tóm tắt luận án tiến sĩ nghiên cứu một số đặc tính sinh học của virus cúm ah5n1 clade 7 phân lập ở việt nam

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI - NGUYỄN TÙNG NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ĐẶC TÍNH SINH HỌC CỦA VIRUS CÚM A/H5N1 CLADE PHÂN LẬP Ở VIỆT NAM C : Ký si trù v vi si vật ọc t ú s : 62.64.01.04 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SỸ HÀ NỘI, năm 2013 Cơng trình hồn thành tại: TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI Người hướng dẫn khoa học: TS Nguyễn Bá Hiên TS Nguyễn Văn Cảm Phản biện 1: PGS.TS Lê Thanh Hòa Phản biện 2: PGS.TS Trương Văn Dung Phản biện 3: TS Bùi Trần Anh Đào L ậ bảo vệ trước Hội đồ Trườ Đại ọc Nô v o ồi……… iờ…… c ấm L ậ cấp trườ iệp H Nội………………………… ……t …… ăm………… Có thể tìm hiểu luận án thư viện: - T việ q c ia Việt Nam - T việ Trườ Đại ọc Nơ iệp H Nội ọp MỞ ĐẦU Tính cấp thiết đề tài Bệnh cúm gia cầm xảy lầ Việt Nam cu i ăm 2003 đầ ăm 2004 ghi nhậ l vir s cúm A/H5N1 độc lực cao (HPAI) Kể từ c o đến Dịch cúm gia cầm H5N1 liên tục xảy Việt Nam nhiên quy mô dịc đ t a đổi trở nên nhỏ lẻ tẻ Cũ tro ữ ăm q a, ước khu vực c â Á N ật Bản, Hàn qu c, Trung qu c, L o T la , I esia… dịch cúm gia cầm cũ ả Việc kh ng chế dịch cúm gia cầm đ tiến hành cách mạnh mẽ, đ iảm thiể iều thiệt hại m vir s â nhữ bệnh tái phát tồn Vir s cúm A/H5N1 độc lực cao khơng nguy hiểm cho gia cầm mà cịn nguy hiểm đ i với co ười Từ ăm 2003 c o đến nay, giới đ i ận Virus cúm gia cầm đ â iễm l ười 15 ước, với 602 ca bệ v 355 ười đ chết (WHO,2012) Vir s cúm A/H5N1 có đặc tính biến đổi a v đế a đ có nhiề biế c ủ H5N1 đ phát phân lập nhiề ước khác từ châu Á sang châu Âu Đầ ăm 2008 Tr tâm C ẩ T ú Tr ươ đ p át iện phân lập chủng virus A/H5N1 thuộc clade từ gà nhập lậu biên giới vir s cúm A/H5N1 trước phát gà Trung qu c từ phát hiệ tr ười ăm 2003 Tr Q c đ sản xuất vacxin (Re-4) từ chủng virus A/H5N1 thuộc clade v đ sử dụng phòng bệnh s địa p ươ từ ăm 2006 [42] Với thực tế có nhiều gà nhập lậu vào Việt nam qua biên giới cho thấy nguy vir s xâm nhập nhiễm l đ ia cầm Việt Nam có đ i với co ười Vì cần phải tiến hành nghiên cứu đặc tính sinh học vir s ưk ả ă si bệ đ i với đ i tượng gia cầm khác nhau, khả ă bảo hộ vacxin hiệ đ i với c ú Từ có ữ p ươ c ủ độ t c cực để đ i p ó ế vir s âm ập v o đ ội địa ước ta Đứ trước thực tế tiế đề tài: “Nghiên cứu m t đặc tính sinh học viru c m A/H5N1 clade phân lập Việt Nam” nhằm góp phần cung cấp t ti l m sở cho việc xây dựng biện pháp phòng ch ng bệnh cúm gia cầm  Mục tiêu đề tài - ác đị đặc t di tr ề ọc, t k v độc lực cúm A/H5N1 clade p â lập Việt Nam ăm 2008; - Tạo sở iể biết rõ vir s cúm ia cầm độc lực cao H5N1, óp p ầ â dự biệ p áp p ò c bệ cúm ia cầm  Ý nghĩa khoa học đề tài Đâ tro ữ i Việt Nam có hệ th ng đặc tính sinh học virus cúm A/H5N1 clade - L m sở tham khảo cho