Nghiên cứu một số đặc điểm dịch tễ học của bệnh lở mồm long móng ở việt nam giai đoạn 2016 2018 luận văn thạc sĩ nông nghiệp

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM NGUYỄN THỊ LAN HƯƠNG NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM DỊCH TỄ HỌC CỦA BỆNH LỞ MỒM LONG MÓNG Ở VIỆT NAM GIAI ĐOẠN 2016 - 2018 Ngành: Thú y Mã số: 8640101 Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS Nguyễn Bá Hiên TS Nguyễn Văn Long NHÀ XUẤT BẢN HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP - 2019 LỜI CAM ĐOAN Tôi cam đoan công trình nghiên cứu tơi, kết nghiên cứu trình bày luận văn trung thực, khách quan chưa dùng để bảo vệ lấy học vị Tôi cam đoan giúp đỡ cho việc thực luận văn cảm ơn, thơng tin trích dẫn luận văn rõ nguồn gốc Hà Nội, ngày tháng năm 2019 Tác giả luận văn Nguyễn Thị Lan Hương i LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành luận văn này, ngồi cố gắng thân, tơi ln nhận quan tâm giúp đỡ quan, tổ chức, nhà khoa học, thầy cô giáo, bạn bè đồng nghiệp người thân gia đình Trước tiên, tơi xin chân thành cảm ơn Ban Lãnh đạo Cục Thú y, Phòng chức năng, đơn vị liên quan thuộc Cục Thú y địa phương tạo điều kiện thuận lợi, giúp đỡ, động viên cho phép tham gia triển khai, sử dụng số liệu, kết chương trình, dự án có liên quan Tơi bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc hướng dẫn có trách nhiệm hết lịng khoa học PGS.TS Nguyễn Bá Hiên Tiến sĩ Nguyễn Văn Long Nhân dịp này, trân trọng cảm ơn giúp đỡ Ban Quản lý đào tạo Bộ môn Vi sinh vật Truyền nhiễm, Khoa Thú y, Học viện Nơng nghiệp Việt Nam tận tình giúp đỡ tơi suốt thời gian học tập hoàn thành luận văn Học viện Tơi bày tỏ lịng biết ơn chân thành tới Quý thầy cô, quan, nhà khoa học đồng nghiệp giúp đỡ suốt thời gian qua Tôi xin gửi lời cảm ơn tới người thân gia đình ln quan tâm, động viên giúp tơi hồn thành luận văn Hà Nội, ngày tháng năm 2019 Tác giả luận văn Nguyễn Thị Lan Hương ii MỤC LỤC Lời cam đoan i Lời cảm ơn ii Mục lục iii Danh mục chữ viết tắt vi Danh mục bảng vii Danh mục đồ thị, hình viii Trích yếu luận văn ix Thesis abstract xi Phần Mở đầu 1.1 Tính cấp thiết đề tài 1.2 Mục tiêu đề tài 1.3 Phạm vi nghiên cứu 1.4 Những đóng góp mới, ý nghĩa khoa học thực tiễn Phần Tổng quan tài liệu 2.1 Thông tin chung bệnh LMLM 2.2 Một số nghiên cứu bệnh LMLM 2.2.1 Tình hình nghiên cứu bệnh LMLM giới khu vực 2.2.2 Tình hình nghiên cứu bệnh LMLM Việt Nam 2.3 Tình hình dịch bệnh LMLM 2.3.1 Tình hình dịch bệnh LMLM giới khu vực 2.3.2 Tình hình dịch bệnh LMLM Việt Nam 2.4 Vi rút gây bệnh LMLM 2.4.1 Hình thái vi rút LMLM 2.4.2 Cấu trúc vi rút LMLM 2.4.3 Các serotype vi rút LMLM 10 2.4.4 Đặc tính ni cấy vi rút LMLM 12 2.4.5 Sức đề kháng vi rút LMLM 13 2.5 Một số đặc điểm bệnh LMLM 14 2.5.1 Loài vật mắc bệnh 14 2.5.2 Triệu chứng, bệnh tích 14 2.5.3 Cơ chế sinh bệnh 