Kết quả nghiên cứu chuyển cấu trúc CRISPR/Cas9 GS- 123docz.net

lúa Dongjin

4.1.1. Chuyển gen CRISPR/Cas9 có chứa các trình tự định hướng trên cây lúa Dongjin thông qua vi khuẩn Agrobacterium

Chuyển gen tăng kắch thước hạt GS3 vào giống lúa Dongjin thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens là bước đầu tiên và quan trọng trong toàn bộ quá trình tạo ra cây chuyển gen. Mô sẹo lúa 5 ngày tuổi được sử dụng làm vật liệu chuyển gen. Chọn mô sẹo phát triển tốt có kắch thước khoảng 2 - 3mm, sau đó cho lây nhiễm với vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens mang cấu trúc vector pHAtC::AtU6::gRNA1 (hình 4.1).

Bảng 4.1. Kết quả tạo vật liệu khởi đầu phục vụ biến nạp vào giống lúa Dongjin Số thắ nghiệm 1 2 3 4 5 Tổng

Thắ nghiệm tiến hành tạo được 2500 vật liệu khởi đầu cho chuyển gen với tỷ lệ mẫu không nhiễm đạt 94,1%, mẫu đạt tiêu chuẩn biến nạp đạt 90,8% (Bảng 4.1). Các mẫu này được sử dụng để lây nhiễm với vi khuẩn mang cấu trúc vector pHAtC::AtU6::gRNA1.

Bảng 4.2. Kết quả biến nạp gen vào giống Dongjin Số biến nạp 1 2 3 4 5 Tổng cộng

Hình 4.1. Kết quả tạo mô sẹo biến nạp gen.

A: Mẫu trên môi trường tạo mô sẹo 2N6; B: mẫu sau 5 ngày kắch thắch tạo mô sẹo;

C: Mẫu nuôi trên môi trường đồng nuôi cấy 2N6-AS sau khi biến nạp.

4.1.2. Tái sinh và chọn lọc các dòng lúa chuyển gen T0

Sau 2 lần chọn lọc những chồi mang gen có sức sống tốt được chuyển sang môi trường tái sinh và môi trường ra rễ trước khi được đưa ra trồng trong nhà lưới. Trong thắ nghiệm này chúng tôi tiến hành chọn lọc những mẫu sống sót sau biến nạp trên môi trường chọn lọc kháng sinh hygromycin. Thắ nghiệm chuyển gen được thực hiện 5 lần. Kết quả được thống kê ở bảng 4.3 như sau:

Bảng 4.3. Kết quả chọn lọc mô sẹo chuyển gen Số biến nạp 1 2 3 4 5 Tổng cộng

Hình 4.2 Mô sẹo trên môi trường chọn lọc có chứa kháng sinh hygromycin.

A: Mẫu mô sẹo trên môi trường chọn lọc TCHI; B: mẫu mô sẹo trên môi trường chọn lọc

Bảng 4.4. Kết quả chuyển gen

Số biến nạp

Tổng cộng

Qua kết quả ở bảng 4.4 ta thấy, sau 5 lần thắ nghiệm chuyển gen cấu trúc Cas9- gRNA1 vào 1100 mẫu mô sẹo thu được 229 mẫu sống tốt trên môi trường chọn lọc sau 4 tuần và có 73 chồi và cụm chồi được chuyển sang môi trường tái sinh và thu được kết quả 27 cây hoàn chỉnh. Ngược lại những mẫu chuyển không mang gen cấy lên môi trường chọn lọc có hygromycin mẫu bị chết và không có khả năng tái sinh. Điều này cho thấy các dòng lúa tái sinh và ra rễ trên môi trường chọn lọc là các dòng mang gen. Khi chiều cao chổi đạt khoảng 5-7cm, cấy chuyển sang môi trường ra rễ tạo thành cây hoàn chỉnh kết quả thu được tất cả là 27 cây tạo thành. Các cây ra rễ, khỏe mạnh sau 2-3 tuần được đưa ra bầu trấu đất và ra nhà lưới.

Chứng tỏ bước đầu tiến hành biến nạp chuyển gen đã có sự thành công.