việc nghiên cứu biế đổi virus cúm gia cầm, đặc biệt l đ i với ngành thú y - Kết q ả i đề t i có t ể sử dụ p ục vụ c o cô tác iả  Ý nghĩa thực tiễn đề tài - Kết q ả i l sở c o việc iể biết rõ s đặc t si ọc vir s cúm ia cầm - Kết q ả i có t ể sử dụ l m tiề đề để tiếp tục i vir s cúm ia cầm t ể độc lực cao H5N1, cũ cúm ia cầm độc lực t ấp, v loại vir s cúm k ác tr độ vật - Khuyến cáo cho việc sử dụng vacxin cúm phù hợp với virus lư thực tế - C ủ độ tro tác p ị ừa âm ập c ủ vir s cúm v o ội địa  Những đóng góp đề tài - Đ ác đị đặc t si ọc vir s cúm ia cầm độc lực cao H5N1 clade 7, đặc t k , độc lực, k ả ă â l tr độ vật cảm iễm, môi trườ ôi cấ - Đ ác đị đặc t di tr ề , cụ t ể l iải tr tự phân tích e HA-H5, NA-N1 v e atri vir s cúm A/H5N1 clade - Đá iá khả ă bảo hộ vacxin H5N1 Re-1 với vir s cúm A/H5N1 clade Việt Nam CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Nguyên nhân bệnh cúm gia cầm Cúm gia cầm (Avian Influenza-AI) bệnh truyền nhiễm cấp tính gia cầm, nhóm virus cúm type A, thuộc họ Ort om oviridae â Đâ l óm vir s có bi độ vật c ủ rộ , phân chia thành nhiều subtype khác dựa hai kháng nguyên bề mặt capsid hạt virus HA NA Nhóm virus cúm A có 16 subtype HA (từ H1 đến H16) subtype NA (từ N1 đến N9) Sự tổ hợp (reassortment) subtype HA NA, mặt lý thuyết, tạo nhiều subtype khác Mặt khác, vir s cúm A có đặc tính quan trọng dễ d đột biến gen/hệ e đặc biệt gen NA HA), trao đổi gen kháng nguyên với nhau, trình xâm nhiễm tồn lây truyền loài vật chủ dẫ đế việc tạo iề s bt pe có độc t v k ả ă â bệ k ác a Họ Ort om oviridae đ phát bao gồm óm vir s, l : óm virus cúm A (Influenza A); nhóm virus cúm B (Influenza B); nhóm virus cúm C (Influenza C); nhóm Thogotovirus Các nhóm virus khác kháng nguyên bề mặt capsid, virus cúm A B Hemagglutinin (HA), virus cúm C Hemagglutinin Esterase Fusion (HEF), Thogotovirus Glycoprotein 1.2 Kháng nguyên virus cúm gia cầm Vir s cúm t pe A ác định subtype dựa tr sở kháng nguyên (protein) bề mặt HA (Hemagglutinin-viết tắt H) NA(Neuraminidase-viết tắt N) có vai trị quan trọng miễn dịch bảo hộ Hema l ti i coi yếu t vừa định tính kháng nguyên, vừa đị độc lực virus cúm A 1.2.1 Protein HA (Hemagglutinin) Protein hemagglutinin glycoprotein thuộc protein màng type I (lectin), có khả ă â kết hồng cầu gà ng nghiệm (in vitro), kháng thể đặc hiệu với HA phong tỏa kết đó, gọi kháng thể ă trở kết hồng cầu (HI- Hema l ti i I ibitor a tibod Có 16 s bt pe HA đ phát (H1 - H16), ba subtype (H1, H2 H3) thích ứng lây nhiễm gây bệnh ười li q a đế đại dịch cúm lịch sử Có khoảng 400 phân tử HA bề mặt capsid virus, có vai trị quan trọng trình nhận diện virus khởi động trình xâm nhiễm virus vào tế bào chủ 1.2.2 Protein NA (Neuraminidase) Protein neurominidase gọi sialidase protein enzyme có chất glycoprotei gắn bề mặt capsid virus cúm A, mang tính kháng nguyên đặc