Nghiên cứu xây dựng quy trình nhân nhanh in vitro giống lan hoàng thảo vôi đỏ dendrobium jan orinstein red and white luận văn thạc sĩ nông nghiệp

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM BÙI THỊ MINH NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG QUY TRÌNH NHÂN NHANH IN VITRO GIỐNG LAN HỒNG THẢO VƠI ĐỎ DENDROBIUM JAN ORINSTEIN RED AND WHITE Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã số: 60.42.02.01 Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS Hà Thị Thúy GS.TS.NGND Nguyễn Quang Thạch NHÀ XUẤT BẢN ĐẠI HỌC NƠNG NGHIỆP - 2017 LỜI CAM ĐOAN Tơi xin cam đoan: Bài luận văn thạc sỹ cơng trình nghiên cứu thực cá nhân, thực dựa sở nghiên cứu lý thuyết, kiến thức chuyên ngành, nghiên cứu khảo sát tình hình thực tiễn hướng dẫn khoa học PGS.TS Hà Thị Thúy GS.TS Nguyễn Quang Thạch Các số liệu, bảng biểu kết luận văn trung thực, nhận xét, phương hướng đưa xuất phát từ thực tiễn kinh nghiệm có Một lần xin khẳng định trung thực lời cam đoan Hà Nội, ngày 10 tháng năm 2017 Tác giả luận văn Bùi Thị Minh i LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành báo cáo tốt nghiệp này, nỗ lực cố gắng thân nhận giúp đỡ nhiệt tình mặt thầy giáo, tập thể cá nhân Với lòng biết ơn sâu sắc xin gửi lời cảm ơn chân thành tới: PGS TS Hà Thị Thúy – phịng Thí nghiệm trọng điểm công nghệ tế bào thực vật – Viện Di truyền Nông nghiệp GS.TS Nguyễn Quang Thạch– giảng viên khoa Công nghệ Sinh học – Học viện Nông nghiệp Việt Nam dành nhiều thời gian, tâm huyết bảo, giúp đỡ tơi suốt q trình thực tập Tôi xin gửi lời cảm ơn tới tập thể cán làm việc phòng nghiên cứu phòng trọng điểm quốc gia công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật - Viện Di truyền Nông nghiệp tạo điều kiện thuận lợi, giúp đỡ tơi hồn thành luận văn này.Tôi xin gửi lời cảm ơn đến th.S Cao Thị Châm tận tình bảo, chia sẻ kinh nghiệm giúp đỡ tơi q trình thực luận văn Tôi xin chân thành cảm ơn thầy giáo, cô giáo Học viện Nông nghiệp Việt Nam tận tình dạy bảo tơi suốt năm học qua Cuối cùng, tơi xin bày tỏ lịng biết ơn tới người thân, bạn bè bên, chăm sóc, giúp đỡ tơi suốt thời gian thực đề tài tốt nghiệp Xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 10 tháng năm 2017 Tác giả luận văn Bùi Thị Minh ii MỤC LỤC Lời cam đoan I Lời cảm ơn II Mục lục III Danh mục viết tắt VI Danh mục bảng VII Danh mục hình VIII Danh mục hình VIII Trích yếu luận văn IX Thesis abstract xi Phần Mở đầu 1.1 Đặt vấn đề .1 1.2 Mục đích, yêu cầu 1.2.1 Mục đích 1.2.2 Yêu cầu 1.3 Ý nghĩa đề tài Phần Tổng quan tài liệu 2.1 Nguồn gốc, phân bố, phân loại giá trị phong lan 2.2 Đặc điểm thực vật học chi lan hoàng thảo 2.2.1 Rễ 2.2.2 Thân 2.2.3 Lá 2.2.4 Hoa 2.2.5 Quả 2.3 Đặc điểm sinh thái học chi lan hoàng thảo .7 2.3.1 Nhiệt độ 2.3.2 Ẩm độ .8 2.3.3 Ánh sáng 2.3.4 Giá thể .9 2.3.5 Mùa nghỉ iii 2.4 Đặc điểm thực vật học sinh thái học lan hồng thảo vơi đỏ 10 2.5 Tình hình sản xuất hoa lan việt Nam Và giới 11 2.5.1 Tình hình sản xuất hoa lan giới 11 2.5.2 Tình hình nghiên cứu, sản xuất phát triển phong lan Việt Nam .12 2.6 Các phương pháp nhân giống lan hoàng thảo 15 2.6.1 Phương pháp truyền thống .15 2.6.2 Phương pháp nhân giống nuôi cấy mô tế bào thực vật 17 2.7 Tình hình nghiên cứu ni cấy mơ tế bào hoa lan hồng thảo vơi đỏ 17 Phần Đối tượng, vật liệu, nội dung phương pháp nghiên cứu .19 3.1 Đối tượng, vật liệu thời gian nghiên cứu 19 3.1.1 Đối tượng nghiên cứu 19 3.1.2 Vật liệu nghiên cứu 19 3.1.3 Thời gian, địa điểm nghiên cứu 19 3.2 Nội dung nghiên cứu 20 3.2.1 Tạo mẫu nuôi cấy vô trùng 20 3.2.2 Nghiên cứu phương pháp nhân nhanh thông qua protocorn điều kiện nuôi cấy khác 22 3.2.3 Nghiên cứu phương pháp tái sinh tạo hoàn chỉnh 23 3.2.4 Nghiên cứu phương pháp huấn luyện đưa in vitro vườn ươm 25 3.3 Phương