểm nông học khác biệt có ý nghĩa giữa các dòng đột biến đồng hợp tử

T2 và các cây dại Kết quả của nghiên cứu này cho thấy CRISPR/Cas9 là một cáchtiếp cận hữu ích để nâng cao khả năng chịu mặn của lúa [26]

Butt và cộng sự đã gây đột biến và sửa chữa gen ALS bằng công cụ GE thông qua

trung gian cgRNA để tạo ra cây lúa kháng thuốc diệt cỏ bispyribac natri (BS)

Locus ALS ở Oryza sativa L.ssp japonicacv Nipponbare (LOC_Os02g30630) đã

được chỉnh sửa bởi hệ thống cgRNA/Cas9 thông qua con đường HDR Quá trìnhchỉnh sửa này đã tạo ra sự thay đổi từ Tryptophan (TGG) thành Leucine (TTG) tạiamino acid 548 (W548L) và thay đổi từ Serine (AGT) thành Isoleucine (ATT) tạiamino acid 627 (S627I), với tỷ lệ sửa chữa cao (16,88% HDR) Nghiên cứu đã chỉ rarằng, chỉ cần một đột biến đơn W548L cũng đủ để dẫn đến tính kháng thuốc diệt cỏ

BS [7] Việc tạo ra dòng lúa kháng thuốc diệt cỏ nhanh chóng và hiệu quả ở nghiêncứu này còn cho thấy tiềm năng ứng dụng của hệ thống cgRNA/Cas9 trong chỉnh sửagen ở các loài cây trồng khác [27], [28]

Lúa gạo được xem là cây mô hình một lá mầm quan trọng cho các nghiên cứu chứcnăng gen Trong những năm trở lại đây, lúa gạo là đối tượng được chỉnh sửa gennhiều nhất, với tổng số 109 gen, trong đó chủ yếu là gen liên quan đến các đặc tính

năng suất (AAP3, GS3, DEP1, GW2, PYL1, PYL4, PYL6 và Gn1a) và chống chịu (như ALS và ARM1).

2.2.2 Tình hình nghiên cứu trong nước

Tại Việt Nam luôn chú trọng đến cây lúa và coi nghề trồng lúa nước là mộttrong những trọng tâm phát triển nền kinh tế nước nhà Trước tình hình biến đổi khíhậu thất thường và tình trạng hạn hán ở miền Trung, tình hình ngập mặn ở khu vựcĐồng bằng sông Cửu Long các ứng dụng công nghệ sinh học về chọn tạo giống đãphát triển nhằm đảm bảo an ninh lương thực và góp phần thúc đẩy ngành sản xuấtlúa gạo phát triển

Đến năm 2020, công nghệ sinh học đã đưa ra một loạt công cụ hiệu quả chochọn tạo giống lúa, như: Tiến hành thu thập, đánh giá, giải mã gen tập đoàn lúa bảnđịa Việt Nam với trên 600 giống, đại diện cho các đặc tính quý như năng suất cao,chất lượng phù hợp, thơm, chống chịu hạn, mặn, lạnh, kháng một số sâu, bệnh hạiquan trọng… Ứng dụng các phương pháp MAS và MABC chọn tạo, cải tiến một sốtính trạng của giống phổ biến trong sản xuất như BC15 kháng đạo ôn, Bắc thơm 7

kháng bạc lá, Bắc thơm 7 chịu mặn, Bắc thơm 7 chịu ngập, OM429 chịu mặn [7].

Ứng dụng công nghệ chỉnh sửa gen đã tạo được 66 dòng lúa TBR225 thế hệT0; 19 dòng lúa Bắc thơm 7 thế hệ T1 đã được chỉnh sửa gen mẫn cảm với bệnh bạc

lá ở dạng đồng hợp và không mang cấu trúc DNA ngoại lai trong hệ gen Ứng dụngcông nghệ tương tác trên toàn hệ gen (GWAS) xác định được 17 QTLs kiểm soát cáctính trạng chịu hạn, 13 QTLs kiểm soát tính trạng sinh trưởng, phát triển bộ lá và 29QTLs mới liên quan đến cấu trúc bông Đã chọn, tạo được khoảng 160 giống lúa tẻthuần, 50 giống lúa ưu thế lai Một số giống lúa thuần chiếm tỷ trọng rất lớn như:Giống OM5451 trên 670 ngàn ha, OM6976 trên 540 ngàn ha, OM4900 trên 497 ngàn

ha, Khang dân 18 trên 404 ngàn ha, BC15 trên 268 ngàn ha, Jasmin 85 trên 251 ngànha…; lúa lai như Nhị ưu 838, Thái xuyên 111, HYT 116… Các giống lúa mới chọntạo này có năng suất cao hơn khoảng 5-10% so với giống lúa cũ, từ đó tăng hiệu quảkinh tế cho người sản xuất [2]