trư t eo subtype NA Có subtype (từ N1 đế N9 phát chủ yếu virus cúm gia cầm, s bt pe N1 v N2 tìm thấy vir s cúm ười liên quan đế đại dịch cúm lịch sử Protein NA có vai trị enzyme cắt đứt liên kết g c sialic acid màng tế bào nhiễm với phân tử cacbonhydrate protein HA, giải phóng hạt virus khỏi màng tế bào nhiễm, đẩy nhanh lây nhiễm vir s tro t ể vật chủ, v ă cản tập hợp hạt virus màng tế bào Mặt khác, NA tham gia vào phân cắt liên kết tro iai đoạ “ ịa m ”, đẩy nhanh q trình cởi áo “ coati ” iải phóng hệ gen virus vào bào tươ tế bào nhiễm, giúp cho trình nhân lên virus diễ a 1.2.3 Đ c lực khả gây bệnh virus cúm gia cầm Khả ă lâ iễm virus phụ thuộc v o tác động men protease vật chủ đến phá vỡ liên kết hoá học sau dịch mã phân tử liên kết Các enzym gi tr psi có k ả ă p vỡ liên kết có phân tử arginin, k i me protease k ác lại cần nhiề ami oa it bản, đá iá độc lực vir s tr sở gây nhiễm cho gia cầm v sa p â t c xếp aminnoaxit virus Cụ thể ười ta q a tâm đến việc giải trình tự vù “cleava e site” gen HA mà có mặt axit amin ar i i e R a l si e K cho phép dự đố rằ vir s có độc lực cao hay không Trong thực tế ười ta chia virus cúm làm loại: Loại vir s có độc lực thấp (LPAI) loại vir s có độc lực cao (HPAI) - LPAI loại virus phát triể tro t ể nhiễm, gây bệnh cúm nhẹ khơng có triệu lâm s điển hình không làm chết vật chủ - HPAI loại virus cúm A có khả ă â tổ t ươ iề q a ội tạng tro t ể nhiễm, gia cầm c ú t ường gây chết 100% s gia cầm bị nhiễm vòng 48-72 sau nhiễm Các vụ dịch lớ đề vir s HPAI â ra, t ường virus có kháng nguyên H5 H7 CHƯƠNG NỘI DUNG - NGUYÊN LIỆU - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 N i dung 2.1.1 Phân lập giám định virus cúm gia cầm A H N1 t mẫu dịch ngoáy nhớp - ác đị vir s cúm ia cầm A/H5N1 bằ p ươ p áp Realtime RT-PCR (RRT-PCR) - Phân lập virus phôi trứng gà 9-10 ngày tuổi đ i với mẫ t iệm dươ t cúm A/H5N1 - Giám đị vir s p â lập phản ứng HA, HI RRT-PCR 2.1.2 Xác định đặc tính di truyền học viru c m A/H5N1 clade M i quan hệ di truyền virus A/H5N1 clade với virus A/H5N1 khác thơng qua phân tích hệ phả e HA, NA v 2.1.3 Xác định m t s đặc tính sinh học virus A/H5N1 clade - Tính thích ứng phơi gà, tế b o p ôi - ác đị độc lực vir s cúm A/H5N1 clade s độ vật t iệm (gà, vịt ngan) - Một s đặc điểm bệ lý bả vir s cúm A/H5N1 clade tr 2.1.4 Xác định đặc tính kháng nguyên (tính tương đồng kháng nguyên) - M i quan hệ kháng nguyên học virus A/H5N1 clade với virus A/H5N1 khác thông qua HI chéo với s c ủ vir s cúm A/H5N1 t ộc s clade khác 2.1 Xác định hiệu lực vacxin H5N1 Re-1 - Hiệu vacxin cúm gia cầm Re-1 Việt Nam đ i với virus cúm gia cầm A/H5N1 clade tr 2.2 Địa điểm nghiên cứu - Nơi t t ập mẫ vù bi iới Lạ - P ị Vir s – Tr tâm C ẩ đố T ú Tr ươ - Cục T ú - ộ p ậ Cúm, Tr tâm P ò c dịc bệ C C – Hoa K 2.3 Vật liệu phương pháp nghiên cứu 2.3.1 Vật liệu nghiên