Xây dựng quy trình tái sinh in vitro cây rau muống ipomoe aquatic phục vụ nghiên cứu chuyển gen tạo vaccine thực vật

LỜI CẢM ƠN Để hồn thành chƣơng trình đào tạo bậc đại học ngành Công nghệ sinh học trƣờng Đại học Lâm Nghiệp, đƣợc đồng ý giáo viên hƣớng dẫn Ban lãnh đạo Viện Công nghệ sinh học Lâm nghiệp - trƣờng Đại học Lâm nghiệp, tơi thực đề tài khóa luận tốt nghiệp: “Xây dựng quy trình tái sinh in vitro rau muống (Ipomoe aquatic) phục vụ nghiên cứu chuyển gen tạo vaccine thực vật” Để thu đƣợc kết khóa luận, tơi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới Tiến sĩ Khƣơng Thị Thu Hƣơng – BM Công nghệ Tế bào – Viện Công nghệ Sinh học Lâm nghiệp, tận tâm bảo, hƣớng dẫn truyền lại cho kinh nghiệm quý báu suốt thời gian thực đề tài Tôi xin gửi lời cảm ơn tới Ban lãnh đạo cán công tác Viện Công nghệ sinh học Lâm Nghiệp - Trƣờng Đại học Lâm nghiệp tạo điều kiện thuận lợi để tơi thực đƣợc đề tài khóa luận Trong trình hồn thành khóa luận, có cố gắng nhƣng thời gian trình độ cá nhân có hạn nên khó tránh khỏi sai sót, mong thầy bạn bè đóng góp ý kiến để tơi rút kinh nghiệm hồn thiện báo cáo tốt Hà Nội, Ngày 15 tháng năm 2018 Sinh viên thực Ngô Phƣơng Nam i MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH ĐẶT VẤN ĐỀ Chƣơng I: TỔNG QUAN VỀ VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 1.1 Giới thiệu rau muống 1.1.1 Vị trí phân loại, nguồn gốc 1.1.2 Mô tả thực vật 1.1.3 Phân loại 1.1.4 Thành phần hóa học 1.1.5 Phân bố 1.1.6 Công dụng chữa bệnh rau muống 1.1.7 Bộ phận đƣợc sử dụng rau muống 1.2 Giới thiệu vaccine thực vật 1.2.1 Khái niệm vaccine thực vật 1.2.2 Lịch sử vaccine thực vật 1.2.3 Ƣu nhƣợc điểm vaccine thực vật 1.2.3.1 Ƣu điểm vaccine thực vật 1.2.3.2 Nhƣợc điểm vaccine thực vật 1.2.4 Qui trình sản xuất vaccine thực vật 1.3 Lịch sử nuôi cấy mô tế bào thực vật 1.3.1 Khái niệm nuôi cấy mô tế bào thực vật 1.3.2 Lịch sử nuôi cấy mô tế bào thực vật 1.3.3 Cơ sở khoa học nuôi cấy mô tế bào thực vật 1.4 Tình hình nghiên cứu nhân giống in vitro sản xuất vaccine thực vật rau muống 10 ii 1.4.1 Tình hình nghiên cứu nhân giống in vitro rau muống 10 1.4.2 Thực trạng nghiên cứu điều chế vaccine từ thực vật 12 Chƣơng II: MỤC TIÊU, NỘI DUNG, VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 14 2.1 Mục tiêu 14 2.1.1 Mục tiêu chung 14 2.1.2 Mục tiêu cụ thể 14 2.2 Nội dung 14 2.3 Vật liệu, hóa chất, thiết bị dụng cụ cần thiết sử dụng nghiên cứu 14 2.3.1 Vật liệu 14 2.3.2 Hóa chất 14 2.3.3 Dụng cụ, thiết bị 14 2.3.4 Địa điểm thí nghiệm 15 2.4 Phƣơng pháp nghiên cứu 15 2.4.1 Phƣơng pháp nghiên cứu thực nghiệm 15 2.4.2 Xử lý số liệu 18 Chƣơng III: KẾT QUẢ VẢ THẢO LUẬN 19 3.1 Kết khử trùng