16 iii 2.5.4 Phương thức truyền lây 17 2.5.5 Đường xâm nhập 18 2.5.6 Tình trạng mang trùng 19 2.6 Các phương pháp chẩn đoán bệnh 20 2.6.1 Chẩn đoán lâm sàng 20 2.6.2 Chẩn đoán vi rút học 20 2.6.3 Chẩn đoán huyết học 21 2.6.4 Chẩn đoán kỹ thuật RT-PCR 23 2.7 Một số phương pháp nghiên cứu dịch tễ học 23 2.7.1 Nghiên cứu cắt ngang (cross-sectional study) 23 2.7.2 Nghiên cứu tập (cohort study) 24 Phần Vật liệu phương pháp nghiên cứu 26 3.1 Địa điểm nghiên cứu 26 3.2 Thời gian nghiên cứu 26 3.3 Đối tượng vật liệu nghiên cứu 26 3.3.1 Đối tượng nghiên cứu 26 3.3.2 Vật liệu nghiên cứu 26 3.4 Nội dung nghiên cứu 27 3.5 Phương pháp nghiên cứu 27 3.5.1 Phương pháp dịch tễ học hồi cứu (retrospective cohort study) 27 3.5.2 Phương pháp giải trình tự gien 28 3.5.3 Đánh giá mức độ tương đồng kháng nguyên kháng nguyên vắc xin kháng nguyên vi rút thực địa 29 3.5.4 Phương pháp đánh giá đáp ứng miễn dịch sau tiêm phòng vắc xin LMLM trâu, bò số tỉnh 30 3.6 Quản lý phân tích số liệu 31 Phần Kết thảo luận 32 4.1 Một số đặc điểm dịch tễ học bệnh LMLM Việt Nam giai đoạn từ năm 2016 - 2018 32 4.1.1 Các loài gia súc mắc bệnh LMLM 32 4.1.2 Tỷ lệ gia súc chết bệnh LMLM 34 4.1.3 Đặc điểm dịch tễ học theo thời gian xuất ổ dịch LMLM 35 iv 4.1.4 Đặc điểm dịch tễ theo không gian ổ dịch LMLM 40 4.2 Đặc điểm dịch tễ học phân tử vi rút LMLM lưu hành Việt Nam giai đoạn từ năm 2016 - 2018 50 4.2.1 Kết xác định topotype lineage vi rút LMLM Việt Nam, giai đoạn từ năm 2016 - 2018 50 4.2.2 Đánh giá mức độ tương đồng kháng nguyên vi rút vắc xin vi rút lưu hành Việt Nam giai đoạn từ năm 2016 - 2018 57 4.3 Đánh giá đáp ứng miễn dịch sau tiêm phòng vắc xin LMLM trâu, bò số địa phương năm 2018 60 Phần Kết luận kiến nghị 65 5.1 Kết luận 65 5.2 Kiến nghị 65 Tài liệu tham khảo 67 Phụ lục 76 v DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Nghĩa tiếng Việt BHK Baby Hamster Kidney CFT Complement Fixation Test CI Confidence Interval DNA Deoxyribonucleic Acid EDR Estimated Dissemination Ratio ELISA Enzyme Linked Immuno-Sorbent Assay FAO Food and Agriculture Organization of the United Nations FMD Foot and Mouth Disease LMLM Lở mồm long móng LPB-ELISA Liquid Phase Blocking-ELISA MDBK Madin-Darby Bovine Kidney NCBI National Center for Biotechnology Information NN&PTNT Nông nghiệp Phát triển nông thôn OIE World Organisation for Animal Health PBS Phosphate Buffer Saline PI Percent Inhibition RNA Ribonucleic Acid RT-PCR Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction r1 Antigenic relationship TCID50 50% Tissue Culture Infectious Dose TCVN Tiêu chuẩn Việt Nam USD US Dollar WRL World Reference Laboratory WTO World Trade Organization vi DANH MỤC BẢNG Bảng 4.1 Tỷ lệ gia súc mắc bệnh LMLM, giai đoạn từ năm 2016 - 2018 32 Bảng 4.2 Tỷ lệ loài gia súc chết bệnh LMLM, giai đoạn 2016 - 2018 34 Bảng 