cứu: - Dịch swab (ngoáy ổ nhớp) từ gà nhập lậu; Vir s cúm A/H5N1 phân lập từ dịch swab; Phôi trứng gà 9-10 ngày tuổi, tế b o p ôi c ế từ phôi gà 9-10 ngày tuổi; Gia cầm (gà, vịt v a k ỏe mạ âm t kháng thể cúm gia cầm - Vắc i cúm ia cầm A/H5N1 Re-1; Kháng nguyên kháng thể chuẩn cúm gia cầm H5N1; Kít chiết tách Qiagen Rneasy minikit Kít realtime RT-PCR Invitrogen superscriptIII; Primer v probe c o H5N1, Primer v k t để giải trình tự gen 2.3.2 Phương pháp nghiên cứu: 2.3.2.1 Phương pháp điều tra hồi cứu K i iải tr tự e v p â t c câ p át si lo i p át iệ vir s A/H5N1 clade 7, điề tra ược lại mẫ đ t iệm tro p ò t iệm từ cù 2.3.2.2 Phương pháp phân lập virus phơi trứng gà Bệnh phẩm dịch ngốy ổ nhớp từ ập lậ xử lý, phân lập xoang niệu mô phôi trứng gà ngày tuổi, t eo dõi đế 96 iờ; kiểm tra phản ứ HA để ác định khả ă â kết hồng cầu gà phản ứng HI với kháng thể chuẩn cúm gia cầm để iám định virus phân lập 2.3.2.3 Xác định ch ID50 Virus p a lo t iề độ t eo s 10 v iễm l oa iệ mô p ôi trứ T ực iệ p ả ứ HA đ i với ước trứ để ác định phôi iễm virus A/H5N1 ác đị c ỉ s I 50 virus 2.3.2.4 Xác định ch TCID50 Virus p a lo t iề độ t eo s 10 v iễm lên tế b o phôi gà Quan sát CPE để ác định iễm virus A/H5N1 ác đị c ỉ s TCID50 virus 2.3.2.5 Phương pháp gây bệnh cho đ ng vật thí nghiệm (gà, vịt ngan): Gây nhiễm bệ q a đườ mũi cách nhỏ dịc vir s pha loãng 1/10 oặc dù liề â iễm l 10-6 TCID50 T eo dõi tro vò 10 để đá iá độc lực vir s T eo p ươ p áp OIE) 2.3.2.6 Phương pháp HA, HI giám định viru ác định đặc tính kháng nguyên viru c m A/H5N1 clade Chúng sử dụ q tr HA, HI OI để iám định virus phân lập 2.3.2.7 Phát viru realtime RT-PCR (RRT-PCR) - Chiết tách RNA vir s cúm A/H5N1bằng kít Qiagen Rneasy minikit - Chạy phản ứng RRT-PCR phát virus cúm 2.3.2.8 Phương pháp làm tiêu xét nghiệm bệnh tích vi thể Các mẫu phủ tạng xử lý, đúc k ô , cắt lát microtome nhuộm HE để quan sát biế đổi bệnh lý kính hiển vi 2.3.2.9 Phương pháp giải trình tự gen: Sản phẩm PCR giải trình tự máy sequence tự động ABI 3730; Sử dụng phần mềm ioedit 7.0.9 để thực việc so sánh chu i trình tự (Alignment); Lập hệ phả gen HA, NA M dựa tr p ươ p áp Nei bor-joining (NJ) với phần mềm MEGA so sánh với vir s cúm A/H5N1thuộc clade (nhánh) khác với g c virus clade (A/goose/Guangdong/1/1996) 2.3.2.10 Tiêm phòng vacxin cho gà, đánh giá ch s gây bệnh lâm sàng G tiêm phòng vacxin cúm A/H5N1 Re-1 sa thử t ác cườ độc virus cúm A/H5N1clade 106TCID50/100 µl/ q a đường nhỏ mũi tro k c ôi độ vật đảm bảo điề kiệ a to si ọc Theo dõi biểu lâm s tro vò 10 sa k i cô , đá iá c ỉ s gây bệnh lâm v ác định tỷ lệ bảo hộ CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Phân lập giám định virus cúm A/H5N1 clade Tro iai đoạ ăm 2008, đ có tổng cộng 495 mẫu swab ngoáy ổ nhớp từ gà nhập lậ thu thập gửi đến Trung tâm Chẩ T ú Tr ươ xét nghiệm Tro có 