Hình 4.3. Tái sinh chồi từ mô sẹo, tạo cây chuyển gen hoàn chỉnh và trồng trong nhà lưới.

4.2. Kết quả nghiên cứu chọn lọc dòng đột biến bằng kĩ thuật PCR

Trong nghiên cứu này chúng tôi tiến hành thắ nghiệm sàng lọc cây chuyển gen bằng kĩ thuật PCR. Sau khi đưa cây ra trồng trong nhà lưới 4 tuần chúng tôi tiến hành thu lá non của từng dòng tách DNA tổng số và phân tắch bằng kĩ thuật PCR, kết quả được điện di trên gel agrose 1%.

4.2.1. Kết quả tách chiết DNA tổng số

Để kiểm tra sự có mặt của vevtor mang cấu trúc gen pHAtC::AtU6::gRNA1 chúng tôi tiến hành tách DNA tổng số của 27 cây lúa mang gen đã được đưa ra nhà lưới và tiến hành nhân gen bằng phản ứng PCR. PCR cho phép nhân bản một số lượng lớn nguyên bản một đoạn DNA trong một thời gian ngắn. Đây là phương pháp thường được dùng trong phân tắch dòng cây chuyển gen vì độ chắnh xác và độ tin cậy cao. Về lý thuyết nếu như ta cung cấp một cặp mồi đặc hiệu thì sẽ nhân chắnh xác đoạn gen nằm giữa hai mồi đó. Khi tiến hành PCR trên DNA tách từ cây đã được chuyển gen, nếu cho kết quả đặc hiệu với cặp mồi đó thì ta có thể kết luận rằng cây đó đã mang đoạn gen cần chuyển.

Trong quá trình làm thắ nghiệm chúng tôi đã tạo ra được 27 cây chuyển gen ra đến bầu đất. Sau khi cây được đưa ra nhà lưới được 4 tuần chúng tôi tiến hành thu mẫu lá non để phân tắch, kiểm tra sự có mặt và hoạt động của gen chuyển GS3.

Kết quả tách chiết DNA tổng số: sau khi tiến hành tách chiết DNA tổng số theo phương pháp của Doyle và cộng sự. Chúng tôi tiến hành đo OD để kiểm tra chất lượng DNA. Kết quả đo OD của 27 mẫu lá lấy từ cây chuyển gen như sau:

Bảng 4.5. Kết quả đo độ tinh sạch và nồng độ DNA Dòng D1 D2 D3 D4 D5 D6 D7

Dòng D8 D9 D10 D11 D12 D13 D14

Theo kết quả bảng 4.5 trong số 27 mẫu lá đã tách DNA tổng số cho thấy đa số các mẫu có độ tinh sạch tương đối cao do DNA có độ hấp thụ cực đại ở bước sóng 260nm nên tỉ số D260/A280 nằm trong khoảng 1,8-2 thể hiện các mẫu ắt nhiễm tạp chất. Tuy nhiên một số mẫu có độ tinh sạch thấp có thể do nồng độ RNA cao hoặc dư hóa chất hữu cơ trong quá trình tách DNA như mẫu D11, D18, D27, D28, D31, điều này có thể ảnh hưởng tới quá trình chạy PCR.

4.2.2. Kết quả sàng lọc cây chuyển gen bằng PCR

4.2.2.1 Kết quả chọn lọc chuyển gen bằng PCR

Các dòng lúa chuyển gen được kiểm tra gen kháng kháng sinh hygromycin B thông qua đánh giá sự biểu hiện của gen Hyg. Một phần gen kháng kháng sinh Hygromycin B được nhân bản bằng cặp mồi HygỜFw/HygỜRv cho sản phẩm PCR với kắch thước tắnh toán trên lý thuyết 783 bp.

Hình 4.4. Kết quả phân tắch sự biểu hiện của gen chọn lọc Hyg ở các dòng chỉnh sửa gen bằng PCR.

Mẫu lúa chỉnh sửa gen GS3 được kiểm tra PCR với mồi Hyg-Fw/Hyg-Rv, sản phẩm được điện di trên gel agarose 1%. (-) đối chứng âm: (+) đối chứng dương: plasmid; Marker 1 kb (M); D1-D14: DNA của 14 dòng lúa chuyển gen.