4.3 Nguy dịch bệnh LMLM theo vùng địa lý, giai đoạn từ năm 2016 2018 40 Bảng 4.4 Nguy xuất dịch LMLM tỉnh Đồng sông Hồng, Đông Bắc Bộ Tây Bắc Bộ, giai đoạn 2016 - 2018 43 Bảng 4.5 Nguy xuất dịch LMLM tỉnh Bắc Trung Bộ Nam Trung Bộ, giai đoạn 2016 – 2018 45 Bảng 4.6 Nguy xuất dịch LMLM tỉnh Tây nguyên, Đông Nam Bộ Đồng sông Cửu Long, giai đoạn 2016 - 2018 46 Bảng 4.7 Các vi rút LMLM phân lập Việt Nam, giai đoạn từ năm 2016 2018 51 Bảng 4.8 Kết đánh giá tương đồng kháng nguyên vắc xin vi rút LMLM type O lưu hành Việt Nam giai đoạn từ năm 2016 - 2018 58 Bảng 4.10 Kết giám sát huyết trâu, bò tiêm vắc xin LMLM năm 2018 số địa phương 61 vii DANH MỤC ĐỒ THỊ, HÌNH Hình 2.1 Bản đồ gien cấu trúc vi rút LMLM Hình 2.2 Bản đồ phân bố chủng vi rút LMLM giới, giai đoạn từ năm 2014 - 2018 11 Hình 2.3 Triệu chứng, bệnh tích bệnh LMLM trâu, bò 15 Hình 2.4 Sơ đồ mơ tả nghiên cứu cắt ngang 24 Hình 2.5 Sơ đồ mô tả nghiên cứu tập hồi cứu tịnh tiến 25 Hình 4.1 Biểu đồ dịch tễ dịch LMLM xảy giai đoạn 2016 - 2018 35 Hình 4.2 Biểu đồ dịch tễ ổ dịch LMLM xảy năm 2016 36 Hình 4.3 Biểu đồ dịch tễ ổ dịch LMLM xảy năm 2017 36 Hình 4.4 Biểu đồ dịch tễ ổ dịch LMLM xảy năm 2018 37 Hình 4.5 Tỷ lệ lây lan ước tính (EDR) dịch LMLM tính cho năm 2018 so với số lượng ổ dịch thực tế xảy 38 Hình 4.6 Bản đồ phân bố ổ dịch LMLM xảy từ năm 2016 - 2018 42 Hình 4.7 Bản đồ phân bố không gian dịch LMLM năm 2018 50 Hình 4.8 Bản đồ phân bố vi rút LMLM lưu hành Việt Nam, giai đoạn 2016 - 2018 51 Hình 4.9 Phả hệ vùng gien VP1 vi rút LMLM O/SEA/Mya-98 phân lập Việt Nam (do Phịng thí nghiệm tham chiếu OIE Pirbright, Vương quốc Anh phân tích) 53 Hình 4.10 Phả hệ vi rút LMLM serotype O dòng PanAsia phân lập Việt Nam (do Phịng thí nghiệm tham chiếu OIE Pirbright, Vương quốc Anh phân tích) 55 Hình 4.11 Phả hệ vi rút LMLM serotype A/ASIA/Sea-97 phân lập Việt Nam (do Phịng thí nghiệm tham chiếu OIE Pirbright, Vương quốc Anh phân tích) 56 viii TRÍCH YẾU LUẬN VĂN Tên tác giả: Nguyễn Thị Lan Hương Tên Luận văn: Nghiên cứu số đặc điểm dịch tễ học bệnh Lở mồm long móng Việt Nam giai đoạn 2016 - 2018 Ngành: Thú y Mã số: 8640101 Tên sở đào tạo: Học viện Nông nghiệp Việt Nam Mục đích nghiên cứu: Xác định mối quan hệ ảnh hưởng yếu tố không gian, thời gian đến tần suất phân bố ổ dịch LMLM, type topotype vi rút LMLM lưu hành gây bệnh gia súc Việt Nam, làm sở cho chương trình phịng, chống dịch LMLM cho địa phương cho nước Phương pháp nghiên cứu Luận văn sử dụng phương pháp dịch tễ học hồi cứu (retrospective cohort study) để tổng hợp phân tích đặc điểm dịch tễ không gian, thời gian đối tượng gia súc mắc bệnh LMLM từ năm 2016 - 2018; phương pháp dịch tễ học phân tử, phân tích tương đồng kháng nguyên để hiểu rõ đặc điểm vi rút LMLM vắc xin phòng bệnh; phương pháp LPB-ELISA để đánh giá sau tiêm phòng vắc xin Kết kết luận - Về