tạo mẫu in vitro 19 3.2 Nghiên cứu ảnh hƣởng nồng độ kinetin đến khả tái sinh chồi 21 3.3 Ảnh hƣởng kinetin 2.4 D lên trình tạo mơ sẹo phơi vơ tính 23 Chƣơng IV: KẾT LUẬN - TỒN TẠI - KIẾN NGHỊ 26 4.1 Kết luận 26 4.2 Tồn 26 4.3 Kiến nghị 26 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ BIỂU iii DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT Ký hiệu Giải thích MS Murashighe & Skoog, 1962 2.4 D 2,4-Dichlorophenoxyacetic acid TB Trung bình IBA Indole butyric acid iv DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1: Ảnh hƣởng H2SO4 98% lên hiệu khử trùng hạt 16 Bảng 2: Ảnh hƣởng nồng độ kinetin lên khả tạo đa chồi 17 Bảng 3: Ảnh hƣởng kinetin 2.4 D lên q trình tạo mơ sẹo 17 Bảng 4: Kết ảnh hƣởng H2SO4 98% lên hiệu khử trùng hạt 19 Bảng 5: Ảnh hƣởng nồng độ kinetin lên tái sinh chồi 22 Bảng 6: Ảnh hƣởng kinetin 2.4 D lên q trình tạo mơ sẹo 24 v DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1: Biểu đồ ảnh hƣởng H2SO4 98% lên hiệu khử trùng hạt rau muống 20 Hình 2: Khử trùng hạt muống H2SO4 98% 20 phút 20 Hình 3: Biểu đồ ảnh hƣởng nồng độ kinetin đến tái sinh chồi rau muống 22 Hình 4: Chồi rau muống tái sinh (Cơng thức có nồng độ kinetin 0,5mg/l) 23 Hình 5: Lá mầm rau muống (A) thân mầm rau muống (B) môi trƣờng cảm ứng tạo mô sẹo 24 vi ĐẶT VẤN ĐỀ Thế giới sống ngày phát triển, công nghệ khoa học lĩnh vực tiên phong để phục vụ cho đời sống ngƣời đƣợc nâng cao Đặc biệt vấn đề đƣợc quan tâm sức khỏe ngƣời Tiêm vaccine lâu đƣợc coi biện pháp phòng bệnh hiệu để bảo vệ ngƣời trƣớc nhiều loại dịch bệnh nguy hiểm Giờ vaccine không đƣợc điều chế phịng thí nghiệm nhà dƣợc học mà những… cánh đồng ngƣời nông dân canh tác Trong năm gần đây, với phát triển công nghệ sinh học, việc ứng dụng công nghệ gen, vaccine thực vật đƣợc nghiên cứu để đƣa vào ứng dụng thực tiễn Ƣu điểm bật loại vaccine so với vaccine sản xuất truyền thống từ vi khuẩn, nấm men….là dễ dàng sản xuất đóng ngói hàng loạt, đơn giản, đƣợc đƣa vào thể đƣờng miệng nên an toàn so với đƣờng tiêm tĩnh mạch nhƣ nhiều loại vaccine truyền thống, dễ dàng vận chuyển đến nơi xa xôi hẻo lánh, không lƣu giữ nguồn bệnh lây lan cho ngƣời động vật khác Thành tựu nhà khoa học Trƣờng Đại học Norwich, Anh Quốc nghiên cứu loại vaccine thực vật phịng chống đƣợc bệnh bại liệt Ngồi cịn có thành tựu tiêu biểu khác nhƣ vaccine phòng viêm gan B từ khoai tây, vaccine ngừa bệnh sốt mùa hè từ lúa, vaccine ngăn ngừa bệnh than từ rau bina, vaccine phòng bệnh sốt rét từ thuốc lá, Các nhà sinh vật học Mỹ chứng minh đƣợc việc ăn trực tiếp loại rau đặc biệt giúp thể ngƣời nâng cao khả miễn dịch giống nhƣ tiêm vaccin vào máu Trong tƣơng lai, khơng mua