Đang tải... (xem toàn văn)
Mục đích nghiên cứu của luận án nhằm nghiên cứu một số đặc điểm dịch tễ học của bệnh PED tại 10 tỉnh/ thành phố khu vực phía Bắc; Làm rõ được đặc điểm di truyền, đặc điểm dịch tễ học phân tử của các genotype PEDV đang lưu hành ở miền Bắc.
HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM ¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯ NGUYỄN TRUNG TIẾN NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM DỊCH TỄ HỌC CỦA BỆNH TIÊU CHẢY THÀNH DỊCH Ở LỢN (PED) TẠI MIỀN BẮC VIỆT NAM Chuyên ngành: Dịch tễ học thú y Mã sớ : 9.64.01.08 TĨM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ Hµ NéI, 2018 Cơng trình hồn thành tại: HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS Nguyễn Bá Hiên Phản biện 1: PGS.TS Đinh Duy Kháng Viện Công nghệ sinh học Phản biện 2: PGS.TS Bùi Trần Anh Đào Học viện Nông nghiệp Việt Nam Phản biện 3: PGS.TS Trương Văn Dung Viện Thú y Luận án bảo vệ trước Hội đồng đánh giá luận án cấp Học viện, họp tại: Học viện Nông nghiệp Việt Nam Vào hồi ngày tháng năm 2018 Có thể tìm hiểu Luận án thư viện: - Thư viện Quốc gia - Thư viện Học viện Nông nghiệp Việt Nam PHẦN I MỞ ĐẦU 1.1 TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI Bê ̣nh tiêu chảy thành dịch lợn (Porcine Epidemic Diarrhea- PED) bệnh truyền nhiễm cấp tính nguy hiểm loại virus thuộc họ Coronaviridae Dịch PED xuất lần châu Âu vào năm 1971, sau bệnh lây lan nhiều Quốc gia khác châu Á Trung Quốc, Đài Loan, Nhật, Hàn Quốc Thái Lan Ở Việt Nam, bê ̣nh tiêu chảy thành dịch lợn lần phát vào cuối năm 2008, đầu năm 2009 Mặc dù lưu hành Việt Nam gần 10 năm, đến bệnh tiêu chảy thành dịch PEDV gây chủ đề mẻ Các nghiên cứu tìm hiểu đặc điểm dịch tễ học bệnh PED đặc điểm dịch tễ học phân tử virus lưu hành Việt Nam hạn chế Bên cạnh đó, xuất lưu hành PEDV nhóm (thuộc genogroup 2) từ 2010 làm giảm hiệu lực vacxin (sản xuất từ chủng PEDV thuộc genogroup 1) Do vậy, việc làm rõ đặc điểm dịch tễ bệnh dịch tễ học phân tử virus sở quan trọng cho đề xuất biện pháp phòng (đặc biệt lựa chọn loại vacxin) chống phù hợp 1.2 MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU - Nghiên cứu số đặc điểm dịch tễ học bệnh PED 10 tỉnh/ thành phố khu vực phía Bắc; - Làm rõ đặc điểm di truyền, đặc điểm dịch tễ học phân tử genotype PEDV lưu hành miền Bắc 1.3 PHẠM VI NGHIÊN CỨU Trang trại ni lợn 10 tỉnh miền Bắc có lợn mắc tiêu chảy nghi PEDV Các tỉnh chia làm khu vực: đồng châu thổ sông Hồng (Hà Nội, Hải Dương, Hưng n, Hải Phòng, Thái Bình Vĩnh Phúc) trung du- miền núi (Hòa Bình, Bắc Giang, Thái Nguyên Lào Cai) 1.4 NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA ĐỀ TÀI - Đây nghiên cứu có hệ thống PED PEDV Việt Nam - Đã làm rõ đặc điểm dịch tễ học bệnh PED địa bàn 10 tỉnh/ thành phố miền Bắc Việt Nam Trên sở xác định biểu bệnh lý bệnh, đặc điểm dịch tễ học phân tử bệnh, khẳng định lưu hành phổ biến PED trang trại chăn nuôi - Nghiên cứu giải mã 15 trình tự gen S hồn chỉnh trình tự gen ORF3, so sánh chứng minh chủng PEDV lưu hành thực địa khơng có nguồn gốc với chủng vacxin sử dụng - Xác định số đặc điểm dịch tễ học phân tử, từ chứng minh nguồn gốc đa dạng chủng PEDV lưu hành Việt nam 1.5 Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN CỦA ĐỀ TÀI - Luận án phân tích số đặc điểm dịch tễ học PED 10 tỉnh/ thành phố thuộc miền Bắc Việt Nam mức độ lưu hành bệnh, chứng minh nguồn gốc chủng PEDV lưu hành thực địa - Là tài liệu tham khảo tốt phục vụ cho nghiên cứu PED PEDV; tư liệu tham khảo cho giảng dạy chuyên ngành Thú y Chăn nuôi-Thú y - Từ kết phân tích dịch tễ học phân tử PEDV rõ mức tương đồng trình tự gen chủng PEDV phân lập từ thực địa chủng vacxin sử dụng, từ giúp cho việc hoạch định biện pháp phòng chống bệnh, có lựa chọn vacxin phòng bệnh phù hợp PHẦN TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 GIỚI THIỆU CHUNG Dịch tiêu chảy cấp lợn (Porcine Epidemic Diarrhea- PED) bệnh truyền nhiễm cấp tính nguy hiểm loại virus thuộc giống Alphacoronavirus, họ Coronaviridae gây Dịch PED thường xảy lợn ngày tuổi với tỷ lệ ốm tỷ lệ chết lên đến 100% Dịch PED gây thiệt hại kinh tế nghiêm trọng ngành chăn nuôi lợn nhiều quốc gia giới Dịch PED lần phát Anh vào năm 1971, sau ổ dịch liên tục phát xảy phổ biến quốc gia châu Âu khác Bỉ, Đức, Pháp, Hà Lan, Thụy Sỹ, châu Á Trung Quốc, Hàn Quốc, Nhật Bản, Thái Lan Ở Việt Nam, dịch PED lần phát vào năm 2008 từ đến dịch bệnh thường xuyên xảy gây ảnh hưởng nghiêm trọng cho ngành chăn nuôi lợn nước 2.2 ĐẶC ĐIỂM DỊCH TỄ HỌC PHÂN TỬ CỦA PEDV Để xác định mối quan hệ chủng PEDV, phân tích phả hệ (phylogenetic tree) đặc điểm di truyền tiến hành dựa trình tự gen S, M, ORF3 gen E Nghiên cứu phần gen S toàn gen M gợi ý chia PEDV thành nhóm (G1, G2, G3), nhóm chia thành nhóm nhỏ (G1-1, G1-2, G1-3) Phân tích phả hệ dựa trình tự gen S M chủng PEDV phân lập Trung Quốc, Hàn Quốc, Thái Lan Việt Nam có độ tương đồng