khơng gian: Nguy trung bình xã có bệnh LMLM 5,95 (95% CI 5,51 - 6,39) xã có dịch/100 xã-năm Dịch LMLM xuất tập trung tỉnh Bắc Bộ, Tây Nguyên Nam Trung Bộ - Về thời gian: Bệnh LMLM xảy hầu hết tháng năm giai đoạn từ năm 2016 - 2018, trầm trọng vào 02 tháng cuối năm 2018 - Về đối tượng mắc bệnh: Bị có tỷ lệ mắc bệnh cao nhất, sau đến lợn, trâu lồi gia súc khác; lợn có tỷ lệ chết cao nhất, đặc biệt vào cuối năm 2018 - Vi rút LMLM lưu hành Việt Nam giai đoạn từ năm 2016 - 2018 thuộc serotype O (Mya-98, Cathay, PanAsia Ind -2001d, e) serotype A (Sea97) Vi rút O/SEA/Mya-98 O/Cathay lưu hành gây bệnh lợn không tương đồng kháng nguyên với loại kháng nguyên O1Manisa O3039 có vắc xin LMLM; vắc xin chứa kháng nguyên A22 Iraq có tương đồng cao với vi rút LMLM A/ASIA/Sea-97 (r1 > 0,3) ix PHỤ LỤC PHỤ LỤC 01 QUY TRÌNH XÉT NGHIỆM THEO QUY ĐỊNH TẠI TCVN 8400-1:2010, BỆNH ĐỘNG VẬT - QUY TRÌNH CHẨN ĐỐN - PHẦN 1: BỆNH LỞ MỒM LONG MĨNG Nguyên tắc Sử dụng kit ELISA phát kháng thể lở mồm long móng gia súc Dùng để định typ vi rút gia súc chưa tiêm phịng mà có kháng thể lở mồm long móng tự nhiên dương tính dùng để đánh giá hiệu giá kháng thể sau tiêm phòng vắc xin lở mồm long móng Dựa nguyên tắc phản ứng Sandwich ELISA gián tiếp phát định typ huyết kháng thể lở mồm long móng Phản ứng thực đĩa đáy bằng, 96 lỗ Các bước tiến hành + Gắn đĩa (coating): Kháng huyết thỏ kháng vi rút lở mồm long móng pha loãng 1:1000 với coating dung dịch đệm, nhỏ 50 ml/giếng Đậy nắp, ủ lắc nhiệt độ 37°C/1 h ủ qua đêm 4°C + Chuẩn bị hỗn hợp kháng nguyên-huyết (liquid phase blocking), nhỏ vào đĩa nhựa polypropylen 96 giếng đáy chữ U: ++ Huyết đối chứng kiểm tra pha loãng 1:16 với dung dịch đệm A, 50 ml/giếng ++ Kháng nguyên pha loãng theo tỷ lệ cho trước, 50 ml/giếng + Hỗn hợp ủ qua đêm 4°C + Rửa đĩa ELISA lần dung dịch rửa PBS 0,002 M + Chuyển 50 ml hỗn hợp kháng nguyên-huyết từ đĩa chữ U sang đĩa ELISA theo vị trí tương ứng Đậy nắp, ủ lắc nhiệt độ 37°C/1 h + Rửa lần dung dịch rửa PBS 0,002M + Nhỏ kháng thể phát hiện: Kháng huyết chuột lang kháng vi rút LMLM pha loãng 1:100 với dung dịch đệm B, 50 ml/giếng Đậy nắp, ủ lắc nhiệt độ 37°C/1 h + Rửa lần dung dịch rửa PBS 0,002 M + Nhỏ chất gắn kết: pha loãng 1:200 với dung dịch đệm B, 50 ml/giếng Đậy nắp, ủ lắc nhiệt độ 37°C/40 phút 76 + Rửa lần dung dịch rửa PBS 0,002 M + Nhỏ chất chromogen (dung dịch chromogen + 5% chất): 50 ml/giếng, để 20 phút nhiệt độ phòng, chỗ tối + Dừng phản ứng: nhỏ 50 ml/giếng dung dịch H2SO4 1,25 M Đọc kết Sử dụng máy đọc ELISA, kính lọc 492 nm Sử dụng phần mềm edi để tính PI (phần trăm ức chế) Nếu PI ≥ 50 mẫu coi dương tính, huyết có kháng thể LMLM CHÚ Ý: Xác định hiệu giá kháng thể, mẫu huyết pha sau: - Huyết kiểm tra: Pha loãng theo tỷ lệ 1:8 - Nhỏ dung dịch dung dịch đệm A: 50 ml/giếng vào lỗ đĩa chữ U cột cột thứ 12 