Phần 3 ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Đối tượng nghiên cứu và phạm vi nghiên cứu

3.1.1 Đối tượng nghiên cứu

- Giống lúa: Giống lúa Dongjin (japonica) do Tổng Công ty giống cây trồng Thái Bình cung cấp

- Cấu trúc vector: pHAtC::AtU6::gRNA1 chỉnh sửa gen mục tiêu GS3 được

cung cấp bởi khoa CNSH&CNTP

Vi khuẩn : chủng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens LBA4404 được mua từ hãng

Thermo Fisher Scientific (Mỹ)

3.1.2 Hóa chất thực hành

- Hóa chất sử dụng trong các môi trường nuôi cấy: agar môi trường Aldrich, Đức), D-glucose (Bio Basic Canada Inc., Canada), phytagel môitrường (Sigma-Aldrich, Đức), L-proline (Merck KgaA, Đức), Casein(Himedia, Ấn Độ)

(Sigma Hóa chất sử dụng trong tách chiết DNA tổng số: ethanol, 2-propanol (Merck,Đức), kali axetat (Bio Bascic Canada Inc., Canada), Natri Clorua (Himedia, Ấn Độ),EDTA 1 mM; NaCl 250 mM; Tris-HCl 200 mM

- Hóa chất dùng trong phản ứng PCR: GoTaq Master Mix, thang chuẩn 1 kb (Thermo Fisher Scientific, USA)

- Hoá chất khử trùng: cồn 70°, nước Javen 1%

- Một số chất kháng sinh chọn lọc như: ticarcillin, cefotaxim, spectinomycin, rifampicin, hygromycin

- Môi trường được sử dụng trong nghiên cứu nuôi cấy vi khuẩn dùng cho thí nghiệm chuyển gen gồm:

+ Môi trường nuôi khuẩn LB đặc

+ Môi trường nuôi khuẩn LB lỏng

- Môi trường sử dụng trong nghiên cứu nuôi cấy lúa chuyển gen:

Bảng 3.1 Thành phần môi trường nuôi cấy lúa chuyển gen

Môi trường tạo mô sẹo 2N6 + 1 mg/ml 2,4-D,+0,5 g/l L-proline, 1,0 g/l

casamino, 4,0g sigma N6 salts, 10 ml N6 vitamins2N6

100x, 30 g/l sucrose, 4 g/l phytagel (pH 5.8)

N6-AS: muối N6 + 1 mg/l 2,4D + 1,0 g/lMôi trường đồng biến nạp casamino + 4,0g sigma N6 salts + 10 ml N62N6-AS vitamins 100x + 10 g/l glucose + 30 g/l Sucrose,

3,5g/l phytagel (pH 5.2)N6 + 1 mg/l 2,4D + 1,0 g/l casamino + 0,5 g/l L-

Môi trường chọn lọc proline + 4,0g Sigma N6 salts + 10ml N6 vitamins

100x + 3,5 g/l phytagel + ticarcillin 250mg/l +TCH-1

cefotaxime 250mg/l + 50 mg/ml Hygromycine(pH 5.2)

N6 + 1 mg/l 2,4D + 1,0 g/l casamino + 0,5 g/l

L-Môi trường chọn lọc proline + 4,0g Sigma N6 salts + 10ml N6 vitamins

100x + 3,5 g/l phytagel + ticarcillin 250mg/l +TCH-2

cefotaxime 250mg/l + 25 mg/l Hygromycine (pH5.2)

N6 + 1 mg/ml BAP + 1 mg/l NAA + 2 g/l caseinMôi trường tiền tái sinh + 0,5 g/l L-proline + 30 g/l Sucrose + 6 g/lRGH6 phytagel + 4g sigma N6 salts + N6 vitamins

100x+ 50 mg/l Hygromycine (pH 5.8)