cao khác biệt với chủng PEDV phân lập từ Quốc gia Châu Âu Phân tích mối liên hệ gen chủng PEDV thực sở phân tích tồn hệ gen virus Nhiều nghiên cứu cho thấy trình tự gen mã hóa spike protein phân đoạn gen mã hóa vùng S1 spike protein (amino acid 1- 735) phù hợp để phân tích đặc điểm tiến hóa virus Theo tác giả Lee (2015), có serotyp nhất, PEDV chia làm genogroup: nhóm G1 cổ điển (G1, classical) nhóm G2 (field epidemic/ pandemic) Mỗi nhóm lại chia thành nhiều nhóm: 1a, 1b 2a, 2b Nhóm G1a bao gồm chủng nguyên mẫu CV777, chủng virus vacxin chủng virus thích nghi tế bào Nhóm G1b bao gồm số biến chủng phát lần Trung Quốc vào năm 2011, sau phát Mỹ vào năm 2014, Hàn Quốc năm 2013 số nước châu Âu Nhóm G2 chia thành nhóm 2a (gây vụ dịch PED châu Á trước đây) nhóm 2b (gây vụ dịch châu Á bắc Mỹ gần đây) Nhóm cổ điển G1a lưu hành Trung Quốc xuất phát từ việc sử dụng chủng virus vacxin nhập lậu chủng virus vacxin nhược độc từ Hàn Quốc Nhóm G2a bắt nguồn từ Hàn Quốc, lây lan sang Trung Quốc sau lây sang nước Đông Nam Á như: Thái Lan, Việt Nam Nhóm G2a nước Đơng Nam Á bắt nguồn trực tiếp từ Hàn Quốc Nhóm di truyền G1b G2b hình thành Trung Quốc kết q trình tái tổ hợp virus thuộc nhóm G1a G2a lưu hành nước Cả nhóm sau lây lan gần đồng thời sang Mỹ, sau xuất Hàn Quốc, số nước bắc Mỹ, nam Mỹ Nhật Bản Đài Loan Dựa vào tượng thêm – xóa (insertion- deletion) gen mã hóa spike protein (S INDEL), chia PEDV làm nhóm: NON- S INDEL S INDEL Ở Mỹ, biến thể thuộc nhóm S INDEL gây ổ dịch có triệu chứng lâm sàng nhẹ Các chủng PEDV phân lập châu Âu (Đức, Ý, Bỉ, Hà Lan Pháp) vào năm 2014 2015 thuộc nhóm S INDEL với nhóm lưu hành Mỹ PHẦN NỘI DUNG- NGUYÊN LIỆU- PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 3.1.1 Tình hình dịch PED số tỉnh miền Bắc Việt Nam - Điều tra tình hình PED từ năm 2013 – 2015 10 tỉnh miền Bắc, - Nghiên cứu đặc điểm lâm sàng bệnh tích lợn mắc PED 3.1.2 Phân tích đặc điểm trình tự gen - Giải trình tự gen S ORF3 chủng PEDV lưu hành - Phân tích đặc điểm trình tự gen S gen ORF3 chủng PEDV lưu hành Việt Nam 3.1.3 Nghiên cứu số đặc điểm dịch tễ học phân tử - Nghiên cứu đặc điểm lưu hành theo nhóm di truyền - Nghiên cứu tượng tái tổ hợp PEDV lưu hành Việt Nam - Nghiên cứu phát tán theo không gian thời gian chủng PEDV dựa vào trình tự gen S gen ORF3 hai genogroup 3.2 VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU - Mẫu phân mẫu ruột lợn nghi mắc tiêu chảy PEDV - Bộ kít tổng hợp cDNA, kít PCR - Trình tự gen S gen ORF3 chủng PEDV lưu hành Việt Nam giới có đầy đủ thơng tin địa điểm thời gian phân lập - Cặp mồi đặc hiệu thừa hưởng từ nghiên cứu trước 3.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.3.1 Phương pháp điều tra số đặc điểm dịch tễ Thu thập thơng tin đàn lợn có triệu chứng bệnh PED từ trại địa bàn nghiên cứu thông qua kỹ thuật viên trại 3.3.2 Phương pháp theo dõi lâm sàng Dựa vào quan sát triệu chứng lâm sàng bệnh tích để bước đầu xác định bệnh 3.3.3 Phương pháp mổ khám Mổ khám nhằm xác định biến đổi đại thể quan, tổ chức lợn mắc PED, cần tiến hành mổ khám lợn có biểu triệu chứng lâm sàng bệnh Lợn bệnh cố định cẩn thận, tiến hành lấy máu từ vịnh tĩnh mạch cổ Lột da bộc lộ xoang ngực, xoang bụng, tách quan nội tạng khỏi thể để quan sát chụp ảnh 3.3.4 Phương pháp lấy mẫu Mẫu thu thập thực địa từ lợn có biểu lâm sàng tiêu chảy cấp trại chăn nuôi số địa phương thuộc miền Bắc Việt Nam, bao gồm: (i) đoạn ruột hạch ruột, (ii) phân Mẫu bảo quản lạnh sau lấy suốt trình vận chuyển 3.3.5 Phương pháp tách ARN tổng số tổng hợp cDNA - ARN tổng số tách TRIzol - cDNA tổng hợp từ RNA tách chiết nhờ enzyme phiên mã ngược (reverse transcriptase), sử dụng kit SuperScript (Invitrogen) oligo dT 3.3.6 Phương pháp RT-PCR phát PEDV - Các mẫu bệnh phẩm sau dùng chẩn đoán PED phản ứng RT-PCR với cặp mồi đặc hiệu PEDV 3.3.7 Phương pháp giải trình tự gen Sản phẩm PCR tinh giải trình tự theo hai chiều (xuôi ngược) phương pháp Sanger Trình tự nucleotide tiếp tục phân tích chương trình tin sinh học BioEdit v7.1.3.0 sở đối chiếu so sánh (i) trình tự nucleotide giải trình tự theo chiều xi chiều ngược, (ii) với trình tự gen S ORF3 tham chiếu công bố ngân hàng gen 3.3.8 Phương pháp xác định khoảng cách di truyền Phần mềm MEGA7 (Kumar et al., 2016) dùng để tính khoảng cách di truyền (genetic distance) chủng PEDV lưu hành Việt Nam, dựa vào trình tự gen S (n=38) gen ORF3 (n=12) Các mơ hình mơ biến đổi nucleotide dùng bao gồm: Kimura-2P (K2P), Tajama-Nei, Tamura-3P Tamura-Nei Khoảng cách di truyền chủng virus sau xếp biểu diễn dạng đồ thị tần suất 3.3.9 Phương pháp xây dựng phả hệ Cây phả hệ (dựa vào trình tự gen S gen ORF3) xây dựng sau: (i) Lập sở liệu bao gồm chủng PEDV thu nhận từ ngân hàng gen chủng biết genogroup (Lin et al., 2016) (ii) Sắp xếp (alignment) trình tự nucleotide theo cột sở ba mã hóa (codon- based alignment) phần mềm MAFFT (Katoh and Standley, 2013) PAL2NAL (Suyama et al., 2006) (iii) Xây dựng phả hệ thuật tốn neighbor-joining tích hợp chương trình MEGA (Kumar et al., 2016) Mức tin cậy nhánh phân chia nút (node) biểu thị giá trị bootstrap (iv) Phần mềm FigTree (http://tree.bio.ed.ac.uk/software/figtree/) dùng để biểu diễn hiệu đính phả hệ 3.3.10 Phương pháp phân tích đặc điểm dịch tễ học phân tử Sử dụng phần mềm BEAST (Drummond et al., 2012) để xây dựng lại trình phát tán theo khơng gian (quốc gia- quốc gia, địa phương- địa phương) thời gian (năm) PEDV dựa vào trình tự gen S gen ORF3 Các tham số mơ hình dựa theo kết nghiên cứu trước (Lemey et al., 2009) 3.3.11 Phương pháp xử lý số liệu - Kiểm định giả thuyết trị trung bình tổng thể độc lập (independent samples t-test) thực phần mềm SPSS, - Phân tích phương sai yếu tố (oneway ANOVA) dùng kiểm định giả thuyết trung bình nhóm mẫu, - Các phép kiểm định thực với mức ý nghĩa α = 0,05 PHẦN KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 TÌNH HÌNH DỊCH PED Ở MỘT SỐ TỈNH MIỀN BẮC TỪ 2013-2015 4.1.1 Kết phát PEDV mẫu bệnh phẩm từ 2013-2015 Trong khn khổ đề tài, tình hình dịch PED nghiên cứu đàn lợn có triệu chứng bệnh PED Hà Nội, Hải Dương, Hải Phòng, Hưng n, Thái Bình, Vĩnh Phúc, Hòa Bình, Bắc Giang, Lào Cai Thái Nguyên Kết RT-PCR phát PEDV mẫu bệnh phẩm trình bày bảng 4.1 Bảng 4.1 Kết phát PEDV mẫu thu thập từ 2013-2015 Số mẫu Tỷ lệ Số mẫu Tỷ lệ % kiểm trung dương tính dương tính tra bình Phân 40,00 Bắc Giang 40,00 Ruột 40,00 Phân 37,50 Hà Nội 47,37 Ruột 11 54,50 Phân 28,50 Hải Dương 42,86 Ruột 57,10 Phân 40,00 Hải Phòng 50,00 Ruột 60,00 Phân 33,30 Hòa Bình 55,56 Ruột 66,60 Phân 42,80 Hưng Yên 53,85 Ruột 19 11 57,80 Phân 33,30 Lào Cai 50,00 Ruột 60,00 Ruột 12 50,00 Thái Bình 34,25 Phân 61 19 31,14 Ruột 50,00 Thái Nguyên 37,50 Phân 26 34,62 Phân 50,00 10 Vĩnh Phúc 45,45 Ruột 42,80 Tổng hợp 212 89 41,98 * Trường hợp thu thập lợn bệnh, mẫu ruột dùng thay mẫu phân phát PEDV TT Địa điểm Loại mẫu* Bảng 4.1 cho thấy diện PEDV địa phương lấy mẫu, với tỷ lệ dương tính dao động từ 34,25% (Thái Bình) tới 55,56% (Hòa Bình) Phân tích phương sai nhân tố (ANOVA) tỷ lệ dương tính PEDV 10 tỉnh cho giá trị p = 0,841 > 0,05 Do vậy, khác biệt tỷ lệ nhiễm PEDV địa phương khơng có ý nghĩa thống kê mức 95% Xét khía cạnh vị trí địa lý, kết cho thấy dịch PED không xảy tỉnh thành tiếp giáp Hà Nội, Hải Phòng, Hải Dương, Hưng n Thái Bình; mà phát số tỉnh xa Thái Nguyên, Lào Cai Ngoài 10 tỉnh thuộc phạm vi nghiên cứu, PEDV phát Bắc Ninh, Hà Nam, Phú Thọ, Thanh Hóa, Nghệ An Quảng Trị (kết khơng trình bày) Đối với loại mẫu xét nghiệm phân ruột, kết bảng 4.2 cho biết tỷ lệ mẫu ruột dương tính với PEDV (40,00% - 66,60%, trung bình 53,90%) cao so với tỷ lệ mẫu phân dương tính với virus (28,50% 50,00%, trung bình 38,00%) Bằng phân tích phương sai nhân tố, khác biệt kể có ý nghĩa thống kê (p = 0,004 < 0,05) Kết xét nghiệm phù hợp với công bố Nguyễn Tất Toàn cs (Nguyễn Tất Toàn cs., 2012, Nguyễn Tất Toàn and Đỗ Tiến Duy, 2012), nhóm tác giả phát 58,14% mẫu ruột non dương tính PEDV cao nhiều so với mẫu phân (16,96%) Mặc dù tất mẫu bệnh phẩm nêu (bảng 4.1) lấy lợn có triệu chứng tiêu chảy nghi ngờ nguyên nhân virus như: (i) nôn, phân nhiều nước có cục sữa khơng tiêu; (ii) ruột non căng phồng, có cục sữa khơng tiêu đoạn ruột già, v.v có trung bình 41,98% mẫu dương tính PEDV Kết lợn lấy mẫu nhiễm virus gây tiêu chảy khác Khả lẽ công bố gần đây, deltacoronavirus phát Hà Nội Thái Bình hai tỉnh thuộc phạm vi thu thập mẫu nghiên cứu (Lê Văn Phan cs., 2017) 4.1.2 Tình hình dịch PED số tỉnh miền Bắc theo trang trại Những nghiên cứu vòng năm trở lại Việt Nam cho thấy PEDV nguyên nhân chủ yếu gây bùng phát dịch tiêu chảy lợn (Do Tien Duy et al., 2011; Vui et al., 2015) Do không nằm danh mục bệnh bắt buộc phải khai báo dịch, nên tình hình dịch PED ngồi thực địa dự đoán xảy diện rộng Để làm rõ tình hình dịch PED 10 tỉnh miền Bắc, kết xét nghiệm tổng hợp theo trang trại trình bày bảng 4.2 Bảng 4.2 Tình hình dịch PED số tỉnh miền Bắc theo trang trại TT Địa điểm Bắc Giang Hà Nội Hải Dương Hải Phòng Hòa Bình Hưng Yên Lào Cai Thái Bình Thái Nguyên 10 Vĩnh Phúc Tổng hợp Số trại theo dõi 10 5 5 55 Số trại dương tính 2 32 Tỷ lệ (%) dương tính 25,00 80,00 66,67 60,00 40,00 85,71 33,33 60,00 40,00 50,00 58,10 Kết xét nghiệm PEDV 55 trại (có lợn mắc tiêu chảy nghi virus chưa sử dụng vacxin phòng bệnh PEDV) cho thấy có 32 trại phát PEDV mẫu bệnh phẩm, tương ứng với tỷ lệ 58,1% Mặc dù tỷ lệ trang trại dương tính với PEDV khác tỉnh (dao động từ 25,00% - 85,71%), khơng có địa phương khơng có trang trại mắc PED Kết cho thấy PEDV xuất phổ biến địa phương thuộc phạm vi nghiên cứu đề tài Xét mặt địa lý, tỉnh thuộc đồng châu thổ sơng Hồng có tỷ lệ trang trại dương tính 50% Cụ thể, tỷ lệ trang trại dương tính cao Hưng Yên (85,71%) Hà Nội (80,00%); tiếp đến Hải Dương, Hải Phòng, Thái Bình với tỷ lệ dương tính 66,67%, 