tất hàng - Nhỏ huyết kiểm tra pha loãng 1:8 vào lỗ tương ứng 50 ml/giếng pha loãng theo số từ hàng A đến hàng D từ hàng E đến hàng H - Huyết đối chứng: Chuẩn bị giống phát kháng thể - Nhỏ kháng nguyên pha loãng theo tỷ lệ cho trước 50 ml/giếng - Hỗn hợp kháng nguyên-huyết ủ qua đêm 4°C - Các bước sau tiến hành theo trình tự giống phản ứng ELISA phát kháng thể 10 11 12 A 1 9 17 17 25 25 33 33 C++ C++ B 2 10 10 18 18 26 26 34 34 C++ C++ C 3 11 11 19 19 27 27 35 35 C+ C+ D 4 12 12 20 20 28 28 36 36 C+ C+ E 5 13 13 21 21 29 29 37 37 C- C- F 6 14 14 22 22 30 30 38 38 C- C- G 7 15 15 23 23 31 31 39 39 Ca Ca H 8 16 16 24 24 32 32 40 40 Ca Ca Sơ đồ Đĩa phản ứng ELISA phát kháng thể 77 10 11 12 A 1 3 5 7 9 C++ C++ B 1 3 5 7 9 C++ C++ C 1 3 5 7 9 C+ C+ D 1 3 5 7 9 C+ C+ E 2 4 6 8 10 10 C- C- F 2 4 6 8 10 10 C- C- G 2 4 6` 8 10 10 Ca Ca H 2 4 6 8 10 10 Ca Ca Sơ đồ Đĩa phản ứng ELISA định lượng kháng thể CHÚ THÍCH: C++: huyết đối chứng dương tính mạnh C+: huyết đối chứng dương tính yếu C-: huyết đối chứng âm tính Ca: đối chứng kháng ngun Cơng thức tính PI: PI = 100 - 78 PHỤ LỤC 02 QUY TRÌNH GIẢI TRÌNH TỰ GIEN VI RÚT LỞ MỒM LONG MÓNG Sơ đồ thực phản ứng PCR/giải mã phân tích gien phịng thí nghiệm tham chiếu LMLM WRL-Pirbright (Anh quốc) 79 I TRANG THIẾT BỊ CƠ BẢN - Máy PCR (Bio-Rad-USA) - NanoDrop ND-1000 Spectrophotometer (Thermo Scientific, UK) - Bồn ổn nhiệt - Bộ điện di sản phẩm PCR - Hệ thống bơm hút chân không - Tủ lạnh âm (-200C) đến (-700C) - Tủ lạnh âm (00C) đến (-200C) - Tủ lạnh thường (200C) đến (800C) - Máy ly tâm - Máy IKA Turrax - Máy votex - Máy Spin - Đế từ MPC II Primer đặc hiệu cho vi rút Lở mồm long móng type O type A 2.1 Type O Type O Sequence (5’-3’) Vùng gien O-1D293F TGGAYAACACCACY AAYCCAAC VP1 O-1D296F ACAACACCACCAACCCAAC VP1 O-1D296aF ATAACACCACTAATCCAAC VP1 O-1D296bF ACAACACCACCAATCCAAC VP1 O-1D296cF ATAACACCACCAATCCAAC VP1 O-1D628R GTTGGGTTGGT GGT GTTGT VP1 O-1D628aR GTTGGATTAGT GGT GTTAT VP1 O-1D628bR GTTGGGTTGGT GGT GTTTT VP1 2.2 Type A Type A Sequence (5’-3’) Vùng gien A-1D202aF TCAGCCACCTACTATTTCTCTGA VP1 A-1D202bF GCAGCAACATACTACTTCTCTGA VP1 80 Type A Sequence (5’-3’) Vùng gien A-1D202cF GCAGCAACCTACTATTTCTCTGA VP1 A-1D202dF GCGGCCACTTACTACTTCTCTGA VP1 A-1D202eF GCGGCCACCTACTATTTTTCTGA VP1 A-1D202fF GCGGCCACCTACTACTTTTCTGA VP1 A-1D478aR CAGTGCTCCGTAGTTAAAGGATGA VP1 A-1D478bR AATTGCACCGT AATT GAAGGAT GC VP1 A-1D478cR GAGTGCACCATAGTTGAAAGACGC VP1 A-1D478dR AATCGCACCAAAGTTGAAGGAAGT VP1 A-1D478eR AACTGCGCCGT AGTT GAAGGAGGC VP1 A-1D478ÍR AATTGCGCCGT AGTT GAAGGAT GC VP1 III CÁC GIAI ĐOẠN THỰC HIỆN Giai đoạn 1: Chiết tách RNA vi rút Rneasy Spin-Columns - Sử dụng 460 μl mẫu vi rút LMLM ống tube 1,5ml - Cho 460 μl dung dịch Lysis buffer RLT (đã có chứa 1% 2-mercaptoethanol) hòa với mẫu vi rút vortex lắc - Cho 460 μl dung dịch ethanol 