MS + 10 g/l Sucrose + MS Macro 10x + MSMôi trường tái sinh 1/2 Micro 1000x + Fe2EDTA Iron 100x + N6

MS-H vitamins 100x + 2,5 g/l phytagel + 50 mg/l

Hygromycine (pH 5.8)

3.1.3 Thiết bị dụng cụ thực hành

Bảng 3.2 Thiết bị, dụng cụ nghiên cứu

Cùng các trang thiết bị, dụng cụ khác phục vụ nghiên cứu của Phòng Thí nghiệm Khoa Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm

3.2 Địa điểm và thời gian tiến hành thí nghiệm

- Địa điểm: phòng thí nghiệm Khoa Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm Trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên

- Thời gian tiến hành: từ 1/2020 - 6/2021

3.3 Nội dung nghiên cứu

Nội dung nghiên cứu dự kiến như sau:

- Nội dung 1: Nghiên cứu chuyển cấu trúc pHAtC::AtU6::gRNA1 vào giống lúa Dongjin

- Nội dung 2: Chọn lọc dòng đột biến bằng kĩ thuật PCR

- Nội dung 3: Đánh giá một số đặc điểm hình thái các cây chỉnh sửa gen T0

3.4 Phương pháp nghiên cứu

3.4.1 Phương pháp bố trí thí nghiệm

- Điều kiện thí nghiệm: Các thí nghiệm được thực hiện tại phòng Công nghệsinh học thực vật (Khoa CNSH & CNTP) trong điều kiện nhiệt độ phòng (25ºC ± 2, độẩm 60 - 65%, thời gian chiếu sáng 16h/ngày, cường độ chiếu sáng

2000 – 2500 lux

3.4.2 Phương pháp nghiên cứu chuyển cấu trúc pHAtC::AtU6::gRNA1 vào

giống lúa Dongjin

a Khử trùng hạt và tạo mô sẹo

Mẫu hạt lúa chín được sử dụng làm vật liệu tạo mô sẹo Tiến hành bóc bỏ vỏ

trấu của hạt Hạt lúa bóc vỏ được xử lý bằng cách rửa nước cất 2 lần, ngâm và lắc

nhẹ trong cồn 70% trong 1 phút, sau đó rửa bằng nước cất khử trùng 1-2 lần Mẫu

hạt tiếp tục được khử trùng bằng NaClO 1% Sau đó, rửa lại mẫu 5-6 lần bằng nước

cất khử trùng Hạt gạo sau khi khử trùng được thấm khô bằng giấy thấm khử trùng

và đặt trên môi trường 2N6 với mật độ 30 hạt/đĩa

- Cảm ứng mô sẹo từ phôi hạt lúa

Hạt lúa sau khi khử trùng, thấm khô và đặt lên môi trường tạo mô sẹo 2N6

(Murashige và Skoog, 1962) bổ sung 1 mg/l 2,4-D + 1 mg/ml 2,4-D,+0,5 g/l

L-proline, 1,0 g/l casamino, 4,0g sigma N6 salts, 10 ml N6 vitamins 100x, 30 g/l

sucrose, 4 g/l phytagel (pH 5.8) Mẫu được nuôi trong điều kiện ở 28oC Sau 5-7

ngày chọn những mô sẹo vàng nhạt, rắn chắc, có hình cầu để làm vật liệu chuyển

gen Chỉ tiêu theo dõi:

∑ Mô sẹo tạo thành

b Tạo dịch huyền phù vi khuẩn Agrobacterium

- Lấy chủng khuẩn từ ống giữ chủng và cấy vạch lên môi trường LB đặc có

bổ sung các kháng sinh chọn lọc rifamicin 100mg/l, spectinomycin 100mg/l đối với

chủng Agrobacterium tumefaciens mang vector chuyển gen nuôi trong tủ ổn nhiệt 28ºC

trong thời gian 72 giờ

- Lấy khuẩn lạc phát triển tốt trên đĩa khuẩn và cho vào 20ml AAM lỏng có

bổ sung 20uM Acetosyringone Ống đựng dịch khuẩn được đặt trong máy lắc với tốc độ