pháp nghiên cứu 26 3.3.1 Giai đoạn chọn xử lý mẫu 27 3.3.2 Các hóa chất thiết bị sử dụng nghiên cứu 27 3.3.3 Phương pháp pha chế môi trường nuôi cấy in vitro 27 3.4 Các tiêu theo dõi 28 Phần Kết thảo luận 29 4.1 Ảnh hưởng khác chất khử trùng đến mẫu nuôi cấy 30 4.1.1 Ảnh hưởng nồng độ chất khử trùng đến hiệu khử trùng mẫu non nuôi cấy 30 4.1.2 Ảnh hưởng nồng độ chất khử trùngđến hiệu khử trùng mẫu chồi đỉnh nuôi cấy 32 iv 4.1.3 Ảnh hưởng nồng độ chất khử trùng đến hiệu khử trùng mẫu đoạn thân 33 4.2 Ảnh hưởng nguồn mẫu đến sinh trưởng mẫu đưa vào nuôi cấy 34 4.3 Ảnh hưởng môi trường nuôi cấy đến sinh trưởng mẫu nuôi cấy 35 4.4 Ảnh hưởng chất điều hịa sinh trưởng tới q trình phát sinh hình thái mẫu ni cấy 37 4.5 Nghiên cứu phương pháp nhân nhanh thông qua protocorm điều kiện nuôi cấy khác 38 4.5.1 Ảnh hưởng 6-BA lên khả nhân protocorm .39 4.5.2 Ảnh hưởng 6-BA kết hợp với Kinetin lên khả nhân protocorm 39 4.6 Nghiên cứu phương pháp tái sinh tạo hoàn chỉnh 40 4.6.1 Ảnh hưởng mơi trường tái sinh lan hồng thảo Vơi Đỏ từ protocorm 40 4.7 Kết nghiên cứu ảnh hưởng biện pháp chăm sóc 47 4.7.1 Nghiên cứu ảnh hưởng số biện pháp huấn luyện bình trước 47 4.7.2 Nghiên cứu ảnh hưởng giá thể đến sinh trưởng phát triển giai đoạn 48 Phần Kết luận kiến nghị 53 5.1 Kết luận 53 5.2 kiến nghị 53 Tài liệu tham khảo 54 Phụ lục 56 v DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Nghĩa tiếng Việt 6-BA - Benzyl Amino Purine AC Than hoạt tính CC Chiều cao CDL Chiều dài CDR Chiều dài rễ CT Cơng thức CX Chuối xanh ĐHST Điều hịa sinh trưởng ĐK Đường kính ĐK Đường kính GA3 Giberrilin acid HSN Hệ số nhân IAA Indol Acetic Acid Ki Kinetin ND Nước dừa NL Nhắc lại NTU Nền tối ưu PSHT Phát sinh hình thái α - NAA α - Naphthalene Acetic Acid vi DANH MỤC BẢNG Bảng 4.1 Ảnh hưởng chất khử trùng đến sinh trưởng mẫu non 31 Bảng 4.2 Ảnh hưởng nồng độ chất khử trùngđến sinh trưởng mẫu chồi đỉnh nuôi cấy 32 Bảng 4.3 Ảnh hưởng nồng độ chất khử trùng đến sinh trưởng mẫu chồi từ đoạn thân 33 Bảng 4.4 Ảnh hưởng nguồn mẫu đến sinh trưởng mẫu nuôi cấy 34 Bảng 4.5 Ảnh hưởng loại môi trường lên khả tạo protocorm sau tuần nuôi cấy 36 Bảng 4.6 Ảnh hưởng nồng độ 6-BA đến khả tạo protocorm chồi lan hồng thảo Vơi Đỏ 37 Bảng 4.7 Ảnh hưởng 6-BA lên khả nhân protocorm sau tuần nuôi cấy 39 Bảng 4.8 Ảnh hưởng 6-BA kết hợp với kinetin lên khả nhân protocorm 40 Bảng 4.9 Ảnh hưởng nồng độ 6-BA đến khả tái sinh nhân chồi từ protocorm 41 Bảng 4.10 Ảnh hưởngcủa 6-BA kết hợp với kinetin đến khả tái sinh nhân chồi từ protocorm 42 Bảng 4.11 Ảnh hưởng kết hợp GA3 đến trình kéo dài chồi 43 Bảng 4.12 Ảnh hưởng α-NAA đến hình thành rễ 44 Bảng 4.13 Ảnh hưởng nồng độ nước dừa đến trình sinh trưởng in vitro 46 Bảng 4.14 Ảnh hưởng số biện pháp huấn luyện trước 47 Bảng 4.15 Ảnh hưởng giá thể đến rễ giai đoạn 48 Bảng 4.16 Ảnh hưởng giá thể đến tăng trưởng chiều cao đường kính thân giai đoạn 50 vii DANH MỤC HÌNH Hình 2.1 Lan Hồng thảo Vôi Đỏ (sưu tầm) 10 Hình 4.1 Ảnh hưởng chất khử trùng mẫu non 31 Hình 4.2 Ảnh hưởng chất khử trùng mẫu chồi đỉnh 33 Hình 4.3 Ảnh hưởng loại mơi trường lên khả nhân protocorm sau tuần nuôi cấy 36 Hình 4.4 Ảnh hưởng nồng độ 6-BA đến khả tạo protocorm chồi lan hoàng thảo Vôi đỏ nồng độ 6-BA = 2mg/l 38 Hình 4.5 Ảnh hưởng 6-BA lên khả nhân protocorm sau tuần nuôi cấy 39 Hình 4.6 Ảnh hưởng 6-BA lên khả tạo chồi từ protocorm sau tuần nuôi cấy 41 Hình 4.7 Ảnh hưởng 6-BA kết hợp với kinetin lên khả tạo chồi từ protocorm sau tuần nuôi cấy(ki=kinetin) 42 Hình 4.8 Ảnh hưởng α - NAA lên khả tạo rễ sau tuần nuôi cấy 44 Hình 4.9 Ảnh hưởng nồng độ nước dừa tới sinh trưởng in vitro 46 Hình 4.10 Ảnh hưởng giá thể đến sinh trưởng 51 viii TRÍCH YẾU LUẬN VĂN Tên tác giả: Bùi Thị Minh Tên Luận văn: "Nghiên cứu xây dựng quy