275 mẫ dịc s ab từ ệ Cao Lộc v 220 mẫ dịc s ab từ ệ Lộc tỉ Lạ Đ p át iện thấy 17 mẫu bệnh phẩm dươ t với vir s cúm A, tro có 10 mẫ p át iệ Cao Lộc v mẫ Lộc , đạt tỷ lệ trung bình 3,43% (17/495) Xét nghiệm mẫ dươ tính virus cúm A bằ p ươ p áp Realtime RTPCR phát 15/17 mẫ dươ t vir s A/H5N1, đạt tỷ lệ trung bình 3,03% Các mẫ dươ t vir s cúm A/H5N1 đề phát huyện Cao Lộc Lộc Bình Tiếp tục phân lập phơi trứng, chúng tơi đ p â lập c ủ vir s cúm A/H5N1 Cả c ủ đề l mẫ từ ệ Cao Lộc Bảng 3.1 Kết xét nghiệm phân lập virus t chương trình giám át biên giới (Lạng Sơn) Kết q ả ươ t cúm A ươ t H5N1 P â lập vir s H ệ mẫ (RRT-PCR) (RRT-PCR) mẫ Tỷ lệ % mẫ Tỷ lệ % mẫ Tỷ lệ % Cao Lộc 275 10 3,64 2,91 1,82 Lộc 220 3,18 3,18 0,00 495 17 3,43 15 3,03 1,01 3.2 Xác định đặc tính di truyền viru c m A H N1 thu c clad phân lập Việt Nam phương pháp giải trình tự lập phát sinh lồi 3.2.1 Giải trình tự gen HA/H5 phân tích phát sinh lồi (phylogeny) dựa chuỗi nucleotide gen H5 Tên mẫ đ p â lập vir s cúm A/H5N1và tên mẫu RNA đ p át iệ dươ t vir s cúm A/H5N1 đặt theo danh pháp qu c tế: Tên t pe cúm A/Lo i/T ước/Tên viết tắt Trung tâm Chẩ T ú Tr ươ tiếng Anh-ký hiệu virus mẫ Kết q ả c i tiết mẫ đ p â lập phát hiệ dươ t vir s cúm A/H5N1 trình bày bảng 3.2 Việc tìm kiếm tươ đồng virus cúm ngân hàng liệu gen HA cho thấy mẫ vir s có độ tươ đồng cao với hai chủ vir s đ mô tả trước đâ thuộc clade virus A/chicken/Hebei/326/2005/H5N1 virus A/c icke / a i/2/2006/H5N1 độ tươ đồng trung bình gen HA mức độ nuleotide lầ lượt l 96,1 v 96,3 v 15 mẫ đề ếp ằm tro óm Bảng 3.2 S TT 10 11 12 13 14 15 ết uả giải trình tự g n phân tích phát inh loài chủng viru c m A H N1 phát Lạng Sơn A/Chicken/Vietnam/NCVD-016/2008 A/chicken/Vietnam/NCVD-03/2008 A/chicken/Vietnam/NCVD-04/2008 A/chicken/Vietnam/NCVD-05/2008 A/chicken/Vietnam/NCVD-093/2008 Địa điểm phát Cao Lộc Cao Lộc Cao Lộc Cao Lộc Cao Lộc Phân loai clade/nhóm 7/Nhóm B 7/Nhóm B 7/Nhóm B 7/Nhóm A Tên mẫu dương tính virus cúm (không phân lập virus) A/chicken/Vietnam/NCVD-swab06/2008 A/chicken/Vietnam/NCVD-swab15/2008 A/chicken/Vietnam/NCVD-swab16/2008 A/chicken/Vietnam/NCVD-swab17/2008 A/chicken/Vietnam/NCVD-swab18/2008 A/chicken/Vietnam/NCVD-swab19/2008 A/chicken/Vietnam/NCVD-swab20/2008 A/chicken/Vietnam/NCVD-swab24/2008 A/chicken/Vietnam/NCVD-swab25/2008 A/chicken/Vietnam/NCVD-swab26/2008 Cao Lộc Lộc Bình Lộc Bình Lộc Bình Lộc Bình Cao Lộc Cao Lộc Lộc Bình Lộc Bình Lộc Bình 7/Nhóm B 7/Nhóm A 7/Nhóm B 7/Nhóm A 7/Nhóm A 7/Nhóm B 7/Nhóm B 7/Nhóm B 7/Nhóm B Tên chủng virus cúm phân lập Subtype H5N1 H5N1 H5N1 H5N1 H5N1 H5N1 H5N1 H5N1 H5N1 H5N1 H5N1 H5N1 H5N1 H5N1 H5N1 Đá c ú ý, k i q a sát tr câ p át si lo i dựa tr e HA có t ể t ể t ấ rõ có 13 s 15 mẫ vir s cúm A/H5N1 clade Việt Nam tác t óm nhỏ rõ rệt tr câ p át si lo i (xem hình 3.2.), tạm gọi l óm A v óm để p â t c Các