70% vortex lắc thành hỗn hợp dịch đồng - Cho 700 μl hỗn hợp dịch cột Rneasy - Ly tâm tốc độ 10.000rpm/15 giây - Loại bỏ nước - Rửa cột Rneasy 700 μl dung dịch RW1 cung cấp theo kít - Loại bỏ nước - Rửa cột lần RNeasy 500 μl dung dịch RPE cung cấp theo kít - Loại bỏ nước - Tiếp tục, rửa cột lần RNeasy 500 μl dung dịch RPE cung cấp theo kít - Ly tâm làm khơ màng lọc cột RNeasy - Hoàn nguyên thu hoạch RNA 50 μl nước khơng chứa RNA cung cấp sẵn kít 81 - Giữ nhiệt độ -200C Giai đoạn 2: Phiên mã ngược RNA vi rút (Reverse Transcription of RNA) - Chuẩn bị nguyên liệu Nguyên liệu Đơn vị (μl) 10 mM dNTPs 2,5 Dung dịch đệm RT nồng độ lần MMLV (200U/ μl) 0,5 Rnasin (3.3U/ μl) H2O Primer (25pmol/ μl) Tổng thê tích 11 - Lấy 14 μl RNA cho vào 11 μl hỗn hợp nguyên liệu với tổng thể tích cuối 25 μl - Xử lý nhiệt 420C 60 phút 940C 10 phút - Giữ âm -200C Giai đoạn 3: Khuyếch đại PCR phiên mã ngược - Chuẩn bị nguyên liệu Nguyên liệu Nồng độ Đơn vị (μl) 25 mM MgCl2 1,5 mM 10 mM dNTPs 200 ^M 1X Primer (10-25 pmol/ μl) 0,5 pmol/ μl primer (10-25 pmol/ μl) 0,5 pmol/ μl 2,5 U 0,5 Dung dịch đệm 10X Taq DNA polymerase (5 U/ μl) Mẫu (sản phẩm phiên mã ngược) H2O 33,5 Tổng thê tích 50 82 - Thực chu kỳ nhiệt độ: Nhiệt độ Thời gian Số chu kỳ 940C phút 940C 60 giây 550C 60 giây 720C 90 giây 720C phút 30 Sau lấy μl sản phẩm PCR chạy điện di agarose gel Giai đoạn 4: Phân tích sản phẩm PCR Agarose Gel Electrophoresis Chuẩn bị 60ml thạch agarose 2% dung dịch đệm TBE 1X Đun nhiệt khoảng phút microwave để thạch tan chảy đồng Chuẩn bị bảng Gel agarose Cho 6μl thang chuẩn (marker) Cho 6μl sản phẩm PCR Thực điện di 100 Volts cho 20 phút Bảng gel điện di ghi nhận kết ( nhìn vạch sản phẩm) máy UVTransilluminator Giai đoạn 5: Tinh sản phẩm PCR sử dụng kít Promega Wizard PrepsTM - Cắt sản phẩm PCR cho vào ống tube loại 1,5ml - Cho 100 μl dung dịch tinh (Purification Buffer) - Trộn - Cho 1ml Resin - Lắc lần, lần phút - Chuẩn bị Wizard Prep-mini-column cho sản phẩm PCR - Ly tâm 12.000 rpm 20 giây Giữ sản phẩm tinh nhiệt độ âm-200C ống chứa 1ml Giai đoạn Đánh dấu vùng Oligonucleotide kít T4 Polynucleotide - Chuẩn bị hỗn hợp nguyên liệu tube eppendorf 83 Nguyên liệu Đơn vị (μl) Primer (24 pmol/ μl) 32 P -ATP (1.85 MBq) Nguyên liệu Đơn vị (μl) Dung dịch đệm PNK 10X T4 polynucleotide kinase (10 U/ μl H2O 19 Tổng thể tích 30 - Sau ủ nhiệt độ Nhiệt độ Thời gian 60 phút 370C 900C phút - Sử dụng 1.2 pmol Primer (1,5 μl) cho mẫu Giai đoạn 7: Thực chu trình trình tự gien sử dụng Promega f-mol kit a) Chuẩn bị ống đánh dấu T, C, G A b) Cho μl dd/dNTPs ống/giếng c) Ly tâm nhẹ d) Giữ nhiệt độ 40C Mỗi ống phản ứng thực tube có chứa nguyên liệu sau: Đơn vị (μl) Nguyên liệu Mẫu DNA tinh Dung dịch đệm nồng độ 5X 32 P-ATP 1,5 Taq polymerase (5U/ μl) H2O 10,5 Tổng thể tích 20 - Lắc ly tâm nhẹ a) Cho μl hỗn hợp vào tube