60,00% 60,00% Ngược lại, tỉnh trung du- miền núi phía Bắc, tỷ lệ trang trại dương tính với PEDV 50%, ví dụ như: Lào Cai 33,33% Bắc Giang 25,00% Kết tính chung theo vùng địa lý cho thấy tỷ lệ trang trại có PEDV lưu hành tỉnh đồng sơng Hồng cao rõ rệt so với trang trại tỉnh trung du- miền núi (68,42% so với 35,29%), mức tin cậy 95% (phụ lục 1) Sự khác biệt tỷ lệ trang trại dương tính PEDV vùng nói tỉnh đồng có số lượng hộ chăn ni lớn mật độ chăn nuôi lợn cao nên tỷ lệ mắc PED cao so với trại khu vực vùng trung du - miền núi Tổng hợp kết trình bày bảng 4.1 bảng 4.2 cho phép rút nhận xét: kể từ PEDV công bố lần đầu miền Nam năm 2009 (Do Tien Duy et al., 2011), dịch tiêu chảy lợn PEDV gây xuất miền Bắc với không gian trải rộng (10/10 tỉnh thu thập mẫu) liên tục theo thời gian (trong năm thu thập mẫu từ 2013-2015) 4.1.3 Kết theo dõi triệu chứng, bệnh tích lợn mắc PED Để làm rõ đặc điểm triệu chứng bệnh tích đặc trưng lợn mắc tiêu chảy virus, nghiên cứu tìm hiểu triệu chứng bệnh tích 50 lợn theo mẹ (giai đoạn mẫn cảm với PEDV) khẳng định dương tính với PEDV (bảng 4.3, bảng 4.4) Bảng 4.3 Kết nghiên cứu triệu chứng lâm sàng lợn mắc PED Địa điểm Bắc Giang Hà Nội Hải Dương Hải Phòng Hòa Bình Hưng Yên Thái Bình Vĩnh Phúc Tổng hợp Số có triệu chứng Số theo Mùi phân Phân lỏng, Lơng xù, Nơn mửa dõi tanh, gây có cục sữa bết phân 3 7 5 5 5 5 0 4 10 10 10 0 50 (14%) 32 (64%) 19 (38%) 40 (80%) Mất nước 5 10 41 (82%) Mặc dù lợn lứa tuổi mẫn cảm với PEDV mắc bệnh thể lâm sàng, lợn theo mẹ nhóm có biểu bệnh rõ Vì vậy, 4.2.1.2 Đặc điểm đột biến vùng định kháng nguyên COE Vùng định kháng nguyên COE (aa 499 – 638, hình 4.2) xác định bao gồm vùng định kháng ngun kích thích sản sinh kháng thể trung hồ từ aa 499-600 (tương đương aa 496-597 chủng CV777) So với chủng tham chiếu CV777, 38 chủng PEDV Việt Nam sai khác 31 vị trí, tập trung vị trí amino acid 517, 521, 527, 549, 594, 605, 612 635 Vùng định kháng ngun COE đóng vai trò receptor gắn thụ thể pAPN (porcine aminopeptidase-N) Trong vị trí gắn với pAPN (đóng khung từ 1-4), có tới vị trí xảy đột biến Trình tự amino acid vùng gắn pAPN số nhìn chung bảo thủ (trừ chủng KJ960178, KJ960179, KJ960180 có đột biến) Đột biến vùng bám pAPN xác định PEDV lưu hành nhiều nước giới 500 510 520 530 540 550 560 570 580 590 600 610 620 630 | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | Spike_AF353511_CV777 KX982561_HaNoi_2013 KX982564_HoaBinh_2013 KX982553_HungYen_2013 KX982554_HungYen_2013 KX982557_HungYen_2013 KJ960180_HungYen_2013 KP455313_ThaiBinh_2013 KP455314_ThaiBinh_2013 KJ960178_DongNai_2013 KJ960179_VungTau_2013 KP455320_HaiPhong_2014 KX982568_HaNoi_2014 KX982570_HaNoi_2014 KX982569_HoaBinh_2014 KT941120_HungYen_2014 KX982572_ThaiBinh_2014 KX982571_VinhPhuc_2014 KP455315_QuangTri_2014 KP455316_QuangTri_2014 KP455317_QuangTri_2014 KP455318_QuangTri_2014 KP455319_QuangTri_2014 KX708903_HaiPhong_2015 KX708901_HaiPhong_2015 KX708902_HaiPhong_2015 KX708896_HaNoi_2015 KX982573_HungYen_2015 KX982576_HungYen_2015 KX708906_HungYen_2015 KX708907_HungYen_2015 KX708904_LaoCai_2015 KX708905_LaoCai_2015 KX708897_ThaiNguyen_2015 KX708898_ThaiNguyen_2015 KX708895_ThaiNguyen_2015 KX708899_VinhPhuc_2015 KX708900_VinhPhuc_2015 KX708894_HungYen_2016 VTLPSFNDHSFVNITVSAAFGGLSSANLVASDTTINGFSSFCVDTRQFTITLFYNVTNSYGYVSKSQDSNCPFTLQSVNDYLSFSKFCVSTSLLAGACTIDLFGYPAFGSGVKLTSLYFQFTKGELITGTPKPLEGITDV S H.G I S .T S D F D V H.G I S S E F V S H.G I S F .S E F V H.G I S S E F V S H.G I S F .S E F V H.G I W S.S PT S E F V .DH.G I S S E F V .DH.G I S S E F V K .HRG I R SR PT G G S E F V H.G I W S.S PT S E F V S H.G I S L S E F V H.G I S S E F V S H.G I S .T S D F D V P.G I S S D VA V P.G I S A S D VA V S H.G I S S E F V H.G I S S E F V S H.G I S S E F V S H.G I S G S E F V S H.G I S S E F V S H.G I S WC N E F V S H.G I S S E F V V H.G I S E F V .DH.G I S S C.E F V .DH.G I S S E F V H.G I S E F V H.G I S .D F V.V H.G I S N S E F V P.G I S .N S D VA V P.G I S A S D VA V H.G I S S H.D F V H.G I S S H.D F V H.G I S E F V H.G I S E F V V H.G I S E F S .V H.G I S E F V H.G I S E F V V H.G I S E F HS .V aa 496- 597 Các vùng gắn với thụ thể porcine aminopeptidase-N (pAPN) đóng khung Vùng kích thích sản sinh kháng thể trung hòa (aa 496-597) xác định Okda cs., 2017 Vị trí đột biến dẫn tới khả lẩn tránh kháng thể trung hòa đánh dấu mũi tên Vị trí amino acid đánh dấu theo chủng tham chiếu CV777 Hình 4.2 Trình tự amino acid vùng COE 38 chủng PEDV Mặc dù có chứng trái ngược pAPN (đặc biệt tiểu phần VII) chứng minh đóng vai trò vơ quan trọng q trình bám xâm nhập PEDV vào tế bào Đối với coronavirus, vùng kháng nguyên làm nhiệm vụ gắn kết với tế bào vật chủ thường đích tác động 11 kháng thể trung hòa Do đó, đột biến vị trí bám pAPN 38 chủng PEDV lưu hành Việt Nam dự đốn có ảnh hưởng đến trình xâm nhập virus vào tế bào vật chủ Ở khía cạnh khác, PEDV khơng bị trung hòa kháng thể