200 vòng/phút ở nhiệt độ 28ºC trong 30- 60 phút Dịch khuẩn thu được có OD600nm =

0,07 là đủ điều kiện để biến nạp

c Nhiễm khuẩn và đồng nuôi cấy

Ngâm khoảng 20 mẫu callus trong ống fancon chứa 15ml dung dịch AAM +

AS có bổ sung 5ml dịch khuẩn Agrobacterium Các mẫu callus được ngâm trong

dung dịch trên rồi lắc nhẹ trong ṿòng 3-5 phút Sau khi lây nhiễm với vi khuẩn, mẫu

lây nhiễm được chuyển sang môi trường đồng nuôi cấy 2N6-AS: N6, 30g/l sucrose,10g/l glucose , 1g/l casamino acids, 10g/l sigma N6 salts, 3,5g/l phytagel, 1ml/lAcetosyringone, 2,4D 1mg/l, ticarcillin 250mg/l, cefotaxime 250mg/l, pH = 5,2 ,nuôi trong 3 ngày ở điều kiện 28oC.

d Tái sinh và chọn lọc cây chuyển gen

Sau 3 ngày mẫu lây nhiễm sau đó được rửa sạch bằng nước cất vô trùng 5-7lần sau đó được rửa tiếp 2 lần với nước cất vô trùng bổ sung kháng sinh ticarcillin(250mg/l); cefotaxime (250mg/l) và được tráng lại bằng nước 5-7 lần Mẫu đượcthấm khô và cấy lên môi trường chọn lọc 2N6-TCHI chứa N6, 30g/l gsucrose, 1g/lcasamino acids, 4g/l sigma N6 salts, 10ml/l N6 vitamins 100x, 2,4D 1mg/l, 3,5g/lphytagel, pH=5,2,và có chứa các kháng sinh 250mg/l ticarcillin, 250mg/l cefotaxime,

10 mg/l hygromycin, pH = 5,2 , nuôi ở phòng nuôi ở điều kiện 28oC Sau 14 ngày chuyển sang môi trường chọn lọc lần 2 N6-TCHII

e Tạo rễ và cây hoàn chỉnh

Khi xuất hiện các chồi và các chồi đạt chiều cao khoảng 5-7 cm tiến hành táchcác chồi nhỏ này và chuyển sang môi trường ra rễ RGH6 (N6+1mg/l NAA, 1mg/lBAP, 30g/l glucose, 6g/l agar, pH 5,2)

Sau 3 tuần các cây invitro được đưa ra ngoài môi trường Cây non được chuyển

sang môi trường đất+ trấu (50% trấu, 50% đất) và chuyển ra trồng trong nhà lưới

3.4.3 Phương pháp nghiên cứu chọn lọc dòng đột biến bằng kĩ thuật PCR

Chồi cây chuyển gen được chọn lọc trên môi trường 2N6 có kháng sinh chọnlọc hygromycin Cây kháng hygromycin được chuyển trồng ra đất và đánh giá sự có

mặt của gen GS3 bằng kĩ thuật PCR.

a) Tách chiết DNA

DNA tổng số từ lá lúa được tách chiết và sử dụng làm khuôn mẫu cho phảnứng PCR với cặp mồi đặc hiệu nhằm xác định sự có mặt của gen chuyển trong cácdòng lúa Sản phẩm PCR được điện di kiểm tra trên gel agarose 1% Tách chiết DNA

từ lá lúa được tiến hành theo các bước sau:

Bước 1: Cắt nhỏ 0,2g mẫu lá cho vào ống ống eppendofl 2ml đem nghiền bằng

máy nghiền bi 270 vòng/giây ống eppendofl 2ml

Bước 2: Bổ sung 800µl dung dịch đệm CTAB vào từng ống, trộn đều bằng

cách đảo nhẹ Ủ ở 65oC trong 30 phút

Bước 3: Cho mỗi ống thêm 700µl Chloform: Iso Amyl Alcohol (24: 1) và dùng

tay lắc ống để trộn đều Sau khi trộn, li tâm ở tốc độ 13000 vòng/phút trong 15 phút.Chuyển pha nước trên (chứa DNA) vào một ống eppendofl sạch

Bước 4: Bổ sung 600µl isopropanol vào từng ống, trộn đều Để ở -20oCtrong30-60 phút

Bước 5: Ly tâm 13000 vòng/phút trong 15 phút, loại bỏ dịch nổi, thu tủa.