trình nhân nhanh in vitro giống lan nhập nội hồng thảo Vôi đỏ (D.Jan Orinstein Red and White)” Ngành: Công nghệ sinh học Mã số: 60.42.02.01 Tên sở đào tạo: Học viện Nơng nghiệp Việt Nam Mục đích nghiên cứu Xây dựng quy trình nhân nhanh giống lan Hồng thảo Vơi đỏ phương pháp ni cấy mơ tế bào thực vật Phương pháp nghiên cứu Các thí nghiệm khởi tạo thể tiền chồi, nhân thể tiền chồi tạo hoàn chỉnh từ thể tiền chồi thử nghiệm đối tượng mẫu mẫu non, chồi đỉnh đoạn thân, môi trường khác bổ sung chất điều hòa sinh trưởng thực vật phụ gia nước dừa chuối xanh hàm lượng khác Mơi trường khống nuôi cấy sử dụng môi trường MS (Murashige and Skoog, 1962), VW (Vacine and Went, 1949) môi trường phù hợp cho nuôi cấy lan Các thành phần môi trường khác gồm: đường sucroza, vitamin, chuối xanh, nước dừa số chất điều hòa sinh trưởng nhóm auxin cytokinin với nồng độ thay đổi tùy theo mục đích thí nghiệm Mẫu non thí nghiệm tạo thể tiền chồi cấy đĩa petri (10 cm x cm), mẫu chồi đỉnh đoạn thân cấy vào ống nghiệm Mẫu thực vật thí nghiệm nhân thể tiền chồi tạo cấy vào bình tam giác 250 ml Mẫu thí nghiệm ni điều kiện 23±1 oC, chiếu sáng 16 h/ngày cường độ ánh sáng 2000-2500 lux giá đèn huỳnh quang không chiếu sáng tủ ni có điều khiển nhiệt độ ánh sáng Các thí nghiệm tối ưu hóa mơi trường khởi tạo thể tiền chồi, nhân thể tiền chồi tạo từ thể tiền chồi theo nguyên tắc tối ưu biến Mỗi thí nghiệm lặp lại lần số liệu thu được xử lý thống kê bảng tính Excel (Microsoft) phần mềm IRRISTAT 5.0 Kết kết luận 1.Sử dụng đoạn thân bánh tẻ làm vật liệu khởi đầu để tạo mẫu vô trùng cho hiệu tốt tỉ lệ mẫu sống tỉ lệ mẫu phát sinh hình thái ix mạnh Sở dĩ có điều in vitro nhạy cảm với yếu tố ngồi mơi trường, tác động nhỏ làm thay đổi trình sinh trưởng cây, trước thay đổi môi trường sống từ tối ưu phịng thí nghiệm mơi trường tự nhiên nhà lưới cần tạo điều kiện thích nghi tránh gây sốc cho 4.7.2 Nghiên cứu ảnh hưởng g thể đến s nh trưởng phát tr ển giai đoạn Hồng thảo Vơi Đỏ lồi sống khí sinh, hấp thụ dinh dưỡng qua thân, lá, nhiên giá thể cho thành phần quan trọng ảnh hưởng đến khả bén rễ phát triển cây, đặc biệt giai đoạn ngơi Giá thể nước có khả giữ ẩm tốt yêu cầu tiên để trồng lan Bên cạnh ngơi, rễ yếu, thành phần giá thể cần phù hợp để rễ đeo bám, chỗ dựa vững cho Nghiên cứu ảnh hưởng thành phần giá thể khác đến sinh trưởng phát triển Vôi đỏ giai đoạn con, thu kết trình bày bảng 4.15 Bảng 4.15 Ảnh hưởng giá thể đến rễ giai đoạn Đơn vị:cm CT Ngày rễ sau trồng (ngày) Vỏ thông Rong biển Than củi(ĐC) CV% LSD 5% - Tổng số rễ (sau tháng trồng) 14,2 11,7 8,6 3,2 2,25 Chiều dài rễ (Sau tháng trồng) 7,62 5,16 4,82 4,5 2,33 Đường kính rễ (Sau tháng trồng) 0,51 0,39 0,28 2,1 0,08 Các loại giá thể tham gia thí nghiệm ảnh hưởng rõ rệt đến khả rễ lan sau in vitro, cụ thể là: Ngày rễ sau trồng: Các cơng thức thí nghiệm có thời gian rễ từ 5- ngày sau trồng Trong cơng thức sử dụng rong biển có thời gian rễ ngắn (5 ngày), công thức sử dụng vỏ thơng có thời gian rễ dài (7 ngày) cơng thức sử dụng than củi có thời gian rễ dài (8 ngày) Cây sau in vitro có rễ yếu, lượng lơng hút nên khả hút nước Nhưng trồng giá thể khơng nước tốt bị úng, gây thối rễ Giá thể vỏ thơng vật liệu nước tốt giữ độ ẩm , đảm bảo lượng nước cung cấp 48 đủ cho từ kích thích phân hóa rễ nhanh so với loại giá thể khác tham gia thí nghiệm Tổng số rễ: Tuy công thức sử dụng vật liệu trồng rong biển làm xuất rễ sớm số lượng rễ có sau tháng trồng đạt 11,7 rễ, thấp đáng kể so công thức sử dụng giá thể vỏ thông (14,2 rễ) số rễ cơng thức trồng than củi (8,6 rễ) Các sai khác có ý nghĩa thống kê rõ rệt mức LSD 5% Sở dĩ có sai khác giá thể rong biển giữ nước tốt, ban đầu kích thích phân hóa rễ sớm loại vật liệu lại nước kém, hồng thảo Vơi Đỏ lồi lan khí sinh, ưa ẩm