đặc hiệu (neutralization resistance) với điểm đột biến vùng bám với pAPN: từ valine (V) sang glycine (G) vị trí 638 (tương đương với vị trí 635 chủng CV777) Khơng có chủng virus 38 chủng nghiên cứu dự đốn có khả lẩn tránh kháng thể trung hòa mã hóa valine vị trí 635 (mũi tên, hình 4.2) 4.2.1.3 Đặc điểm đột biến vùng định kháng nguyên S1D Trình tự amino acid vùng S1D trình bày hình 4.3 Trong 21 vị trí có thay đổi amino acid (so với chủng CV777), có vị trí đột biến nằm vùng định kháng ngun kích thích sản sinh kháng thể trung hòa (aa 741768) Trong vùng này, epitop trung hòa SS2 SS6 38 chủng PEDV Việt Nam có tính bảo thủ cao Epitop SS2 giống với trình tự chủng CV777 37/38 chủng, epitop SS6 sai khác aa so với chủng CV777 (vùng đóng khung, hình 4.3) SS2 SS6 640 650 660 670 680 690 700 710 720 730 740 750 760 770 780 | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | Spike_AF353511_CV777 KX982561_HaNoi_2013 KX982564_HoaBinh_2013 KX982553_HungYen_2013 KX982554_HungYen_2013 KX982557_HungYen_2013 KJ960180_HungYen_2013 KP455313_ThaiBinh_2013 KP455314_ThaiBinh_2013 KJ960178_DongNai_2013 KJ960179_VungTau_2013 KP455320_HaiPhong_2014 KX982568_HaNoi_2014 KX982570_HaNoi_2014 KX982569_HoaBinh_2014 KT941120_HungYen_2014 KX982572_ThaiBinh_2014 KX982571_VinhPhuc_2014 KP455315_QuangTri_2014 KP455316_QuangTri_2014 KP455317_QuangTri_2014 KP455318_QuangTri_2014 KP455319_QuangTri_2014 KX708903_HaiPhong_2015 KX708901_HaiPhong_2015 KX708902_HaiPhong_2015 KX708896_HaNoi_2015 KX982573_HungYen_2015 KX982576_HungYen_2015 KX708906_HungYen_2015 KX708907_HungYen_2015 KX708904_LaoCai_2015 KX708905_LaoCai_2015 KX708897_ThaiNguyen_2015 KX708898_ThaiNguyen_2015 KX708895_ThaiNguyen_2015 KX708899_VinhPhuc_2015 KX708900_VinhPhuc_2015 KX708894_HungYen_2016 TDVSFMTLDVCTKYTIYGFKGEGIITLTNSSILAGVYYTSDSGQLLAFKNVTSGAVYSVTPCSFSEQAAYVNDDIVGVISSLSNSTFNNTRELPGFFYHSNDGSNCTEPVLVYSNIGVCKSGSIGYVPSQYGQVKIAPTVTGNISIPTNFSMSI .V .L .D S S L S F .D S .S F .D S S .S F .D S S .S F .D S S .S F .D S S .S S G Y F .D S S L S G F .D S S L S F .D S S .S F .D S S .S F .D S S .I .S F H D S S .S V .L .D S L S F F.D S.K .S .S F .D S.K .S .S F .D S S .S F H D S .S T F D D S S A S F .D S S .S.R .F .D S S .S F .D S S .S F .D S S .S F .D S S L S G F .DG S S L S G F .D S S L S F .D S S L S F H D S .S F H D S S S F .D S.K .S .S F .D S.K .S .S K E F H D S R S F H D S .S F .D S S L S F .D S S L S F .D S S L S F .D S S L S F .D S S L S F .D S S L S aa: 741-756, 744-771, 753-768 Epitop trung hòa SS2 SS6 đóng khung Các phân đoạn aa 741-756, 744-771 753-768 kích thích sản sinh kháng thể trung hòa xác định Okda cs., 2017 Vị trí amino acid đánh dấu theo chủng CV777 Hình 4.3 Trình tự amino acid vùng S1D 38 chủng PEDV 12 Ngồi vùng định kháng ngun kích thích sản sinh kháng thể trung hòa nằm tiểu phần S2 kể trên, đột biến R895G (tương đương với vị trí 891 chủng tham chiếu CV777) chứng minh có vai trò quan trọng q trình thích nghi virus in vitro (đột biến R-> G dẫn tới tăng hiệu giá virus kích thước plaque nhỏ hơn) Kết đối chiếu, so sánh cho biết 38 chủng PEDV nghiên cứu mã hóa arginine (R) vị trí 891 4.2.2 Đặc điểm gen ORF3 PEDV lưu hành Việt Nam Gen ORF3 PEDV gồm 672 nucleotide (không bao gồm codon kết thúc phiên mã) Bằng thực nghiệm, người ta chứng minh vai trò ORF3 có liên quan đến q trình thích nghi virus mơi trường tế bào độc lực virus Khi so sánh mức độ tương đồng nucleotide gen ORF3 12 chủng PEDV với chủng tham chiếu DR13 (hình 4.4), tùy thuộc vào vị trí nucleotide so sánh, chủng Việt Nam tương đồng từ 93% - 99% Từ nucleotide 1- 406, chủng virus KT941120 (Hưng Yên, 2014) giống > 97% so với DR13 Cũng khoảng 11 chủng virus lại có mức tương đồng < 97% Vị trí nucleotide (trục Ox) tỷ lệ % tương đồng nucleotide (trục Oy) Vị trí nucleotide đánh dấu theo chủng tham chiếu DR13 (EU054929) Hình 4.4 Tỷ lệ % tương đồng trình tự gen ORF3 12 chủng PEDV Hình 4.5 trình bày kết phân tích trình tự amino acid 12 chủng PEDV lưu hành Việt Nam thu thập năm 2013 2014 13 10 20 30 40 50 60 70 80 | | | | | | | | | | | | | | | | KT941120_HungYen_2014 KJ960178_DongNai_2013 KJ960179_VungTau_2013 KJ960180_HungYen_2013 KP455967_ThaiBinh_2013 KP455968_ThaiBinh_2013 KP455969_QuangTri_2014 KP455970_QuangTri_2014 KP455971_QuangTri_2014 KP455972_QuangTri_2014 KP455973_QuangTri_2014 KP455974_QuangTri_2014 MFLGLFQYTIDTVVKDVSKSANLSLDAVQELELNVVPIRQASNVTGFLFTSVFIYFFALFKASSLRRNYIMLAARFAVIV S V .F S V .F S .L V .F S V .F S V .F V S V .F S V .F S F V .F V S V .F V S V .F S F V .F 90 100 110 120 130 140 150 160 | | | | | | | | | | | | | | | | KT941120_HungYen_2014 KJ960178_DongNai_2013 KJ960179_VungTau_2013 KJ960180_HungYen_2013 KP455967_ThaiBinh_2013 KP455968_ThaiBinh_2013 KP455969_QuangTri_2014 KP455970_QuangTri_2014 KP455971_QuangTri_2014 KP455972_QuangTri_2014 KP455973_QuangTri_2014 KP455974_QuangTri_2014 LYCPLLYYCGAFLDATIICCTLIGRLCLVCFYSWRYKNALFVIFNTTTLSFLNGKADYYDGKSIVILEGGDHYITFGNSF