dd/dNTP/giếng 84 b) Ly tâm nhẹ tất giếng thực Thực chu trình nhiệt: Nhiệt độ Thời gian Số chu kỳ 94 C phút 920C phút 550C phút 720C phút 30 giây 200C 30 Giữ nhiệt a) Cho μl dung dịch dừng phản ứng cho tube giếng phản ứng b) Ly tâm nhẹ Đun nhiệt nhiệt độ 80-900C phút trước chạy gel Sử dụng 3.5 μl giếng Chuẩn bị dung dịch Fmol Sequencing Nguyên liệu Nồng độ Đơn vị (μl) Formamide 95% 950 NaOH 2M 10 mM 10% Bromophenol Blue 0,05% 10% Xylene Cyanol FF 0,05% H2O 35 Tổng thê tích 1000 Giai đoạn 8: Polyacrylamide Gel Electrophoresis sản phẩm chu trìnhtrình tự gien Cẩn thận làm gel với chất tẩy rửa Rửa lại nước cất sau làm ethanol Chuẩn bị dung dịch gel - 125 ml TBE 0,5X - 250 μl TEMED - 250 μl ammonium persuphate (AMPS) Đổ dung dịch gel kính ống tiêm 50 ml Chuẩn bị 1000ml TBE 1X Sử dụng μl thuốc nhuộm formamide vào giếng 85 Đun nhiệt mẫu nhiệt độ 95-1000C/2phút trước thực bước Cho μl mẫu giếng theo trình tự T, C,G,A Chạy máy 70 Watts Tháo đĩa (plate) bể gel 10 Làm khô khoảng 45-60 phút 1.5 làm nóng nhiệt độ 80-850C 11 Đánh dấu góc gel khơ,thời gian từ 18-48 với hình tăng cường 18-60 tùy thuộc vào hoạt động đồng vị phóng xạ 12 Hiện thị hình ảnh tự động gắn nhãn thứ tự (tức TCGA) đặt tên mẫu máy giải trình tự gien Giai đoạn 9: Phân tích kết phần mềm MEGA4 Kết giải mã gien so sánh để tìm mối liên hệ với trình tự gien nhóm/dịng vi rút khác cơng bố Ngân hàng gien (NCBI) để so sánh với chủng giới so sánh chủng nước có kết trước phần mềm chuyên dụng (ví dụ phần mềm MEGA) để thể phả hệ sinh dòng 86 PHỤ LỤC 03 XÁC ĐỊNH SỰ TƯƠNG ĐỒNG KHÁNG NGUYÊN VI RÚT LMLM (VACCINE MATCHING) - GIÁ TRỊ R1 I TRANG THIẾT BỊ - Micropipettes kênh lấy thể tích từ 0.5-10μl; 10-100μl ; 100-1000μl - Multistepper 08 kênh lấy thể tích từ 50-250μl - Máy Vortex - Máy Spin - Kính hiển vi soi ngược - Tủ an tồn sinh học cấp II - Tủ lạnh - 40C, tủ lạnh -200C, tủ lạnh âm -800C - Tủ ấm CO2 - Dụng cụ lọc vô trùng với đầu lọc 0,20 μm - Syringe: 1,3 5ml - Tips phù hợp với Micropipettes - Ống Eppendorf 1,5ml - Ống nhựa ly tâm 5ml, 15ml, 50ml - Nồi ổn nhiệt: có nhiệt độ từ +350C đến 600C - Đĩa đáy triệt trùng 96 giếng dùng nuôi cấy tế bào II NGUYÊN LIỆU - Thuốc khử trùng: Virkon, - Phosphate Buffered Saline - Penicillin/Streptomycin - Fungizone - Eagle’s maintenance medium (EMEM) - Basal medium Eagle (BME) - Formal 10% pha PBS lần - Methyl blue 0,05% pha Formal 10% 87 III CÁC BƯỚC THỰC HIỆN 3.1 Mẫu kháng huyết Bò: Được sử dụng để thực phản ứng trung hòa vi rút mẫu huyết tiêm vắc xin LMLM type O kháng lại kháng nguyên O1manisa O3039) tiêm vắc xin LMLM type A kháng lại kháng nguyên A22Iraq Amay97) Tất mẫu huyết biết trước hiệu giá kháng thể 3.2 Mẫu vi rút LMLM thực địa: Pha loãng dung dịch vi rút sử dụng với 100TCID50/ 50 μl 3.3 Các bước thực Thực đĩa phản ứng: Huyết pha loãng bắt đầu: 1/4 đến 1/512 + Mỗi