vaccin hiệu thuốc tân dƣợc mà cửa hàng “rau đặc biệt” nhà sinh vật học Từ kết thu đƣợc, nhiều nhà khoa học khẳng định, chuyển gen vào trồng cách làm hiệu rẻ tiền để sản xuất vaccin thực vật Rau muống loài rau thơng dụng có giá trị dinh dƣỡng cao, giá thành rẻ, đƣợc sử dụng làm thức ăn cho ngƣời nhiều lồi vật ni Lồi dễ nhân giống sinh dƣỡng hạt, dễ dàng sinh trƣởng phát triển nhiều điều kiện mơi trƣờng, sản xuất hàng loạt với số lƣợng lớn mà khơng cần q nhiều kinh phí công sức Với đặc điểm rau muống sử dụng làm vật chủ để sản xuất vaccine thực vật Ở Việt Nam giới nghiên cứu nhân giống chuyển gen hoàn chỉnh rau muống hầu nhƣ chƣa đƣợc công bố Tƣơng tự nhƣ tạo trồng chuyển gen khác, để điều chế vaccine thực vật công nghệ chuyển gen, việc xây dựng qui trình tái sinh in vitro lồi đƣợc lựa chọn làm vật chủ sản xuất kháng nguyên công việc bắt buộc Nhằm phục vụ việc nghiên cứu tạo vaccine thực vật từ rau muốn, tơi lựa chọn thực đề tài khóa luận tốt nghiệm: “Xây dựng quy trình tái sinh in vitro rau muống (Ipomoe aquatic) phục vụ nghiên cứu chuyển gen tạo vaccine thực vật” Chƣơng I: TỔNG QUAN VỀ VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 1.1 Giới thiệu rau muống Rau muống có tên khoa học Ipomoea aquatica Forsk, thuộc họ Khoai lang Convolvulaceae Rau muống có nguồn gốc nhiệt đới châu Á, khu vực Nam Đông Nam Á, nhiệt đới châu Phi, Trung Á, Nam Mỹ châu Đại Dƣơng Rau muống ngắn ngày, sinh trƣởng nhanh, cho suất cao, sống đƣợc nhiệt độ cao đủ ánh sáng.Có thể trồng rau muống nhiều loại đất: đất sét, đất cát, đất pha cát, đất ẩm giàu mùn đất đƣợc bón phân hữu cơ, có độ pH= 5,3 – 6,0 1.1.1 Vị trí phân loại, nguồn gốc Giới: Thực vật Bộ: Solananes Họ: Convolvulaceae Chi: Ipomoea Loài: Ipomoea aquatica Tên khoa học Rau muống Ipomoea aquatica Forssk 1.1.2 Mô tả thực vật Cây rau muống hạt kín, mọc bị, mặt nƣớc cạn Thân rỗng, dày, có rễ mắt, thƣờng khơng có lơng vào mùa nóng, có lơng vào mùa lạnh Thân tròn, thẳng, thân phân nhánh thành phiến Cây sinh trƣởng với tốc độ nhanh với phần rễ chùm dài ăn nhanh vào đất Lá hình ba cạnh, đầu nhọn, đơi hẹp dài hay hình mũi tên, chiều dài từ 2-6 cm, chiều rộng 0,5-2 cm, đơn mọc cách khơng có kèm, non thƣờng có màu xanh nhạt, đầu thƣờng có hƣớng chúc xuống phía dƣới đất, hệ gân lồi mặt dƣới lá, phiến mềm,mỏng dài Hoa to, có màu trắng hay hồng tím, ống hoa tím nhạt, mọc 1-2 hoa cuống Cây rau muống 1.1.3 Phân loại Rau muống chia làm loại: - Rau muống nƣớc: đƣợc trồng mọc nơi nhiều nƣớc, ẩm ƣớt, chí sống tốt kết thành bè thả trôi kênh mƣơng hay hồ Loại thân to, cuống thƣờng có màu đỏ, mọng, luộc ngon xào hay ăn sống - Rau muống cạn, trồng luống đất, cần không nhiều