sợ úng, rễ mẫn cảm cao với độ ẩm giá thể Vỏ thông loại vật liệu chậm thấm nước giữ nước tốt đảm bảo trì độ thơng thống vừa phải cho rễ hô hấp Công thức đối chứng sử dụng vật liệu than củi người trồng lan áp dụng nhiều vật liệu rẻ, hạn chế chết úng lại thường xun bị khơ nước nhanh công thức phân hóa rễ diễn chậm số lượng rễ công thức khác - Kích thước rễ: Công thức sử dụng giá thể vỏ thông không cho số lượng rễ đạt nhiều mà cho kích thước rễ đạt tốt Cụ thể chiều dài rễ cơng thức đạt 7,62 cm, đường kính rễ đạt 0,51 cm cao mức ý nghĩa thống kê so với công thức sử dụng giá thể rong biển với chiều dài rễ đạt 5,15 cm, đường kính rễ đạt 0,39 cm cơng thức sử dụng than củi với chiều dài rễ 4,82 cm đường kính rễ đạt 0,28 cm Như vậy, rong biển loại giá thể giúp rễ sớm vỏ thông lại loại giá thể mà rễ in vitro sinh trưởng tốt Ở giai đoạn lan yếu mẫn cảm điều kiện sống thay đổi đột ngột, đặc biệt rễ cịn chưa phát triển hồn thiện với lượng lông hút thấp, khả hút giữ nước Khi sử dụng giá thể than củi cơng thức đối chứng, rễ chưa có khả đâm sâu, đeo bám để hút nước bên trong, rễ thường xuyên bị khô, thiếu nước, bổ sung nước việc tưới liên tục ảnh hưởng đến dễ phát sinh sâu bệnh Giá thể rong biển giữ nước tốt thoát nước kém, đầu rễ thường bị thối đặc biệt thời tiết ẩm ướt mùa xuân độ ẩm cao, rễ hô hấp nên sinh trưởng chậm Vỏ thông loại vật liệu chứa nhiều khoáng chất, giữ ẩm tốt đảm bảo thơng thống, giúp 49 ln trì độ ẩm, chất nhầy đầu rễ không bị khô tạo điều kiện cho rễ đâm sâu phát triển tốt Khi nghiên cứu tiếp ảnh hưởng giá thể đến tăng trưởng thân lan in vitro, thu kết bảng 4.16 Bảng 4.16 Ảnh hưởng giá thể đến tăng trưởng chiều cao đường kính thân giai đoạn Đơn vị: cm CT ngày sau trồng 60 ngày sau trồng CC CC ĐK ĐK 120 ngày sau 180 ngày sau trồng trồng CC ĐK 4,93 5,01 4,98 0,22 0,18 0,24 5,33 5,24 5,19 0,28 0,22 0,25 6,01 5,45 5,30 0,39 0,24 0,22 CV% - - 2,7 3,6 4,2 4,2 LSD 5% - - 1,72 0,31 1,86 0,17 Vỏ thông Rong biển Than củi (ĐC) CC ĐK Thân 7,98 0,55 5,82 0,29 5,76 0,32 4,4 5,2 4,6 3,2 4,6 3,2 2,05 0,22 0,52 Kết bảng 4.16 cho thấy loại loại giá thể tham gia thí nghiệm có ảnh hưởng khác đến tiêu đánh giá tăng trưởng chiều cao cây, đường kính thân số thân lan hồng thảo Vơi Đỏ - Về chiều cao cây: Sau 60 ngày trồng, chiều cao hai công thức sử dụng giá thể vỏ thông rong biển đạt 5,33 cm 5,24 cm, cao so với công thức sử dụng than củi (5,19 cm) Sau 120 ngày trồng, chiều cao công thức tăng trưởng mạnh giai đoạn trước, công thức dùng vỏ thông đạt chiều cao cao (6,01 cm), tiếp đến công thức sử dụng rong biển (5,45 cm), cuối công thức sử dụng than củi (5,30 cm) Có thể giải thích điều thời điểm thời tiết nắng ấm, nhiệt độ tăng cao thích hợp cho sinh trưởng mạnh, sai khác chiều cao giai đoạn thể rõ rệt công thức với mức ý nghĩa LSD0,05 Sau 180 ngày trồng công thức sử dụng giá thể vỏ thông cho chiều cao tăng vượt trội so với công thức khác (7,98 cm), cơng thức sử dụng rong biển có chiều đạt 5,82 cm công thức sử dụng than củi (đối chứng) chiều cao đạt 5,76 cm Về đường kính cây: Theo dõi tăng trưởng đường kính thu kết tương tự 50 tiêu chiều cao Sau 180 ngày bố trí thí nghiệm, cơng thức sử dụng giá thể vỏ thơng cho kết đường kính thân đạt cao (0,55 cm), tiếp đến công thức sử dụng giá thể than củi (0,32 cm) công thức sử dụng rong biển cho kết (1,73 cm) Sự sai khác đường kính thân cơng thức sau 180 ngày theo dõi có ý nghĩa mặt thống kê Về số thân mới: Hoàng thảo Vơi đỏ thuộc nhóm lan đa thân, sinh trưởng ln có xu hướng mọc thêm nhiều giả hành mới, cần theo dõi tăng trưởng liên tục để xác định thời điểm cần tách thay chậu cho Theo dõi số lượng thân mọc thêm sau 180 ngày trồng in vitro nhận thấy công thức sử dụng giá thể vỏ thông số thân mọc thêm nhiều (5,2 thân), công thức sử dụng rong