Kết quả điện di ở Hình 4.4 cho thấy đối chứng âm (H2O) không có sản phẩm PCR. Các mẫu lúa chỉnh sửa gen tái sinh (từ D1-D31) đều cho 1 băng đặc hiệu rõ ràng với kắch thước ~783 kb, đúng với dự đoán theo lý thuyết so với là băng sản phẩn PCR ở mẫu đối chứng dương khoảng 800bp (Hình 4.4). Trong số các mẫu kiểm tra, dòng số D12 không xuất hiện băng tương ứng với kắch thước gen Hyg. Điều này chứng tỏ rằng dòng D12 không phải dòng chuyển gen. Các dòng còn lại đều có mặt trình tự mã hóa Hygromycin phosphotransferase. Cùng với kết quả chọn lọc mẫu tái sinh và cây chuyển gen bằng hygromycin.

Kết quả phân tắch PCR ở 27 dòng chỉnh sửa gen bước đầu chúng tôi thu được 26/27 (96,29%) dòng dương tắnh với gen Hyg. Các dòng dương tắch sẽ được theo dõi khả năng sinh trưởng và đánh giá đặc tắnh nông sinh học của cây.

Bảng 4.6. Kết quả phân tắch các dòng lúa chỉnh sửa gen bằng PCR Dòng D1 D2 D3 D4 D5 D6 D7 D8 D9 D10 D11 D12 D13 D14

Ghi chú: (+): mẫu dương tắnh; (-): mẫu âm tắnh, Wt: đối chứng.

4.2.2.2. Xác định trình tự đột biến của gen GS3 trên cây lúa

Để xác định hiệu quả gây đột biến của cấu trúc vector cas9 đối với gen GS3, chúng tôi tiến hành giải trình tự vùng gen mục tiêu của gRNA1 đối với 5 dòng lúa. Kết quả xác định được 2 dòng D7 và D11 bị đột biến mất 02 nu TC ở vị trắ 127 và

128 so với trình tự gốc ban đầu (WT) (hình 4.5). Kết quả này cho thấy cấu trúc vector Cas9 có khả năng gây đột biến vùng gen mục tiêu GS3 như thiết kế.

Hình 4.5. Cây chỉnh sửa gen và trình tự gen GS3

chỉnh sửa bởi gRNA1ở dòng số 7 và số 11 4.3.

Kết quả đánh giá đặc điểm hình thái các cây chỉnh sửa gen

4.3.1. Đánh giá đặc điểm nông sinh học của các dòng cây T0

Kết quả sàng lọc PCR gen Hyg thu được 26/27 dòng chỉnh sửa gen. Chúng tôi tiến hành đánh giá một số chỉ tiêu nông sinh học của các dòng này nhằm chọn ra các dòng chỉnh sửa gen ưu tú để tiếp tục chọn lọc và đánh giá.

4.3.1.1. Đặc điểm chiều cao cây, số nhánh/cây

Chiều cao cây và số nhánh là chỉ tiêu quan trọng liên quan đến các đặc tắnh chống đổ, số bông/cây cũng như các đặc điểm khác của cây. Chiều cao cây của các dòng chỉnh sửa gen trung bình đạt 67,45cm, dao động từ 53,5 đến 83,5cm. Mặc dù các dòng lúa chỉnh sửa gen có chiều cao cây thấp hơn đối chứng nhưng khả năng đẻ nhánh cao hơn. Số nhánh/cây dao động từ 14 đến 37 nhánh, trung bình đạt 23,69 nhánh/cây cao hơn nhiều so với đối chứng (13 nhánh/cây, Bảng 4.7 và hình 4.6), các dòng đều có sự sai khác ý nghĩa so với đối chứng ở mức độ tin cậy 95%.