nƣớc, thân thƣờng trắng xanh, nhỏ Loại thứ hai thƣờng thích hợp với xào ăn sống Ngồi ra, cịn phân loại rau muống theo điều kiện trồng: - Rau muống ruộng: có giống rau muống trắng rau muống đỏ Trong rau muống trắng thƣờng đƣợc trồng cạn, chịu ngập Còn rau muống đỏ đƣợc trồng cạn dƣới nƣớc với nhiệt độ ao 20-300C - Rau muống phao: rau cấy xuống bùn, cho lên, ăn quanh năm - Rau muống bè: rau thả quanh năm mặt nƣớc, dùng tre cố định chỗ định ao - Rau muống thúng: trồng rau vào thúng đất, để thúng đất lên giá cắm ao sâu để thúng lên ¼ cho rau bị quanh mặt ao Bảng 2: Ảnh hƣởng nồng độ kinetin lên khả tạo đa chồi Loại mẫu Kinetin Đỉnh chồi mầm 0,1 0,2 0,5 1,5 Tỉ lệ mẫu tạo chồi (%) Số chồi trung bình/mẫu Đặc điểm chồi Chiều dài chồi trung bình (cm) * Tính tốn: Tỷ lệ mẫu tạo chồi = 2.4.1.3 Nghiên cứu ảnh hưởng nồng độ kinetin 2.4 D đến khả tạo mô sẹo phôi vô tính Cắt nhỏ mầm (1-2mm) thân mầm (1-3mm) đƣa vào bình mơi trƣờng cảm ứng tạo mơ sẹo phơi vơ tính Thành phần mơi trƣờng cảm ứng mơ sẹo phơi vơ tính: Mơi trƣờng MS + 20g/l đƣờng + 7g/l Agar + Kinetin (0-2.5mg/l) + 2.4 D 0-2.5mg/l) (Bảng 2) Mơi trƣờng có pH=5,8 Mỗi cơng thức làm bình, bình 25 mẫu Theo dõi kết (Bảng 2) sau - tuần thực thí nghiệm Bảng 3: Ảnh hƣởng kinetin 2.4 D lên q trình tạo mơ sẹo Loại mẫu Lá mầm Thân mầm 2.4 D Knetin Số mẫu 0,5 1,5 2,5 0,5 1,5 2,5 0,5 1,5 2,5 0,5 1,5 2,5 Tỉ lệ mẫu tạo mô sẹo 20 20 20 20 40 40 20 20 20 40 40 40 17 Đặc điểm Thời gian mô sẹo tạo mô sẹo Ghi 2.4.2 Xử lý số liệu 2.4.2.1 Phương pháp thu thập số liệu - Số liệu thu thập đƣợc phƣơng pháp quan sát, đo đếm, thống kê - Chỉ tiêu quan sát: Số mẫu sạch, số mẫu nảy mầm, số chồi mẫu nhân nhanh, chất lƣợng chồi, số lƣợng mô sẹo, số lƣợng rễ, đặc điểm rễ (Bảng 1,2,3) 2.4.2.2 Phương pháp thống kê xử lý số liệu Các số liệu đƣợc tính tốn theo phƣơng pháp phân tích thống kê tốn học Excel máy vi tính Sử dụng hàm tính phân tích phƣơng sai nhân tố 18 Chƣơng III: KẾT QUẢ VẢ THẢO LUẬN 3.1 Kết khử trùng tạo mẫu in vitro Trong nhân nhân giống in vitro, việc tạo đƣợc mẫu có khả tái sinh chồi tốt tiêu có ý nghĩa then chốt Tôi lựa chọn dung dịch H2SO4 98% javen để khử trùng mẫu cấy từ hạt Dung dịch khử trùng H2SO4 98% dung dịch axit đậm đặc có tính ăn mịn cực mạnh Do trình khử trùng tạo mẫu in vitro, ngồi tác dụng khử trùng hạt axit cịn bào mịn vỏ hạt làm cho hạt có khả nảy mầm nhanh hơn, hay gọi phá ngủ Khi kéo dài thời gian khử trùng, thu đƣợc tỉ lệ mẫu cao, nhƣng mẫu có nguy bị axit ăn mòn vào vỏ hạt làm giảm sức sống hạt nhƣng khử trùng thời gian ngắn cho tỉ lệ mẫu thấp, thời gian chƣa đủ để tiêu diệt vi sinh vật Vì cần nghiên cứu để tìm cơng thức khử trùng tối ƣu nâng cao hiệu tạo