gen HA nhóm virus A B hiển thị khác biệt nhóm mức độ t ấp đ i với chu i cleotide cũ ưc i axit amin, cụ thể khác biệt trung bình tổng thể nucleotide 0,39% a it ami l 0,38 N ược lại, khác óm A v óm đạt trung bình 4,05% 5,69% lầ lượt mức độ nucleotide amino acid khắp vùng gen HA mã hóa ặc dù e HA nhóm A B khác biệt chu i nucleotide axit amin t ấp tro cù óm, khác biệt óm đạt tr b 4,1 mức độ cleotide v 5,7 mức độ axit amin gen HA (Bảng 3.4) Mức độ khác biệt cao tươ đươ với thay ≥ 30 a it ami iữa chu i protein HA hai nhóm Hình 3.2 Cây phát inh lồi dựa chuỗi nucleotide gen H5 viru c m A/H5N1 clade (Phương pháp phân tích Neighbor-joining sử dụng phần mềm MEGA 5, giá trị boostrap 1000) Ngoài ra, khác biệt trung bình tất vir s đ iải trình tự nghiên cứu so với tổ tiên gần gen HA A/chicken/Shanxi/2/2006 3,8% (3,3-3,9%) mức độ cleotide v 5,8 5,4-6,1 mức độ v a it ami (Bảng 3.4) Tóm lại, liệu cho thấy virus A/chicken/Shanxi/2/2006 tổ tiên gần HA e ác định nghiên cứu 11 virus clade Việt Nam Tuy nhiên, nhận thấ rõ r l vir s cúm A/H5N1thuộc clade Trung Qu c cũ Việt Nam đề có độ tươ đồng cao khác biệt hoàn toàn với clade khác đa lư tro k vực Việc phân tích khác biệt di truyền gen N1 cleotide v mức độ axit amin c ủ vir s A/H5N1 t ộc clade Việt Nam s c ủ vir s Trung Qu c v Việt Nam trình bày bảng 3.6 So sánh cho thấy sai khác di truyền óm vir s cúm A/H5N1 clade Việt Nam đ tr l A/c icke /Viet am/NCV -03/2008, A/chicken/Vietnam/NCVD-04/2008, A/chicken/Viet am/NCV -05/2008 v A/C icke /Viet am/NCV -016/2008 l thấp, ≤ mức độ cleotide v ≤2,7 mức độ axit amin N óm vir s có độ khác biệt tươ đ i lớn so với c ủ vir s khác Việt Nam cũ t ộc clade A/chicken/Vietnam/NCVD-093/2008 Sự sai k ác cleotide v a it ami óm c ủ vir s tr v vir s A/chicken/Vietnam/NCVD-093/2008 lầ lượt 4,7±0,2% (4,5-4,9%) 5,6±0,3% (5,3-6,0%) Bảng 3.6 Mức đ khác biệt di truyền gen N1 chủng viru c m A/H5N1 clade so sánh với m t s chủng tham chiếu Ký iệ Tên chủng 10 11 12 13 14 Axit amin (%) A/Chicken/Vietnam/NCVD-016/2008 A/Chicken/Vietnam/NCVD-03/2008 1.9 A/Chicken/Vietnam/NCVD-04/2008 2.0 0.5 A/Chicken/Vietnam/NCVD-05/2008 2.0 0.4 0.4 A/Chicken/Vietnam/NCVD-093/2008 4.5 4.7 4.9 4.5 A/chicken/Shanxi/10/2006 1.6 1.4 1.6 1.7 4.5 A/chicken/Shanxi/2/2006 2.7 2.5 2.7 2.7 4.1 2.4 A/Beijing/01/2003 2.4 2.7 3.0 2.8 2.3 2.3 2.3 A/Viet_Nam/1194/2004 4.7 5.2 5.4 5.4 4.3 4.7 4.6 2.8 10 A/Viet_Nam/1203/2004 4.2 4.8 5.0 5.0 3.8 4.3 4.1 2.3 1.0 11 A/goose/Viet_Nam/113/2001 6.6 6.7 6.8 6.4 5.7 6.5 6.0 4.5 5.6 12 A/Hong_Kong/156/97 14.2 14.8 15.1 14.7 13.8 14.4 13.2 13.0 13.8 13.3 12.2 13 A/goose/Vietnam/3/05 13.0 13.4 13.7 13.3 12.3 13.0 11.9 11.4 12.3 11.7 10.9 1.8 14 A/Goose/Guangdong/1/96 5.2 11.1 2.5 2.7 5.3 2.3 3.0 3.4 5.0 4.8 6.2 9.5 9.7 5.3 0.7 5.6 2.7 0.4 5.5 2.0 2.5 3.6 5.8 5.5 6.2 9.7 9.9 5.3 0.4 6.0 2.3 3.0 4.1 6.0 5.8 6.7 10.2 