Bảng 4.7. Một số chỉ tiêu nông sinh học của các dòng đột biến thế hệ T0 Số Dòng nhánh (nhánh) D1 20 D2 15 D3 27 D4 22 D5 20 D6 18 D7 26 D8 24 D9 29 D10 21 D11 37 D13 32 D14 15 D15 26 D16 32 D17 24 D18 20 D19 19 D23 25 D24 14 D25 28 D26 19 D27 25

D31 18 Mean 23,69 Max 37 Min 14 WT 13 CV(%) LSD01

Ghi chú: *: CT có sự sai khác ý nghĩa so với đối chứng

100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 Số nhánh (nhánh) D1 D2 D3 D4 D5 D6 D7 D8 D9 D10D11D13D14D15D16D17D18D19D23D24D25D26D27D28D30D31 WT

Hình 4.6. Biểu đồ thể hiện chiều cao cây và số nhánh của các dòng lúa đột biến và đối chứng (wt).

4.3.1.2. Các yếu tố cấu thành năng suất

Trong thắ nghiệm này chúng tôi tiến hành theo dõi khả năng sinh trưởng của 26 dòng lúa chuyển gen để đánh giá tiềm năng cho năng suất của từng dòng. Tiềm năng năng suất là mục tiêu quan trọng được quan tâm hàng đầu đối với người làm công tác chọn tạo giống, năng suất là tổng hợp các kết quả quá trình sinh trưởng phát triển của cây. Để xác định chỉ tiêu này của từng dòng lúa chuyển gen chúng tôi tiến hành theo dõi các yếu tố cấu thành năng suất (các chỉ tiêu năng suất của dòng lúa chuyển gen đều có sự sai khác ý nghĩa so với đối chứng ở mức tin cậy 95%) cụ thể như sau:

- Số bông/cây: Nhìn chung các dòng lúa chỉnh sửa gen có số bông/cây cao, dao động từ 11-32 bông (trung bình 21,04 bông/cây), cao hơn so với đối chứng (wt 15 bông/cây). Trong đó có các dòng D11, D13, D28 có số bông/cây vượt trội, từ 30-32 bông/cây (Bảng 4.7 và hình 4.6).

- Chiều dài bông: chiều dài bông ở các dòng chỉnh sửa gen trung bình đạt 14,59cm, thấp hơn so với chiều dài bông của cây đối chứng 19,5cm. Trong đó dòng D24 có chiều dài bông cao nhất đạt 19,09cm tương đương so với đối chứng (Bảng 4.7 và hình 4.7).

- Số hạt/bông: tổng số hạt/bông và số hạt chắc/bông liên quan trực tiếp đến năng suất hạt của cây. Kết quả theo dõi cho thấy số hạt/bông ở dòng chỉnh sửa gen biến động lớn giữa các dòng, dao động từ 21,09 đến 79,56 hạt/bông (trung bình đạt 35,55 hạt/bông), số hạt chắc dao động từ 15,73 đến 69,44 hạt/bông (trung bình đạt

28,51 hạt chắc/bông), thấp hơn so với đối chứng đạt 78,7/81,3 hạt chắc/bông (Bảng 4.7 và hình 4.7).

- Khối lượng 1000 hạt: Các dòng lúa chỉnh sửa gen có khối lượng hạt dao động từ 13,6 đến 22,66g/1000 hạt, trung bình đạt 16,71g, thấp hơn so với đối chứng (17,9g). Trong số các dòng chỉnh sửa gen chúng tôi thu được 8 dòng có khối lượng 1000 hạt cao hơn so với đối chứng, gồm D1 (22,2g), D5 (20,5g), D13 (19,62g), D17 (18,62g), D25 (18,36g), D26 (19,37g), D30 (19,91g), D31 (19,42g), (Bảng 4.7, hình 4.7, 4.8, 4.9, 4.10).

Các yếu tố cấu thành năng suất

90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 D1 D2 D3 D4 D5

Hình 4.7. Biểu đồ thể hiện một số yếu tố cấu thành năng suất của các dòng lúa đột biến và đối chứng (wt).

4.3.1.3. Kắch thước hạt của các dòng lúa đột biến

Sau khi bông lúa đã chắn tiến hành thu theo từng dòng phơi khô và tiến hành thống kê kắch thước hạt của từng dòng chuyển gen kết quả thu được ở bảng 4.8 dưới đây.