độ pha loãng huyết cho vào giếng, giếng 50 μl + Cho 50 μl dung dịch vi rút với 100TCID50 /50 μl vào giếng + Ủ đĩa 370C/5% CO2/60 phút + Sau ủ xong, cho 50 μl tế bào BHK vào tất giếng + Ủ đĩa 370C/5% CO2/48 Kiểm tra tế bào ngày kính hiển vi soi ngược để ghi nhận bệnh tích tế bào - Thực đĩa đối chứng Đối chứng huyết thanh: Huyết đối chứng âm dương tính pha loãng bắt đầu: 1/4 đến 1/512 + Mỗi độ pha loãng huyết cho vào giếng, giếng 50 μl + Cho 50 μl dung dịch vi rút với 100TCID50 /50 μl vào giếng + Ủ đĩa 370C/5% CO2/60 phút + Sau ủ xong, cho 50 μl tế bào BHK vào tất giếng + Ủ đĩa 370C/3 - 5% CO2/48 Đối chứng tế bào: + Cho 100 μl môi trường vào giếng A6 đến D6 A7 đến D7 + Ủ đĩa 370C/5% CO2/60 phút Đối chứng môi trường: + Cho 150 μl môi trường vào giếng E6 đến H6 E7 đến H7 + Ủ đĩa 370C/ 5% CO2/60 phút 88 Chuẩn độ lại vi rút sử dụng + Pha loãng dung dịch vi rút sử dụng: từ 10-1 đến 10-4 + Cho 50 μl môi trường vào giếng từ A9 đến H12 + Cho 50 μl vi rút pha loãng 10-1 giếng từ A9 đến H9 + Cho 50 μl vi rút pha loãng 10-2 giếng từ A10 đến H10 + Cho 50 μl vi rút pha loãng 10-3 giếng từ A11 đến H11 + Cho 50 μl vi rút pha loãng 10-4 giếng từ A12 đến H12 + Ủ đĩa 370C/5% CO2/ 60 phút - Sau ủ xong, cho 50 μl tế bào BHK vào tất giếng từ A1 đến H4, từ A6 đến D6, từ A7 đến D7 từ A9 đến H12 + Ủ đĩa 370C/5% CO2/48 + Kiểm tra tế bào ngày kính hiển vi soi ngược để ghi nhận bệnh tích tế bào 3.4 Kết 3.4.1 Tính hiệu giá kháng thể trung hịa mẫu huyết thanh: - Độ pha loãng huyết phải chuyển log10 (huyết pha loãng 1/X, lấy log10 X) để đưa vào công thức Karber (1931) Hiệu giá trung hòa 50% = a + 0,5 – 1/n x Σrl Trong đó: + a: độ pha lỗng huyết cao có giếng khơng có bệnh tích tế bào + Σrl: tổng số giếng có bệnh tích tế bào độ pha lỗng có giếng khơng có bệnh tích tế bào + n: số giếng sử dụng cho độ pha loãng 3.4.2 Điều kiện để chấp nhận kết - Đối chứng tế bào: bình thường - Đối chứng mơi trường: bình thường - Đối chứng mơi trường tế bào: bình thường - Hiệu giá mẫu đối chứng huyết dương chuẩn chệnh lệch ± độ pha loãng bậc so với hiệu giá biết (log10 độ pha loãng bậc hiệu giá biết ± 0,3) - Hiệu giá chuẩn độ lại vi rút nằm khoảng log10 hiệu giá vi rút biết ± 0,5 89 3.5 Kết luận + Mẫu có hiệu giá kháng thể trung hịa 50% ≥ 1,65 (1/45) xem mẫu dương tính + Mẫu khơng có hiệu kháng thể trung hịa 50% ≤ 1,2 (1/16) xem mẫu âm tính + Mẫu có hiệu giá kháng thể trung hòa từ 50% từ > 1,2 (1/16) đến < 1,65 (1/45) xem mẫu nghi ngờ Nếu mẫu kiểm tra lại lần có hiệu giá > 1,2 (1/16) xem mẫu dương tính Mức tương đồng kháng nguyên thể qua giá trị r1, vi rút vắc xin có giá trị r1 ≥ 0,3 vi rút thực địa vi rút vắc xin có tương đồng kháng ngun với vi rút thực địa; giá trị r1 cao mức tương đồng cao đồng nghĩa vắc xin có khả bảo hộ tốt với vi rút thực địa Giá trị r1 tính theo cơng thức sau: Trong đó: Nếu r1