mẫu sống, in vitro Các mầm sinh trƣởng tốt đƣợc sử dụng làm vật liệu tái sinh in vitro bƣớc qui trình tái sinh rau muống Sau thời gian nghiên cứu, tơi thu đƣợc kết trình bày bảng dƣới đây: Bảng 4: Kết ảnh hƣởng H2SO4 98% lên hiệu khử trùng hạt Thời gian khử trùng H2SO4 98% (phút) 10 15 20 25 Tỉ lệ mẫu (%) 0 67 100 33 Tỉ lệ Sau 72 nảy mầm Sau tuần (%) Chiều dài trung bình mầm (cm) 84 91 82 98 100 98 98 98 100 98 100 100 3,2 3,8 4,5 4,8 Cây cao, thân mập Cây cao, thân mập Cây cao, thân mập Đặc điểm mầm Cây bị Cây bị nhiễm nhiễm nấm nấm khuẩn khuẩn, thân mập 19 Cây mập nhƣng bị nhiễm nấm khuẩn 120 98 100 100 98 98 100 100 100 80 67 60 40 33 20 0 0 10 15 20 25 Thời gian khử trùng H2SO4 98% (phút) Tỷ lệ mẫu Tỷ lệ nảy mầm Hình 1: Biểu đồ ảnh hƣởng H2SO4 98% lên hiệu khử trùng hạt rau muống Hình 2: Khử trùng hạt rau muống H2SO4 98% 20 phút Theo bảng công thức xử lý khử trùng mẫu H2SO4 98% 20 phút cho hiệu cao (chiều dài trung bình nảy mầm 4,5cm với tỷ lệ mẫu sau khử trùng đạt 100% sau tuần nuôi cấy) Ở công thức này, rễ 20 tơ phân nhánh màu trằng, có nhiều lơng hút sau ngày bắt đầu rễ Điều chứng tỏ công thức khử trùng rau muống với 20 phút phù hợp đễ khử trùng mẫu hạt rau muống Năm cơng thức cịn lại sau 21 ngày đặt hạt vào môi trƣờng cho kết tỷ lệ khử trùng nhỏ 100%, cơng thức khử trùng 15 phút dung dịch H2SO4 98% cho kết 67% tỷ lệ mẫu cho kết tỷ lệ mẫu công thức khử trùng 25 phút với kết 33% Trong công thức phút không đƣợc khử trùng H2SO4 98% sau ngày bắt đầu xuất nấm mốc trắng Hai công thức đƣợc xử lý phút 10 phút bị nhiễm nầm mốc trắng nhiễm vi khuẩn sau ngày Từ kết cho thấy H2SO4 98% 20 phút cho hiệu khử trùng tốt Từ kết thu đƣợc bảng thấy đƣợc kết bào mòn vỏ hạt H2SO4 98% 20 phút 25 phút cho hiệu cao với số lƣợng nảy mầm đạt 100%, chiều cao thân mầm hai công thức lần lƣợt 4,5cm 4,8cm sau tuần Chứng tỏ thời gian nảy mầm sớm nên có chiều cao cao cơng thức cịn lại Những cơng thức cịn lại cho kết chiều cao thân mầm chƣa đến 4,5cm Kết xử lý Anova nhân tố thu đƣợc Ftính(4,8) > Fcrit(3,105875) Chứng tỏ khác biệt khử trùng khoảng thời gian khác cơng thức thí nghiệm có ý nghĩa thống kê Từ phân tích cho thấy xử lý H2SO4 98% 20 phút cơng thức đƣợc lựa chọn cho thí nghiệm 3.2 Nghiên cứu ảnh hƣởng nồng độ kinetin đến khả tái sinh chồi Môi trƣờng dinh dƣỡng tác nhân quan trọng ảnh hƣởng nhiều đến hiệu nhân giống đặc biệt chất điều tiết sinh trƣởng Trong thí nghiệm tái sinh chồi bổ sung kinetin vào môi trƣờng nhằm thăm dị xác định mơi trƣờng hiệu để tái sinh chồi Kết sau tuần theo dõi trình bày bảng 21 Bảng 5: Kết ảnh hƣởng nồng độ kinetin lên tái sinh chồi rau muống Loại mẫu Đỉnh chồi mầm Kinetin Tỉ lệ mẫu tạo