10.4 5.8 5.5 2.3 2.7 3.6 6.0 5.8 6.2 10.0 10.2 5.3 5.5 4.1 2.5 5.5 5.0 5.3 9.7 9.9 4.1 2.7 3.6 5.5 5.5 6.5 10.2 10.4 5.3 2.0 4.6 4.1 4.8 8.5 8.5 3.9 3.6 3.2 3.6 8.2 8.2 2.3 0.9 5.0 8.7 8.7 3.4 4.6 8.2 8.2 3.4 7.9 7.7 2.8 1.1 6.9 5.9 5.5 4.3 5.3 5.0 3.0 3.6 4.9 3.3 3.2 6.9 9.8 Nucleotide (%) Chủ vir s A/c icke /Viet am/NCV -093 mặt q a ệ ệ p ả ần với chủ vir s A/ ei i /01/2003, l c ủ vir s p â lập ười ăm 2003 Trung Qu c Cụ thể sau khác 2,3% mức độ nucleotide 2,5% mức độ axit amin Sự sai khác lớn q a sát t vir s cúm A/H5N1 t ộc clade t t ập Việt Nam so với c ủ vir s A/H5N1 có hiệ tượ đột biế óa 19 axit amin (virus A/Hong_Kong/156/97 virus A/goose/Vietnam/3/05 l 12,3-15,1 cleotide v 9,5 - 10,4%.ở mức độ axit amin 12 3.2.3 ết uả giải trình tự gen M lập phát sinh loài dựa chuỗi nucleotide gen M Dựa sai k ác c i gen M c ủ vir s A/H5N1 so sá c ú tơi đ lập phát sinh lồi (phylogenetic tree để theo dõi tiến hóa chủng virus (Hình 3.5) 67 52 94 94 83 A/CHICKEN/VIETNAM/NCVD-04/2008 A/CHICKEN/VIETNAM/NCVD-05/2008 A/CHICKEN/VIETNAM/NCVD-093/2008 Clade A/CHICKEN/VIETNAM/NCVD-03/2008 A/CHICKEN/VIETNAM/NCVD-016/2008 91 A/chicken/Shanxi/10/2006 2006 83 Clade A/chicken/Shandong/A-10/2006 2006 35 A/chicken/Shanxi/2/2006 A/Beijing/01/2003 33 33 A/chicken/Korea/es/2003 A/black-headed goose/Qinghai/1/2005 99 99 A/chicken/Bhutan/248006/2010 A/duck/India/TR-NIV4396/2008 A/duck/Hunan/1386/2003 A/Indonesia/239H/2005 96 14 59 A/Indonesia/CDC1046/2007 55 A/Indonesia/535H/2006 58 A/Ck/Indonesia/2A/2003 2003 27 A/chicken/East Java/UT6045/2007 A/duck/Guangxi/351/2004 28 A/chicken/Thailand/ICRC-7356/2010 80 68 53 A/Thailand/Kan353/2004 2004 A/duck/Vietnam/48/2004 2004 34 A/Cambodia/P0322095/2005 51 A/Vietnam/CL100/2004 53 A/duck/Vietnam/286/2005 66 A/Muscovy duck/Ca Mau/07-04/2007 A/chicken/Lang Son/200/2005 2005 74 A/duck/Guiyang/3834/2005 2005 31 A/Anhui/T2/2006 2006 46 77 A/Anhui/2/2005 2005 25 68 A/Shanghai/1/2006 2006 A/crested myna/Hong Kong/540/2006 41 99 97 83 A/Hong Kong/6841/2010 A/mallard/Korea/1195/2010 33 A/Hunan/1/2006 77 A/duck/Guangxi/150/2006 A/duck/Laos/P0117/2007 A/duck/Zhejiang/52/2000 A/goose/Fujian/bb/2003 100 A/goose/Vietnam/3/05 2005 99 A/Duck/Hong Kong/y283/1997 A/Hong Kong/156/1997 A/duck/Shantou/195/2001 94 93 A/Chicken/Hong Kong/SF219/2001 A/Goose/Guangdong/1/96 002 Hình 3.5 Cây phát sinh loài dựa g n M cácchủng viru A/H5N1 clade (Được lập phương pháp phân tích n ighbor-joining sử dụng phần mềm MEGA 5, giá trị boostrap 1000) Kết phân tích cho thấy c ủ vir s cúm ia cầm A/H5N1 t ộc clade Việt Nam có độ tươ đồ cao v ằm nhóm với c ủ vir s cúm A/H5N1Clade Trung Qu c, chứng tỏ gen M vir s cúm A/H5N1clade 13 Việt Nam Trung Qu c có nguồn g c Để thấ rõ khác biệt di truyền mức độ nucleotide axit amin, so sánh gen M c ủ vir s cúm A/H5N1clade Việt Nam với s vir s cúm A/H5N1của