biển 4,6 thân công thức đối chứng sử dụng giá thể than củi cho số lượng thân nhất, đạt 3,2 thân, thấp đáng kể so với công thức Như xét tiêu theo dõi sinh trưởng thân lan hồng thảo Vơi đỏ cho thấy giá thể vỏ thông cho kết tốt chiều cao cây, đường kính thân số lượng thân mới, tiếp đến giá thể rong biển, giá thể than củi cho kết Các sai khác công thức rõ rệt có ý nghĩ thống kê Rong biển Vỏ thơng Than củi Hình 4.10 Ảnh hưởng giá thể đến sinh trưởng 51 Sơ đồ quy trình nhân nhanh in vitro giống lan hồng thảo Vôi đỏ Mẫu đoạn thân mang mắt ngủ Khử trùng mẫu H2O2 15% phút HgCl2 0,1% 10 phút Mẫu in vitro Môi trường VW + 2mg/l 6-BA + 30g/l đường + 10% chuối xanh + 10% nước dừa + 0,5g/l than hoạt tính + 5,5g agar, pH = 5,8 Tạo protocorm Môi trường VW + 2mg/l 6-BA + 0,2 mg/l kinetin + 30g/l đường + 10% chuối xanh + 10% nước dừa + 0,5g/l than hoạt tính + 5,5g agar, pH = 5,8 Nhân nhanh protocorm Môi trường tái sinh: VW + 0,5mg/l 6-BA + 0,2 mg/l kinetin + 0,2 mg/l GA3 + 30g/l đường + 10% chuối xanh + 10% nước dừa + 0,5g/l than hoạt tính + 5,5g agar, pH = 5,8 Môi trường rễ: VW + 0,6mg/l NAA+ 30g/l đường + 10% chuối xanh + 10% nước dừa + 0,5g/l than hoạt tính + 5,5g agar, pH = 5,8 Tái sinh từ protocorm tạo hoàn chỉnh Để bình hành lang ngày sau mang ngồi nhà lưới mở nắp bình ngày trồng giá thể vỏ thông Ra 52 PHẦN KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 5.1 KẾT LUẬN 1.Sử dụng đoạn thân bánh tẻ làm vật liệu khởi đầu để tạo mẫu vô trùng cho hiệu tốt tỉ lệ mẫu sống tỉ lệ mẫu phát sinh hình thái Sử dụng kết hợp chất khử trùng H2O2 15% phút HgCl2 0,1% 10 phút mang lại hiệu khử trùng cao 2.Môi trường VW + 2mg/l 6-BA + 30g/l đường + 10% chuối xanh + 10% nước dừa + 0,5g/l than hoạt tính + 5,5g agar, pH = 5,8 mơi trường thích hợp để tạo protocorm Mơi trường VW + 2mg/l 6-BA + 0,2 mg/l kinetin + 30g/l đường + 10% chuối xanh + 10% nước dừa + 0,5g/l than hoạt tính + 5,5g agar, pH = 5,8 mơi trường thích hợp để nhân nhanh protocorm 3.Mơi trường VW + 0,5mg/l 6-BA + 0,2 mg/l kinetin + 0,2 mg/l GA3 + 30g/l đường + 10% chuối xanh + 10% nước dừa + 0,5g/l than hoạt tính + 5,5g agar, pH = 5,8 mơi trường thích hợp để tái sinh Môi trường VW + 0,6mg/l NAA+ 30g/l đường + 10% chuối xanh + 10% nước dừa + 0,5g/l than hoạt tính + 5,5g agar, pH = 5,8 mơi trường thích hợp để rễ tốt 4.Trước ngơi để bình hành lang ngày sau mang ngồi nhà lưới mở nắp bình ngày cho tỷ lệ sống cao (82,52%) Chiều cao 5-6 cm thích hợp để đưa vườn ươm 5.Vỏ thông giá thể tốt sử dụng để vườn ươm Cho thời gian rễ nhanh (7 ngày), kích thước to đạt chiều dài 7,62cm đường kính 0,51cm sau tháng trồng 5.2 KIẾN NGHỊ Kết nghiên cứu đề tài ứng dụng triển khai vào nhân nhanh giống lan hồng thảo Vơi đỏ in vitro để cung cấp giống đáp ứng nhu cầu tiêu dùng nước Mặc dù đề tài thu số kết định nhân nhanh hồng thảo Vơi đỏ nhiên cần tiến hành thêm số thí nghiệm tiêu theo dõi ảnh hưởng khoáng chất vi lượng, chất điều tiết sinh trưởng đến phát sinh hình thái mẫu, tái tạo sinh trưởng để hoàn thiện quy trình nhân nhanh in vitro giống lan 53 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt: Dương Công Kiên (2002) Nuôi cấy mô thực vật Nhà xuất Đại học quốc gia TP Hồ Chí Minh Đỗ Năng Vịnh (2002) Công nghệ sinh học trồng ứng dụng NXB Nông nghiệp – Hà nội Đỗ Năng Vịnh (2005) Công nghệ tế bào thực vật ứng dụng Nxb Nông nghiệp Hà Nội Nguyễn Công Nghiệp (2000) Trồng hoa lan Nhà xuất Trẻ Tp Hồ Chí Minh Nguyễn Nghĩa Thìn (1997) Cẩm nang nghiên cứu đa dạng sinh vật - Manual on research of biodiversity Nhà xuất Nơng nghiệp Nguyễn Quang Thạch Hồng Thị Nga (2005) Nghiên cứu ứng dụng phương pháp nuôi cấy lát mỏng nhân nhanh giống Vanda Cattleya Phalaenopsis Tạp chí Nơng nghiệp Cơng nghiệp Thực phẩm số 12 tr: 550552 Nguyễn Tiến Bân ( chủ biên) (2005) Danh