chồi (%) Số chồi trung bình/mẫu 18 1,2 0,1 67 1,3 0,5 71 1,7 80 67 70 Đặc điểm chồi Chồi mập, cao, non, xanh Chồi mập, non, có vài chồi chuyển sang nâu Chồi cao, xanh nhƣng có vài chồi cịi Chiều dài chồi trung bình (cm) 1,4 1,5 1,1 71 60 50 40 30 20 18 10 0 0.1 0.5 Tỷ lệ tạo chồi cơng thức có nồng độ kinetin khác Tỷ lệ mẫu tạo chồi (%) Hình 3: Biểu đồ ảnh hƣởng nồng độ kinetin đến tái sinh chồi rau muống 22 Hình 4: Chồi rau muống tái sinh (Cơng thức có nồng độ kinetin 0,5mg/l) Thơng qua kết cho thấy nồng độ kinetin khác cho kết tái sinh chồi khác Trong cơng thức thí nghiệm, cơng thức có nồng độ kinetin 0,5mg/l cho kết tốt nhất, với tỉ lệ mẫu tạo chồi 71% với chiều dài trung bình chồi 1,4cm Cơng thức với nồng độ kinetin 0,2mg/l cho kết 67% với chiều dài trung bình chồi 1,5cm Tuy nhiên cơng thức đối chứng tỷ lệ tạo chồi đạt 18% với chiều cao trung bình chồi 1,4cm Từ kết cho thấy nồng độ kinetin nghiên cứu, 0,5mg/l nồng độ tốt để tạo đa chồi 3.3 Ảnh hƣởng kinetin 2.4 D lên q trình tạo mơ sẹo phơi vơ tính Chất điều hịa sinh trƣởng đƣợc dùng để cảm ứng tạo mơ sẹo phơi vơ tính kinetin 2.4 D (bảng 3) Lá thân mầm mầm sạch, sinh trƣởng tốt mục 3.1 đƣợc cắt nhỏ chuyển vào môi trƣờng tạo mô sẹo nhằm tìm cơng thức tạo mơ sẹo tốt quan sát cảm ứng hình thành phơi vơ tính Sau tuần thí nghiệm, kết đƣợc thể bảng sau: 23 Bảng 6: Kết ảnh hƣởng kinetin 2.4 D lên trình tạo mô sẹo Loại mẫu Lá mầm Thân mầm Tỉ lệ 2.4 D Knetin Số mẫu mẫu tạo mô sẹo 0 20 0,5 0,5 20 1 20 1,5 1,5 20 2 40 2,5 2,5 40 0 20 0,5 0,5 20 1 20 1,5 1,5 40 2 40 2,5 2.5 40 Đặc điểm mô sẹo - Thời gian tạo mô sẹo tuần tuần tuần tuần tuần tuần tuần tuần tuần tuần tuần tuần Ghi - B A Hình 5: Lá mầm rau muống (A) thân mầm rau muống (B) môi trƣờng cảm ứng tạo mô sẹo Quan sát sau tuần nuôi cấy thấy thân mầm bị chết chƣa kịp tạo mô sẹo chết chuyển sang màu nâu vàng (Hình B) có tƣợng bị nhiễm khuẩn Lá màu xanh nhƣng khơng có biểu tạo mơ sẹo (Hình 5.A) Kết nhiễm vi khuẩn, thời gian theo dõi ngắn nên mẫu 24 chƣa kịp cảm ứng tổ hợp chất điều tiết sinh trƣởng chƣa phù hợp (cao quá) làm mẫu bị chết Tuy nhiên, Prasad cs, 2006, thu đƣợc tỉ lệ tạo mô sẹo cao từ tổ hợp NAA 1.5mg/l kinetin 0.5 mg/l (Prasad et al 2006) Do vậy, cần tiếp tục nghiên cứu tiếp để tìm cơng thức mơi trƣờng tạo mơ sẹo cảm ứng phơi vơ tính thành công từ thân mầm 25 Chƣơng IV: KẾT LUẬN - TỒN TẠI - KIẾN NGHỊ 4.1 Kết luận Sau tháng làm thí nghiệm xây dựng qui trình tái sinh in vitro rau muống, tơi thu đƣợc kết bƣớc đầu nhƣ sau: Thời gian khử trùng hạt rau muống 20 phút cho tỷ lệ mẫu sống, cao đạt 100% Thành phần môi trƣờng MS + 20g/l Đƣờng + 7g/l Agar + 0,5mg/l Kinetin, pH=5,8 cho tỉ lệ tái sinh