F I A F I A .R F I A F I A F I A F I A F I A F I A T .F I A F I A F I A 170 180 190 200 210 220 | | | | | | | | | | | | KT941120_HungYen_2014 KJ960178_DongNai_2013 KJ960179_VungTau_2013 KJ960180_HungYen_2013 KP455967_ThaiBinh_2013 KP455968_ThaiBinh_2013 KP455969_QuangTri_2014 KP455970_QuangTri_2014 KP455971_QuangTri_2014 KP455972_QuangTri_2014 KP455973_QuangTri_2014 KP455974_QuangTri_2014 VAFVSSIDLYLAIRGRQEADLQLLRTVELLDGKKLYVFSQHQIVGITNAAFDSIQLDEYATISE .N H V .N H V .N H N H N H N H N H N H N H N H N H Các vị trí liên quan đến ức chế nhân lên virus in vitro đánh dấu mũi tên Trong đó, aa 81 167 có ảnh hưởng rõ rệt đánh dấu màu xám Vùng aa 8298 liên quan đến tượng ức chế nhân lên virus gạch chân Vị trí xuất đột biến (aa 98) trình nhược độc hóa chủng virus nhược độc PC22A đóng khung nét liền Vùng aa (1) (2) ảnh hưởng tới kênh ion K+, aa 170 có ảnh hưởng rõ rệt đóng khung nét đứt Hình 4.5 Trình tự amino acid ORF3 protein 12 chủng PEDV Protein ORF3 ngồi đóng vai trò kênh ion vỏ bọc virus với Tyrosin vị trí 170 (170Y) đóng vai trò quan trọng trì hoạt động kênh ion K+ Vị trí protein ORF3 12 chủng PEDV Việt Nam khơng có đột biến Đối chiếu với vị trí amino acid (F81L M167S) đóng vai trò then chốt q trình ức chế nhân lên virus mơi trường tế bào in vitro, không quan sát đột biến chứng minh ức chế nhân lên PEDV 14 4.3 ĐẶC ĐIỂM DỊCH TỄ HỌC PHÂN TỬ CỦA PEDV 4.3.1 Đặc điểm lưu hành PEDV theo nhóm di truyền 4.3.1.1 Cây phả hệ PEDV dựa vào gen S Để làm rõ mối liên hệ trình tự gen chủng PEDV lưu hành Việt Nam với giới, chúng tơi thu thập phân tích sở liệu bao gồm 911 trình tự gen S hồn chỉnh, có đủ thơng tin địa điểm thời gian thu thập mẫu Các kết phân tích trình bày hình 4.6 Nhóm Bắc Mỹ Nhóm châu Á Nhánh phát sinh chủng loại đánh dấumàu đen (genogroup 1) màu xanh (genogroup 2) Nhánh dẫn tới chủng lưu hành Việt Nam đánh dấu màu đỏ mũi tên Hình 4.6 Cây phả hệ chủng PEDV dựa vào trình tự gen S Kết cho thấy 38 chủng PEDV Việt Nam (mũi tên) thuộc nhóm riêng rẽ genogroup genogroup Trong chủng virus thuộc genogroup bao gồm nhánh, PEDV thuộc genogroup phân bố rải rác nhánh khác phát sinh chủng loại Cùng với chủng PEDV lưu hành nước khác, 31 chủng virus Việt Nam thuộc genogroup phân bố vào nhóm nhóm châu Á nhóm Bắc Mỹ Kết phân loại PEDV lưu hành Việt Nam kể phù hợp nghiên cứu cơng bố năm 2015 nhóm tác giả cho biết: dựa vào trình tự tồn gen S, PEDV lưu hành số tỉnh thuộc miền Bắc miền Trung thuộc genogroup genogroup Ở góc độ khác, kết phân tích nghiên cứu cho biết số cơng bố phát genogroup PEDV nước ta chưa xác 15 4.3.1.2 Cây phả hệ PEDV dựa vào gen ORF3 Mối liên hệ chủng PEDV lưu hành Việt Nam tương quan với chủng lưu hành giới tiếp tục phân tích dựa vào gen ORF3 MF577027 KU836638 Genogroup Genogroup Variant Nhánh thuộc genogroup genogroup đánh dấu màu đen màu xanh Nhánh có chủng PEDV Việt Nam đánh dấu màu đỏ Nhóm biến thể chưa xác định genogroup đánh dấu màu tím Hình 4.7 Cây phả hệ PEDV dựa vào trình tự gen ORF3 Cây phát sinh chủng loại dựa trình tự gen ORF3 phân chia chủng PEDV thành genogroup rõ ràng genogroup genogroup Tuy nhiên, khác với công bố trước đây, kết trình bày nghiên cứu cho thấy, ngồi genogroup kể trên, quan sát nhánh phát sinh nằm gốc phả hệ Nhánh bao gồm chủng virus (với đặc điểm gen khác biệt lớn so với chủng PEDV lưu hành) tìm thấy mẫu bệnh phẩm lưu trữ từ năm 2000 Anh năm 2008 Nga Phân tích sở liệu gồm 886 trình tự gen ORF3 có ngân hàng gen (gồm trình tự gen cập nhật Việt Nam), nghiên cứu xác định PEDV lưu hành nước ta gồm genogroup (11 chủng, phân lập năm 2013-2014) genogroup (1 chủng, phân lập năm 2014) Đây xem kết bổ sung đặc điểm dịch tễ học virus lưu hành nước ta, lẽ dựa vào gen ORF3 nghiên cứu trước nhận định PEDV lưu hành Việt Nam bao gồm nhóm di truyền có quan hệ chặt chẽ với 16 4.3.2 Hiện tượng tái tổ hợp PEDV lưu hành Việt Nam Kết phân tích phả hệ dựa vào trình tự phần tồn gen S, cho thấy số chủng có thay đổi genogroup phân loại Nghiên cứu làm rõ tượng tái tổ hợp chủng PEDV lưu hành Việt Nam sở so sánh phả hệ xây dựng đoạn khác gen S: phần (nt 1534- 2049) gen S toàn gen S A B genogroup genogroup (A) Cây phả hệ dựa trình tự gen S từ nt 1534- 2049 theo Nguyễn Trung Tiến cs (2015) (B) phả hệ dựa trình tự tồn gen S xây dựng nghiên cứu Các chủng PEDV giống phả hệ nối với đường thẳng Hình 4.8 Đối chiếu nhánh phả hệ dựa vào trình tự tồn bộ/ phần gen S Hình 4.8 A cho biết 11/11 chủng PEDV xếp vào genogroup dựa vào trình tự phân đoạn gen S gồm 650 nt Đáng ý có 5/11 chủng (đánh dấu màu vàng, hình 4.8) xếp vào genogroup phả hệ xây dựng dựa vào trình tự tồn gen S Đối với chủng lại, khơng thấy có thay đổi genogroup, quan sát thay đổi vị trí (được nhóm với chủng khác nhau) phả hệ Tái tổ hợp chế tiến hóa virus nói chung PEDV nói riêng Hiện tượng tái tổ hợp PEDV diễn đa dạng: (i) PEDV TGEV, (ii) chủng virus thuộc genogroup genogroup