lục loài thực vật Việt Nam tập Nhà xuất Nông nghiệp Hà Nội Nguyễn Thiện Tịch cộng (2006) Kỹ thuật nuôi trồng hoa lan NXB Nông nghiệp Thành phố Hồ Chí Minh Nguyễn Thị Sơn Từ Bích Thủy (2014) Nhân giống in vitro la dendrobium officinale kimura et migo Tạp chí khoa học phát triển tập 12 số 8- 2014 10 Phạm Hoàng Hộ (1993) Cây cỏ miền nam Việt Nam 2.3 Bộ Giáo dục Hà Nội 11 Trần Duy Quý (2005) Sổ tay người Hà Nội chơi Lan NXB Nông nghiệp 12 Trần Hợp (1990 2000) Phong lan Việt Nam Nhà xuất Khoa học kỹ thuật Hà Nội 13 Trần Văn Minh (1999) Giáo trình Cơng nghệ sinh học thực vật viện sinh học nhiệt đới Tạp chí phát triển KH & CN tập số - 2006 14 Việt Chương (2002) Kỹ thuật kinh doanh phong lan 15 Vũ văn Vụ (1997) Sinh lý thực vật NXB Giáo dục, Hà Nội Tiếng nước ngoài: 16 Chen JT Chang C Chang WC (1999) Direct embryogenesis from leaf explants 54 of Oncidium “Gower Ramsey” and subsequent plant regeneration Plant cell Rep 17:251-255 17 Jaime A Teixeira da Silva* 2013: “Orchids: Advances in Tissue Culture Genetics Phytochemistry and Transgenic Biotechnology” 18 Leonid V.Averaging (2003) Update checklist of the orchids of Viet Nam Viet Nam National University Publising House Ha Noi 19 Morel GM (1960) Producing virus-free cymbidiums American Orchid Society Bulletin 29 pp 495-497 20 Morel GM (1964) Tissue culture – a new means of clonal propagation of 21 orchids American Orchid Society Bulletin 33 473-478 22 Murashige T and F Skoog (1962).Arevired medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures plant physiology 15: 473 - 497 23 So-Young Park Hosakatte N Murthy and Kee-Yoeup Paek (2001) “Rapid production of Phalaenopsis from Floral Stalk-derived leaves” In Vitro Cell Dev Biol-Plant 38 pp 168-172 24 Vacin E F and F W Went (1949) “Some pH change in nutrient solutions” Bot Gaz 110 pp 605 - 613 Tài liệu internet: 25 http://orchidspecies.com/ 26 Bùi Xuân Đáng (2005) tìm hiểu http://www.hoalanVietnam.org/author/post/1/1/bui-xuan-dang 27 Hoa lan Việt Nam 18/12/2006 http://www:rauhoaquavietnam.vn/ 28 Phát huy tiềm xuất phong lan Việt Nam 04/07/2009 http://lantaynguyen.Wordpress.com/2009/07/04/phat-huy-tiêm-nằng-xuât-khâu- hoa lan phong-lan-cua-Viêt-Nạm 29 Tháng 09/08 kim ngạch xuất phong lan tăng mạnh 07/11/2008 http://rauhoaquavietnam.vn/default.aspk?tabID=5&ID=11&LangID=1&NewsID= 4504 55 PHỤ LỤC Bảng thành phần môi trường nuôi cấy Thành phần MT 1/2MS(mg/l) WV (mg/l) WV1(mg/l) WV2 (mg/l) KNO3 950.0 525.0 1050.0 1050.0 NH4NO3 802.5 802.5 1605 1605 500.0 500.0 500.0 (NH4)2SO4 KH2PO4 85.0 250.0 250.0 250.0 MgSO4.7H2O 185.0 250.0 250.0 250.0 CaCL2.2H2O 220.0 200.0 200.0 200.0 37.26 37.26 37.26 7.5 7.5 7.5 28.0 28.0 28.0 Ca3(PO4)2 Na2EDTA 18.65 FeSO4 7H2O 13.9 CoCL2 6H2O 0.0125 CuSO4.5H2O 0.0125 H3BO3 3.1 KI 0.415 MnSO4.4H2O 11.15 Na2MoO2.2H2O 0.125 ZnSO4.7H2O 4.3 Ferric tartrate Thiamin 0.05 0.05 Nicotinic axit 0.25 0.25 Pyridoxin 0.25 0.25 Myo Inositol 50.0 50.0 Glicin 1.0 1.0 Đường sacroza 30.0 30.0 56 30.0 30.0 Kết xử lý số liệu BALANCED ANOVA FOR VARIATE HSN FILE B44 13/ 4/17 20:46 :PAGE Bang 4.5 anh huong cua cac loai moi truong toi kha nang tao protocorm VARIATE V003 HSN LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= CT$ 5.60250 1.86750 ****** 0.000 * RESIDUAL 240077E-02 300097E-03 * TOTAL (CORRECTED) 11 5.60490 509536 TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE B44 13/ 4/17 20:46 :PAGE Bang 4.5 anh huong cua cac loai moi truong toi kha nang tao protocorm MEANS FOR EFFECT CT$ -CT$ NOS 3 3 HSN 2.90000 1.30000 1.60000 1.60000 SE(N= 3) 0.100016E-01 5%LSD 8DF 0.326142E-01 -ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE B44 13/ 4/17 20:46 :PAGE Bang 4.5 anh huong cua cac loai moi truong toi kha nang tao protocorm