Bảng 4.8. Kắch thước hạt của các dòng lúa chỉnh sửa gen

Dòng Chiều dài (cm) D1 D2 0,81 D3 0,79 D4 0,77 D5 0,83 D6 0,77 D7 0,78 D8 0,79 D9 D10 D11

D14 0,79 D15 0,79 D16 0,80ns D17

Ghi chú: *: CT có sự sai khác ý nghĩa so với đối chứng

ns: CT không có sự sai khác ý nghĩa

Qua kết quả bảng 4.8 thống kê ngẫu nhiên 20 hạt ở các dòng chỉnh sửa gen cho thấy nhiều chiều dài hạt trung bình đạt 0,81cm, chiều rộng đạt 0,23cm, tỷ lệ D/R đạt 3,52cm (Bảng 4.8, hình 4.9). Tỷ lệ này tương đương so với kắch thước hạt của cây đối chứng với chiều dài hạt 0,81cm, rộng 0,25cm và D/R 3,24cm. Trong số 26 dòng chỉnh sửa gen, chúng tôi thu được 11 dòng có chiều dài và tỷ lệ D/R lớn hơn so với

đối chứng (0,81cm) ở mức độ tin cậy 95%, (Bảng 4.9, hình 4.9). Đa số các dòng lúa có kắch thước hạt lớn hơn đối chứng đều có khối lượng 1000 hạt cao hơn.

Bảng 4.9. Kắch thước hạt của các dòng lúa chỉnh sửa gen ưu tú STT 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

Hình 4.9. Biểu đồ thể hiện kắch thước hạt của các dòng đột biến so với đối chứng (wt).

A: Chiều dài và chiều rộng hạt; B: Tỷ lệ chiều dài/rộng. Số liệu trung bình đo đếm từ 20 hạt ngẫu nhiên từ các dòng đột biến và đối chứng.

Hình 4.10. Biểu đồ thể hiện khối lượng 1000 hạt của các dòng lúa đột biến và đối chứng (wt).

Phần 5

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 5.1. Kết luận

- Chuyển thành công cấu trúc vector chỉnh sửa gen pHAtC::AtU6::gRNA1 trên giống lúa japonica Dongjin và xác định được hiệu quả đột biến mất 02 nu TC ở vị trắ 127 và 128 so với trình tự gốc ban đầu.

- Sàng lọc thành công những dòng mang gen chuyển bằng kĩ thuật PCR.

- Đánh giá một số chỉ tiêu nông học của các dòng chỉnh sửa gen T0 cho thấy đa

số các dòng có số nhánh, số bông/cây cao hơn so với cây đối chứng. Xác định được 11 dòng có có kắch thước hạt và khối lượng 1000 hạt cao hơn so với đối chứng, trong đó 9 dòng có kắch thước tăng hơn 10% so với đối chứng.

5.2. Kiến nghị

- Tiếp tục chọn lọc và đánh giá các dòng chỉnh sửa gen ở thế hệ T1 để chọn lọc các dòng có triển vọng có khả năng bồi dưỡng thành giống.

- Tiếp tục chuyển cấu trúc vector trên những giống lúa khác nhau để đánh giá hiệu quả của gen chỉnh sửa.

TÀI LIỆU THAM KHẢO I. Tiếng việt

1. Chu Hoàng Mậu (2005), Cơ sở và phương pháp sinh học phân tử, Nxb Đại học Sư phạm.

2. Đào Xuân Tân (2003), Đặc điểm hình thái và các yếu tố cấu thành năng suất của các dòng lúa đột biến từ giống IR Ờ 64 và A20 ở thế hệ thứ 3, thông báo khoa học Đại học sư phạm Hà Nội 2.

3. Đỗ Khắc Thịnh (2003), ỘNghiên cứu ảnh hưởng của một số yếu tố canh tác và yếu tố môi trường đối với năng suất và phẩm chất lúa thơm ở đồng bằng sông Cửu LongỢ, Luận án Tiến sĩ Nông Nghiệp, Đại học Nông Lâm TP HCM.

4. Nguyễn Trọng Khanh (2016), ỘNghiên cứu chọn tạo giống lúa chất lượng