chồi từ đỉnh chồi mầm cao đạt 71% 4.2 Tồn Do vấn đề nghiên cứu Việt Nam giới, cộng với thời gian thực ngắn trình độ cá nhân cịn hạn chế nên khóa luận thực đƣợc số bƣớc qui trình tái sinh in vitro rau muống, với kết khiêm tốn 4.3 Kiến nghị Cần có nghiên cứu để hồn thiện tối ƣu qui trình tái sinh in vitro rau muống phục vụ cho nghiên cứu chuyển gen tạo vaccine thực vật 26 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt Bùi Trang Việt (2000), Sinh lý thực vật đại cương, phần II: Phát triển, Nhà xuất Đại học Quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh Dƣơng Tấn Nhựt (2007), Công nghệ thực vật, tập Nhà xuất Nông nghiệp Đỗ Năng Vịnh (2005), Công nghệ tế bào thực vật ứng dụng, Nhà xuất Nơng nghiệp Hà Nội Lê Trần Bình, Hồ Hữu Nghị, Lê Thị Muội (1997), công nghệ sinh học thực vật cải tiến giống trồng Nhà xuất Hà Nội Nguyễn Đức Thành (2000), nuôi cấy mô tế bào thực vật - nghiên cứu ứng dụng, Nhà xuất Nông nghiệp Hà Nội Nguyễn Hồng Lộc (2006), Cơng nghệ tế bào Nhà xuất Đại học Huế .Nguyễn Quang Trạch cộng (2003), Bài giảng công nghệ sinh học thực vật, Nhà xuất Đại học Nông nghiệp I, Hà Nội Nguyễn Thị Loan (2010), Nghiên cứu hoàn thiện kỹ thuật nhân giông lan kim tuyến (Anoectochilus setaceus blume) qua phơi hạt phương pháp nhân giống in vitro Khóa học tốt nghiệp - Trƣờng Đại học Lâm Nghiệp Nguyễn Thị Phƣơng Nam cộng (2014), Biến nạp gen HbsAg số giống cà chua bi (Lycopersicon esculentum Mill.) Tạp chí khoa học phát triển 2014, tập 12, số 7: 1005-1014 10 Vũ Văn Chí (2003), Từ điển thực vật thông dụng tập 1, Nhà xuất Khoa học Kỹ thuật, tr 11 - 39 11 Vũ Văn Vụ, Vũ Thanh Tâm, Hoàng Minh Tấn (2005), Sinh lý học thực vật Nhà xuất Giáo dục 12 Vũ Văn Thụ, Nguyễn Mộng Hùng, Lê Hông Diệp (2005), Công nghệ sinh học (Tập2) Nhà xuất Giáo dục Tài liệu tiếng Anh 13.Adrian S., Nigel S., Mark F (2008), Plant biotechnology - The genetic manipulation of plants Oxford University, Chapter 2, PP.37-52 14 Dagla H.R (2012), “Plant tissue culture - Historical developments and applied aspects”, Jaurnal of Science Education, 17(8), pp 759-767 15 Dewanjee S, Dua TK, Khanra R, Das S, Barma S, Joardar S, Bhattacharjee N, Zia-Ul-Haq M, Jaafar HZ (2015) Water Spinach, Ipomoea aquatic (Convolvulaceae), Ameliorates Lead Toxicity by Inhibiting Oxidative Stress and Apoptosis PLoS One 10:e0139831 doi:10.1371/journal.pone.0139831 16 Dua T, Dewanjee S, Gangopadhyay M, Khanra R, Zia-Ul-Haq M, De Feo V (2015) Ameliorative effect of water spinach, Ipomoea aquatic (Convolvulaceae), against experimentally induced arsenic toxicity J Transl Med 13:doi: 10.1186/s12967-12015-10430-12963 PMID: 25890105 17 Prasad KN, Prasad MS, Shivamurthy GR, Aradhya SM (2006) Callus induction from Ipomoea aquatica Forsk leaf and its antioxidant activity Indian Journal of Biotechnology 5:107-111 18 Jung H.K., Eun J.C and Hun I.O.