F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL SECTION - VARIATE OBS HSN GRAND MEAN STANDARD DEVIATION C OF V |CT$ (N= 12) SD/MEAN | NO BASED ON BASED ON % | TOTAL SS RESID SS | | 12 1.7250 0.71382 0.17323E-01 1.0 0.0000 | | | ALANCED ANOVA FOR VARIATE HSN FILE B47 13/ 4/17 21: :PAGE bang 4.7 anh huong cua 6-BA toi kha nang nhan protocorm VARIATE V003 HSN LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= CT$ 6.53460 1.30692 ****** 0.000 * RESIDUAL 12 120108E-02 100090E-03 * TOTAL (CORRECTED) 17 6.53580 384459 - 57 TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE B47 13/ 4/17 21: :PAGE bang 4.7 anh huong cua 6-BA toi kha nang nhan protocorm MEANS FOR EFFECT CT$ -CT$ NOS 3 3 3 HSN 1.32000 2.10000 3.30000 2.57000 2.30000 2.19000 SE(N= 3) 0.577610E-02 5%LSD 12DF 0.512981E-01 -ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE B47 13/ 4/17 21: :PAGE bang 4.7 anh huong cua 6-BA toi kha nang nhan protocorm F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL SECTION - VARIATE OBS HSN GRAND MEAN STANDARD DEVIATION C OF V |CT$ (N= 18) SD/MEAN | NO BASED ON BASED ON % | TOTAL SS RESID SS | | 18 2.3500 0.42005 0.10004E-01 0.4 0.0000 | | | BALANCED ANOVA FOR VARIATE HSN FILE B49 13/ 4/17 21:14 :PAGE bang 4.9 anh huong cua 6-BA toi kha nang tai sinh va nhan choi tu protocorm VARIATE V003 HSN LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= CT$ 8.48769 1.69754 ****** 0.000 * RESIDUAL 12 266681E-02 222234E-03 * TOTAL (CORRECTED) 17 8.49036 499433 TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE B49 13/ 4/17 21:14 :PAGE bang 4.9 anh huong cua 6-BA toi kha nang tai sinh va nhan choi tu protocorm MEANS FOR EFFECT CT$ -CT$ NOS 3 3 HSN 1.05000 0.89000 1.46333 2.13000 2.82000 58 3.11000 SE(N= 3) 0.860686E-02 5%LSD 12DF 0.624207E-01 -ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE B49 13/ 4/17 21:14 :PAGE bang 4.9 anh huong cua 6-BA toi kha nang tai sinh va nhan choi tu protocorm F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL SECTION - VARIATE OBS HSN GRAND MEAN STANDARD DEVIATION C OF V |CT$ (N= 18) SD/MEAN | NO BASED ON BASED ON % | TOTAL SS RESID SS | | 18 2.2872 1.20671 0.14908E-01 0.7 0.0000 | | | BALANCED ANOVA FOR VARIATE HSN FILE B410 13/ 4/17 20:40 :PAGE Bang 4.10 anh huong cua 6-BA kinetin toi kha nang tai sinh va nhan choi tu protocorm VARIATE V003 HSN LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= CT$ 7.81529 1.56306 ****** 0.000 * RESIDUAL 12 933703E-03 778086E-04 * TOTAL (CORRECTED) 17 7.81623 459778 TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE B410 13/ 4/17 20:40 :PAGE Bang 4.10 anh huong cua 6-BA kinetin toi kha nang tai sinh va nhan choi tu protocorm MEANS FOR EFFECT CT$ -CT$ NOS 3 3 3 HSN 1.25000 2.78333 4.20000 2.62000 2.43000 2.05333 SE(N= 3) 0.509276E-02 5%LSD 12DF 1.223925E-01 -ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE B410 13/ 4/17 20:40 :PAGE Bang 4.10 anh huong cua 6-BA kinetin toi kha nang tai sinh va nhan choi tu protocorm F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL SECTION - 59 VARIATE GRAND MEAN STANDARD DEVIATION C OF V |CT$ (N= 18) SD/MEAN | NO BASED ON BASED ON % | TOTAL SS RESID SS | | 18 2.3961 0.41807 0.88209E-02 0.4 0.0000 OBS HSN | | | BALANCED ANOVA FOR VARIATE CDL FILE B14 27/ 4/17 10:54 :PAGE Bang 4.13 anh huong cua nuoc dua toi sinh truong cua cay in vitro VARIATE V003 CDL LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= NL 166667E-02 833336E-03 0.01 0.991 * RESIDUAL 767500 852778E-01 * TOTAL (CORRECTED) 11 769167 699242E-01 BALANCED ANOVA FOR VARIATE CRL FILE B14 27/ 4/17 10:54 :PAGE Bang 4.13 anh huong cua nuoc dua toi sinh truong cua cay in vitro VARIATE V004 CRL LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= NL 116667E-01 583333E-02 0.27 0.772 * RESIDUAL 195000 216667E-01 * TOTAL (CORRECTED) 11 206667 187879E-01 BALANCED ANOVA FOR VARIATE CDR FILE B14 27/ 4/17 10:54 :PAGE Bang 4.13 anh huong cua nuoc dua toi sinh truong cua cay in vitro VARIATE V005 CDR LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= NL 616666E-01 308333E-01 0.15 0.860 * RESIDUAL 1.80500 200556 * TOTAL (CORRECTED) 11 1.86667 169697 TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE B14 27/ 4/17 10:54 :PAGE Bang 4.13 anh huong cua nuoc dua toi sinh truong cua cay in vitro MEANS FOR EFFECT NL -NL NOS 4 SE(N= 4) CDL 1.23000 1.57000 1.42400 CRL 0.620000 0.605000 0.575000 0.146012 CDR 2.76500 2.85500 3.34000 0.735980E-01 0.223917 60 5%LSD 9DF 0.467100 0.235444 0.776324 -ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE B14 27/ 4/17 10:54 :PAGE Bang 4.13 anh huong cua nuoc dua toi sinh truong cua cay in vitro F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL SECTION - VARIATE CDL CRL CDR GRAND MEAN (N= 12) NO OBS 12 1.1417 12 0.53333 12 2.9333 STANDARD DEVIATION C OF V |NL SD/MEAN | BASED ON BASED ON % | TOTAL SS RESID SS | 0.62443 0.29202 25.6 0.9913 1.33707 0.14720 27.6 0.7721 0.71194 0.44783 15.3 0.8598 | | | | BALANCED ANOVA FOR VARIATE TSR FILE BANG 4.15 20/ 84/17 12: :PAGE Phuong sai ANOVA cho thi nghiem thiet ke hoan toan ngau nhien VARIATE V003 TSR LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= NL 201556E-01 100778E-01 0.07 0.935 CT$ 47.2200 23.6100 160.09 0.001 * RESIDUAL 589905 147476 * TOTAL (CORRECTED) 47.8301 5.97876 BALANCED ANOVA FOR VARIATE DKR FILE BANG 4.15 20/ 4/17 12: :PAGE Phuong sai ANOVA cho thi nghiem thiet ke hoan toan ngau nhien VARIATE V004 CDR LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= NL 466666E-03 233333E-03 0.40 0.696 CT$ 794000E-01 397000E-01 68.06 0.002 * RESIDUAL 233333E-02 583332E-03 * TOTAL (CORRECTED) 822000E-01 102750E-01 -BALANCED ANOVA FOR VARIATE CDR FILE BANG 4.15 20/ 4/17 12: :PAGE Phuong sai ANOVA cho thi nghiem thiet ke hoan toan ngau nhien VARIATE V005 DKR LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= NL 289267 144633 7.33 0.047 CT$ 14.0072 7.00360 354.91 0.000 * RESIDUAL 789334E-01 197334E-01 * TOTAL (CORRECTED) 14.3754 1.79692 TABLE OF MEANS FOR FACTORIALEFFECTS FILE BANG 4.15 20/ 4/17 12: :PAGE MEANS FOR EFFECT NL 61 NL NOS TSR 3 DKR 13.4556 12.5656 11.4789 CDR 0.383333 0.400000 0.086667 5.80667 5.68333 2.33000 SE(N= 3) 0.221718 0.139443E-01 0.811035E-01 5%LSD 4DF 2.249086 0.086587E-01 2.337908 -MEANS FOR EFFECT CT$ -CT$ NOS TSR DKR CDR CT1 14.2000 0.510000 7.62000 CT2 11.7000 0.390000 5.16000 CT3 8.60000 0.280000 4.82000 SE(N= 3) 0.221718 0.139443E-01 0.811035E-01 5%LSD 4DF 2.249086 0.086587E-01 2.337908 -ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE BANG 4.15 20/ 4/17 12: :PAGE F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL SECTION - VARIATE OBS TSR DKR CDR GRAND MEAN STANDARD DEVIATION C OF V |NL |CT$ (N= 9) SD/MEAN | | NO BASED ON BASED ON % | | TOTAL SS RESID SS | | | 11.500 2.4451 0.38403 3.2 0.9348 0.0007 0.39333 0.10137 0.24152E-01 2.1 0.6963 0.0018 5.8667 1.3405 0.14048 4.5 0.0475 0.0003 62 | | | ... nghiên cứu đề tài: ? ?Nghiên cứu xây dựng quy trình nhân nhanh in vitro giống lan hồng thảo Vơi Đỏ (Dendrobium Jan Orinstein red and white) 18 PHẦN ĐỐI TƯỢNG, VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN... hồng thảo Vơi đỏ (D .Jan Orinstein Red and White) ” Ngành: Công nghệ sinh học Mã số: 60.42.02.01 Tên sở đào tạo: Học viện Nông nghiệp Việt Nam Mục đích nghiên cứu Xây dựng quy trình nhân nhanh giống. .. nguồn giống từ nước ngồi, đồng thời góp phần đa dạng nguồn gen in vitro giống hoa lan, tiến hành đề tài "Nghiên cứu xây dựng quy trình nhân nhanh in vitro giống lan nhập nội hồng thảo Vơi đỏ D.jan