xảy nhiều vị trí gen S, (iii) gen khác gen, v.v 17 Như vậy, thấy đặc điểm tái tổ hợp số chủng PEDV Việt Nam cá biệt 4.3.3 Đặc điểm dịch tễ học phân tử PEDV theo không gian thời gian 4.3.3.1 Đặc điểm dịch tễ học phân tử PEDV thuộc genogroup Hình 4.9 trình bày kết phân tích đặc điểm dịch tễ học phân tử PEDV thuộc genogroup lưu hành Việt Nam dựa vào gen ORF3 ~2012 ~2009 ~2012 ~2013 Các nhánh đánh dấu màu tương ứng với quốc gia/ vùng lãnh thổ dự đoán chiều dài chỉnh tương ứng với trục thời gian dự đốn Kích thước chấm ⚫ nút tương ứng với mức tin cậy dự đốn 40%- 100% Hình 4.9 Sự phát tán theo không gian thời gian genogroup dựa vào gen ORF3 18 Hình 4.9 cho biết chủng PEDV thuộc genogroup lưu hành số tỉnh có nguồn gốc trực tiếp từ Trung Quốc (nhánh màu đỏ) Các chủng PEDV Việt Nam xếp vào genogroup chia thành nhánh: (i) nhánh tìm thấy miền Trung (Quảng Trị), (ii) miền Bắc (Thái Bình) (iii) nhánh tìm thấy miền Bắc miền Nam (Hưng Yên, Vũng Tàu, Đồng Nai) Hình 4.10 đặc điểm dịch tễ học phân tử PEDV thuộc genogroup dựa vào trình tự gen S ~ 2005 ~ 2003 ~ 2008 A B Các nhánh đánh dấu màu tương ứng với quốc gia/ vùng lãnh thổ dự đoán chiều dài chỉnh tương ứng với trục thời gian dự đoán (A) Nhánh dẫn đến chủng PEDV lưu hành Việt Nam (B) Nguồn gốc dự đoán virus phát sinh nhánh biểu thị nút (node) Kích thước chấm ⚫ nút tương ứng với mức tin cậy dự đoán 70%- 98% Hình 4.10 Sự phát tán theo khơng gian thời gian genogroup dựa vào gen S Giống kết dự đoán nguồn gốc chủng virus lưu hành Việt Nam dựa vào gen ORF3, kết phân tích dựa trình tự gen S rõ toàn chủng PEDV lưu hành địa phương lấy mẫu có nguồn gốc trực tiếp từ chủng lưu hành Trung Quốc Mặc dù vậy, kết hình 4.9 hình 4.10 PEDV lưu hành tỉnh Việt Nam nằm nhánh khác phả hệ (bắt nguồn từ nhánh lưu hành Trung Quốc) Quan trọng hơn, kết phân tích cho biết 19 sau xâm nhập vào Việt Nam, chủng virus có lây lan Ví dụ: dựa vào gen S (hình 4.10), đường phát tán dự đoán là: Quảng TrịQuảng Trị, Quảng Trị- Hải Phòng Quảng Trị- Trung Quốc Về mặt thời gian, hình 4.9 cho thấy, 11 mẫu PEDV thuộc genogroup Việt Nam lấy vào năm 2013- 2014, kết dự đoán thời điểm sớm mà virus xuất địa phương không giống nhau, dao động từ khoảng năm 2009 – 2013 (1- năm trước thời điểm mẫu lấy) Ngược lại, dựa vào gen S (hình 4.10) thời điểm sớm mà PEDV dự đoán xuất địa phương kể vào khoảng năm 2005 khoảng năm 2008 (6- năm trước thời điểm mẫu lấy) Nhìn chung, kết phân tích đặc điểm dịch tễ học theo thời gian cho biết PEDV thuộc genogroup lưu hành đàn lợn tỉnh Hòa Bình, Quảng Trị Hải Phòng khoảng thời gian trước ca bệnh PED phát 4.3.3.2 Đặc điểm dịch tễ học phân tử PEDV thuộc genogroup Phân loại genogroup PEDV dựa vào gen ORF3 (hình 4.7) cho biết có chủng PEDV Việt Nam nằm nhóm Phân tích đặc điểm dịch tễ học phân tử dựa vào gen ORF3 trình bày hình 4.11 Các nhánh đánh dấu màu tương ứng với quốc gia/ vùng lãnh thổ dự đoán Chủng PEDV Việt Nam đánh dấu mũi tên Hình 4.11 Sự phát tán theo khơng gian genogroup dựa vào gen ORF3 20 Cơ sở liệu dùng cho phân tích gồm trình tự gen ORF3 thu thập 13 quốc gia Kết cho biết chủng PEDV lưu hành Hàn Quốc dự đoán nguồn gốc tổ tiên xa chủng virus lưu hành giới (hình 4.11) Chủng PEDV Việt Nam (mũi tên) dự đốn có nguồn gốc từ chủng lưu hành Trung Quốc Dựa vào gen trình tự gen S, kết phân loại hình 4.8 cho thấy genogroup PEDV lưu hành Việt Nam thuộc nhóm: nhóm châu Á nhóm Bắc Mỹ theo phân loại Do đó, nghiên cứu phát tán theo không gian thời gian PEDV genogroup nước ta thực nhóm 4.3.3.3 Đặc điểm dịch tễ học phân tử PEDV thuộc nhóm châu Á PEDV thuộc nhóm châu Á bao gồm chủng lưu hành nước (Trung Quốc, Hàn Quốc, Việt Nam, Philipin Thái Lan) Kết phân tích trình bày hình 4.12 13 13, 15, 16 Trung Quốc ~2004 14, 15 13, 15 14, 15 Hàn Quốc ~1993 Hình 4.12 Sự phát tán theo khơng gian thời gian PEDV nhóm châu Á 21 Vùng giới hạn nhánh phả hệ đánh dấu màu tương ứng với quốc gia/ vùng lãnh thổ dự đoán Chiều dài nhánh tương ứng với trục thời gian dự đoán Để dễ quan sát, ký hiệu tên chủng lược bỏ Các chủng PEDV Việt Nam hiển thị kèm năm phân lập (2 số cuối năm) Hình 4.12 cho biết, PEDV thuộc nhóm châu Á lưu hành Trung Quốc, Philippine, Thái Lan Việt Nam dự đốn có nguồn gốc từ chủng PEDV từ Hàn Quốc Chủng virus tổ tiên dự đốn xuất vào khoảng năm 1993 Về tình hình Việt Nam, PEDV lưu hành nước ta (giới hạn vùng màu tím) xác định có nguồn gốc trực tiếp từ chủng lưu hành Trung Quốc (vùng màu đỏ) Kết phân tích cụ thể trình bày hình 4.13 A B E C D F G H Cây phát sinh chủng loại với nhánh đánh dấu màu tương ứng với quốc gia/ vùng lãnh thổ dự đoán (A) Nhánh dẫn đến chủng PEDV lưu hành Việt Nam (B-D) với chiều dài chỉnh tương ứng với trục thời gian dự đoán Nguồn gốc dự đoán virus phát sinh nhánh biểu thị nút (node) phát sinh chủng loại (E-H) Hình 4.13 Kết phân tích phát tán theo khơng gian thời gian PEDV genogroup nhánh châu Á 22 Các chủng PEDV thuộc genogroup