(2005), “Saponin production in submerged adventitious root culture of Panax ginseng as affected by culture condition and elicitors” AsPac J Mol.Biol., 13(2) 19 Razdan M.K.(2003), Introduction to plat tissue culture, Science Pub Inc.,pp 37-53 20 Sijun Z., Daniel C.W.B.(2005), “High effciency plant production of North American ginseng via somatic embryogenesis from cotyledon explants”, Plant Cell Rep 25,pp.166-173 21 Yang UJ, Yoon SR, Chung JH, Kim YJ, Park KH, Park TS, Shim SM (2012) Water spinach (Ipomoea aquatic Forsk.) reduced the absorption of heavy metals in an in vitro bio-mimicking model system Food Chem Toxicol 50:3862-3866 doi:10.1016/j.fct.2012.07.020 Tài liệu web 22 https://text.123doc.org/document/1892045-vaccine-thuc-vat.htm 23.https://tailieu.vn/tag/vaccine-thuc-vat.html 24.http://luanvan.net.vn/luan-van/bai-tieu-luan-cong-nghe-te-bao-thuc-vatvaccine-an-64264/ 25.http://www.ijp-online.com/article.asp?issn=0253 613;year=2005;volume=37;issue=6;spage=397;epage=398;aulast=Prasad 26.https://scholar.google.com.vn/scholar?q=ipomoea+aquatica+in+vitro&hl=vi &as_sdt=0&as_vis=1&oi=scholars 27 https://ejournal.sinica.edu.tw/bbas/content/2005/2/Bot462-02.html PHỤ BIỂU Phụ biểu 1: Môi trƣờng MS (Murashige & Skoog, 1996) Các thành phần môi trƣờng Khối lƣợng (mg/l) KNO3 1900 NH4NO3 1650 MgSO4.7H2O 370 KH2PO4 170 CaCl2 332 H3BO3 6,2 MnSO4.H2O 22,6 ZnSO4 8,6 Na2MoO4 0,25 CuSO4.5H2O 0,025 CoCl2 0,025 FeSO4.7H2O 27,8 Na2EDTA 37,3 Glycin Myo - Inositol 100 Thiamine HCl 0,1 Axit nicotinic 0,5 Pyridoxine HCl 0,5 Phụ biểu 2: Ảnh hƣởng H2SO4 lên hiệu khử trùng hạt Anova: Single Factor SUMMARY Groups Count Sum Average Variance Row 0 Row 0 Row 3 0 Row 30 10 75 Row 45 15 Row 15 75 ANOVA Source of Variation SS df MS F P-value F crit Between Groups 600 120 Groups 300 12 25 Total 900 17 Within 4,8 0,012157 3,105875 ... Nhằm phục vụ việc nghiên cứu tạo vaccine thực vật từ rau muốn, tơi lựa chọn thực đề tài khóa luận tốt nghiệm: ? ?Xây dựng quy trình tái sinh in vitro rau muống (Ipomoe aquatic) phục vụ nghiên cứu chuyển. .. qui trình tái sinh in vitro rau muống, với kết khiêm tốn 4.3 Kiến nghị Cần có nghiên cứu để hồn thiện tối ƣu qui trình tái sinh in vitro rau muống phục vụ cho nghiên cứu chuyển gen tạo vaccine thực. .. LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Mục tiêu 2.1.1 Mục tiêu chung Xây dựng quy trình tái sinh in vitro rau muống (Ipomoe aquatic) phục vụ nghiên cứu chuyển gen tạo vaccine thực vật 2.1.2 Mục tiêu