Bước 6: Bổ sung tiếp 1000μl cồn 70%, ly tâm tốc độ 13000 vòng/phút trong 5l cồn 70%, ly tâm tốc độ 13000 vòng/phút trong 5

phút, thu tủa Lặp lại bước này 2 lần (cồn 70% để rửa các cặn bẩn kết tủa cùng DNA,tuy nhiên sau đó phải làm khô thật kỹ để hoàn toàn loại bỏ lượng cồn còn sót lại, nếukhông cồn sót lại sẽ làm ức chế quá trình chạy PCR về sau)

Bước 7: Làm khô cặn DNA ở nhiệt độ phòng.

Bước 8: Hòa tan DNA trong 100µl H2O deion hoặc dd TE, bảo quản mẫu ở

-20oC b) PCR kiểm tra sự có mặt cấu trúc biểu hiện gen chuyển

Việc đánh giá các cây chuyển gen là việc làm cần thiết, qua đó bước đầu kiểmtra được sự có mặt của gen đích trong sản phẩm cây chuyển gen Hiện nay PCR là

một kỹ thuật tốt để thực hiện điều này.

Về nguyên tắc PCR là quá trình khuếch đại đoạn gen đích lên nhiều lần nhờ sựbắt cặp bổ sung giữa mồi và trình tự DNA khuôn, khi có sự tham gia của enzymeTaq polymezase, dNTP và một số thành phần khác

Để kiểm tra sự tồn tại của cấu trúc biểu hiện gen chuyển trong các dòng lúa,

DNA tổng số được tách từ lá lúa non và PCR nhân bản đoạn gen Cas9 sử dụng cặp

mồi pCas9–Rv/pCas9–Fw và gen kháng Hygromyxin sử dụng cặp mồi Hyg–Fw/Hyg–Rv (Bảng 2) Các thành phần PCR được thể hiện trong Bảng 3.4 với chutrình nhiệt biến tính 1 94oC, 2 phút; biến tính 2 94oC, 30 giây; gắn mối 56oC, 30

giây; kéo dài 72oC, 30 giây; kéo dài 72oC, 1 phút; kết thúc 4oC Sản phẩm đượckhuếch đại trong 40 chu kỳ

Sản phẩm PCR được điện di kiểm tra trên gel agarose 1%, nhuộm với ethidiumbromide rồi quan sát băng dưới UV

Bảng 3.3 Mồi sử dụng cho PCR kiểm tra dòng lúa chỉnh sửa gen

phẩm

Hyg–Rv TTC AGC TTC GAT GTA GGA GG

dòng mang gen đột biến.

Các đoạn DNA có khối lượng và điện tích khác nhau được tách ra khi dichuyển từ cực âm sang cực dương trong cùng điện trường có điện thế và cường độthích hợp.

 Cách tiến hành

- Cân 0,4g agarose pha trong 40ml dung dịch đệm TAE 1X

- Đun nóng dung dịch trong lò vi sóng từ 1-2 phút cho đến khi agarose tan hoàn toàn sau đó để nguội khoảng 50oC

- Đặt khay đổ gel trên bề mặt phẳng, lắp khay điện di vào khay đổ gel

- Tiến hành đổ phần gel từ từ, liên tục để tránh lẫn bọt, cắm lược và để yêncho gel đông lại

- Khi gel đã đông, cẩn thận nhấc thanh chắn và đặt gel vào bể điện di theođúng chiều (-) đến (+), đổ dung dịch đệm TAE 1X ngập bản gel rồi nhấc lược ra khỏibản gel

- Gắn bể điện di với bộ nguồn, trộn mẫu với Loading Dye và tra mẫu vào giếng Lưu ý, tra nhẹ nhàng, tránh làm vỡ giếng gel

- Đậy nắp máy điện di, cắm điện, bật công tắc máy điện di Điện di với dòngđiện 110V trong thời gian 20 phút

- Khi máy đã chạy hết thời gian cài đặt hoặc quan sát độ di chuyển của thuốc nhuộm trên gel để dừng quá trình điện di, tắt công tắc nguồn

- Mở nắp buồng điện di, lấy bản gel ra và ngâm trong dung dịch EtBr khoảng

5 phút

- Lấy bản gel ra đem tráng nhẹ trong nước (tránh nước xả trực tiếp vào bản gel) rồi đưa lên máy soi UV quan sát và chụp ảnh