lưu hành nước ta xuất phát từ nhánh khác phát sinh chủng loại Kết cho thấy PEDV xâm nhập vào nước ta qua nhiều đợt Thậm chí, virus lưu hành tỉnh, thời điểm khác dự đốn có nguồn gốc khác nhau: ví dụ chủng lưu hành Hưng Yên mơ tả hình 4.13 C 4.13 D Đối với nhóm châu Á này, chúng tơi nhận thấy đặc điểm tương tự với genogroup 1: sau xâm nhập vào số tỉnh, chủng virus có lây lan tỉnh khác (hình 4.13 E-H) 4.3.3.4 Đặc điểm lưu hành PEDV thuộc nhóm Bắc Mỹ Khác với nhóm châu Á, PEDV genogroup thuộc nhóm Bắc Mỹ chủng có nguồn gốc từ PEDV lưu hành Mỹ từ năm 2013, nhóm khơng bao gồm chủng virus lục địa châu Mỹ mà có chủng lục địa châu Á (Hàn Quốc, Nhật Bản, Đài Loan, Thái Lan Việt Nam) lục địa châu Âu A B ~ 2011 ~ 2011 Cây phát sinh chủng loại với nhánh đánh dấu màu tương ứng với quốc gia/ vùng lãnh thổ dự đoán Nhánh dẫn đến chủng PEDV lưu hành Việt Nam đánh dấu mũi tên kèm dự đoán nguồn gốc phát sinh Hình 4.14 Kết phân tích phát tán theo không gian thời gian PEDV genogroup nhánh Bắc Mỹ Kết phân tích hình 4.14 cho biết PEDV Việt Nam thuộc nhóm Bắc Mỹ có nguồn gốc từ chủng virus lưu hành Mỹ Dựa vào đặc điểm phân nhánh, chủng nằm nhánh khác Kết dự đốn có nhiều đợt xâm nhập PEDV thuộc nhóm vào nước ta Các kết phân tích đặc điểm dịch tễ học phân tử PEDV lưu hành 23 Việt Nam cho thấy virus có nguồn gốc từ chủng lưu hành Trung Quốc Tuy nhiên, nhận xét nguồn gốc PEDV nhóm Bắc Mỹ từ chủng lưu hành Mỹ phát công bố gần phân tích trình bày nghiên cứu PHẦN KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1 KẾT LUẬN 1) Dịch PED xuất 10/10 tỉnh miền Bắc với tỷ lệ trung bình 41,98% diễn liên tục từ 2013-2015 Các trang trại vùng đồng có tỷ lệ dương tính PEDV cao rõ rệt so với trang trại tỉnh trung du- miền núi (68,42% so với 35,29%) 2) Lợn theo mẹ mắc PED với triệu chứng bệnh tích điển hình bệnh: phân có mùi gây đặc trưng (64%), phân có sữa khơng tiêu (38%); ruột non (60%) có cục sữa khơng tiêu đoạn ruột (20%) 3) Về đặc điểm di truyền: PEDV lưu hành Việt Nam khơng có nguồn gốc từ chủng virus vacxin có tính đa dạng di truyền với mức tương đồng trình tự gen S 63,7% - 87,9% gen ORF3 93% - 99% Các chủng virus mang đột biến thêm- xóa đột biến điểm vùng định kháng nguyên gen S dự đốn khơng dẫn tới khả lẩn tránh kháng thể trung hòa 4) Có genogroup PEDV lưu hành Việt Nam Trong genogroup bao gồm nhóm châu Á nhóm Bắc Mỹ Một số chủng kết trình tái tổ hợp gen S chủng virus thuộc genogroup genogroup 5) Về đặc điểm dịch tễ học phân tử: PEDV lưu hành Việt Nam có nguồn gốc đa dạng: virus thuộc genogroup nhánh châu Á genogroup có nguồn gốc trực tiếp từ Trung Quốc Trong virus thuộc nhánh Bắc Mỹ có nguồn gốc từ Mỹ Chủng virus tổ tiên PEDV lưu hành dự đoán tồn trước thời điểm xảy dịch PED khoảng 6-9 năm Sau xâm nhập, chủng PEDV Việt Nam có khả tạo thành nhánh di truyền riêng biệt tiếp tục lây lan địa phương khác 5.2 ĐỀ NGHỊ 1) Trong khuôn khổ đề tài, tiến hành nghiên cứu số đặc điểm dịch tễ học PED 10 tỉnh, thành miền Bắc Vì vậy, cần tiếp tục mở rộng phạm vi nghiên cứu để có tranh tồn diện đặc điểm dịch tễ học bệnh PED đặc điểm dịch tễ học phân tử PEDV lưu hành nước ta 2) Tiếp tục phân lập, xác định đặc tính sinh học, phân tích hệ gen PEDV, tiến tới sản xuất vacxin phòng bệnh PED chủng thực địa phục vụ cơng tác phòng chống dịch bệnh 24 DANH MỤC CƠNG TRÌNH Đà CƠNG BỐ CĨ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN Nguyễn Trung Tiến, Nguyễn Thị Thu Hằng, Huỳnh Thị Mỹ Lệ, Nguyễn Bá Hiên Lê Văn Phan (2015) Một số đặc điểm sinh học phân tử chủng virus gây dịch tiêu chảy cấp lợn (Porcine epidemic diarrhea - PED) thu thập Việt Nam từ năm 2013 2014 Tạp chí Khoa học Phát triển, 13 (7): 1089 - 1100 Yong Kwan Kim, Seong-In Lim, Ji-Ae Lim, In-Soo Cho, Eun-Hye Park, Van Phan Le, Nguyen Ba Hien, Pham Ngoc Thach, Do Hai Quynh, Tran Quang Vui, Nguyen Trung Tien and Dong-Jun An (2015) A novel strain of porcine epidemic diarrhea virus in Vietnamese pigs Archives of Virology, 160 (6): 1573 - 1577 Van Phan Le, Dinh Quyen Le, Duc Duong Than, Nguyen Trung Tien, Nguyen Ba Hien, SeEun Choe and Dong-Jun An (2016) Genetic diversity of the spike gene of the porcine epidemic diarrhea virus collected from the Central and Northern Vietnam during 2013 - 2016 Proceeding of the 19th FAVA, Ho Chi Minh city, Vietnam: 113 - 117 ... tài, tiến hành nghiên cứu số đặc điểm dịch tễ học PED 10 tỉnh, thành miền Bắc Vì vậy, cần tiếp tục mở rộng phạm vi nghiên cứu để có tranh tồn diện đặc điểm dịch tễ học bệnh PED đặc điểm dịch tễ học. .. CỦA ĐỀ TÀI - Đây nghiên cứu có hệ thống PED PEDV Việt Nam - Đã làm rõ đặc điểm dịch tễ học bệnh PED địa bàn 10 tỉnh/ thành phố miền Bắc Việt Nam Trên sở xác định biểu bệnh lý bệnh, đặc điểm dịch. .. lưu hành Việt Nam gần 10 năm, đến bệnh tiêu chảy thành dịch PEDV gây chủ đề mẻ Các nghiên cứu tìm hiểu đặc điểm dịch tễ học bệnh PED đặc điểm dịch tễ học phân tử virus lưu hành Việt Nam hạn chế