Trung Qu c Kết biểu thị bảng 3.8 Mức độ sai khác di truyền gen M c ủ vir s cúm A/H5N1clade Việt Nam với a k ô đá kể, sai khác t i đa mức độ nucleotide 1% mức độ axit amin 0,6% Mức độ sai khác c ủ vir s cúm A/H5N1thuộc clade Việt Nam v c ủ t ộc clade Tr Q c cũ thấp Sự sai khác t i đa di truyền mức độ nucleotide axit amin virus nhóm lầ lượt 3,0±0.1% 3,3±0.2% (virus A/chicken/Shanxi/2/2006) Sự sai k ác di tr ề iữa c ủ vir s cúm t ộc clade c ú p â lập với c ủ vir s t ộc clade k ác tr sở gen M cleotide v a it ami k ô iề , c ỉ tro k oả 3,6 cleotide v 2-4 a it amin Hai c ủ A/goose/Vietnam/3/05 chủ A/Ho Ko /156/97 t ộc clade t có k ác biệt k lớ : sai k ác mức độ cleotide tới 10 v mức độ a it ami tới 7%.Một c ủ vir s A/H5N1 k ác cũ t ộc clade chủng A/Goose/G a /1/96, coi thủy tổ c ủ vir s cúm A/H5N1độc lực cao, có độ sai khác di truyền với c ủ vir s t ộc clade Việt Nam mức độ nucleotide 5,3±0.2% (5,2-5,6%) mức độ axit amin 4,2±0.2 % (4,14,4%) Bảng So ánh mức đ khác biệt di truyền gen M chủng viru c m A H N1 thu c clad so sánh với m t s chủng tham chiếu hiệu Tên chủng viru 10 11 12 13 14 15 Axit amin (%) A/Chicken/Vietnam/NCVD-016/2008 A/chicken/Vietnam/NCVD-093/2008 1.0 A/chicken/Vietnam/NCVD-03/2008 0.9 0.3 A/chicken/Vietnam/NCVD-04/2008 0.9 0.3 0.2 A/chicken/Vietnam/NCVD-05/2008 0.9 0.3 0.2 0.0 A/chicken/Shandong/A-10/2006 1.3 1.3 1.2 1.2 1.2 A/chicken/Shanxi/10/2006 0.8 0.9 0.8 0.8 0.8 0.8 A/chicken/Shanxi/2/2006 3.1 3.1 2.8 2.9 2.9 2.8 3.0 A/Beijing/01/2003_2003 2.4 2.4 2.3 2.3 2.3 1.7 2.1 3.5 10 A/goose/Vietnam/3/05 10.0 10.1 9.7 9.7 9.7 10.0 10.4 9.3 8.7 11 A/Anhui/2/2005 3.0 3.1 3.0 3.0 3.0 2.4 2.7 4.0 0.9 8.1 12 A/blackheadedgoose/Qinghai/1/2005 3.2 3.2 3.2 3.2 3.2 2.6 2.7 4.0 1.4 9.3 1.3 13 A/goose/Fujian/bb/2003 4.0 4.1 3.8 3.8 3.8 3.4 3.7 4.4 2.1 8.1 2.0 2.3 14 A/Goose/Guangdong/1/96 5.5 5.6 5.2 5.2 5.2 5.0 5.3 5.7 3.5 6.0 3.4 3.8 3.2 15 A/Hong_Kong/156/97 10.7 10.8 10.5 10.5 10.5 10.7 11.1 9.3 9.4 1.3 8.8 9.8 8.8 0.6 0.3 0.3 0.3 1.6 1.3 3.5 1.9 7.4 1.9 2.1 3.8 4.4 7.4 0.3 0.3 0.3 1.6 1.3 3.5 1.9 7.4 1.9 1.8 3.8 4.4 7.4 0.0 0.0 1.3 0.9 3.2 1.6 7.1 1.6 1.8 3.5 4.1 7.1 0.0 1.3 0.9 3.2 1.6 7.1 1.6 1.8 3.5 4.1 7.1 1.3 0.9 3.2 1.6 7.1 1.6 1.8 3.5 4.1 7.1 0.9 3.8 1.6 7.4 1.6 1.8 3.5 4.4 7.4 4.1 1.6 7.4 1.6 1.8 3.5 4.4 7.4 3.2 7.4 3.2 3.5 5.1 5.8 7.4 5.8 0.0 0.7 1.9 2.8 5.8 5.8 5.7 5.8 3.8 0.0 0.7 1.9 2.8 5.8 2.1 3.2 5.7 2.8 5.8 3.8 7.5 Nucleotide (%) Tóm lại, kết phân tích phát sinh lồi, kết phân tích sai khác di truyền dựa gen H5, N1 M c ủ vir s cúm A/H5N1Clade Việt Nam 14 cho thấ , c ủ vir s t ộc clade Việt Nam có độ tươ đồng cao với a c ứ tỏ c ú có cù ồn g c, v tươ đồ với c ủ vir s A/H5N1 cũ t ộc clade p â lập Tr Q c 3.3 Xác định m t s đặc tính sinh học viru A H N1 clad phân lập Việt Nam (A/chicken/Vietnam/NCVD-016/2008) 3.3.1 Tính thích ứng phôi gà ( ác định ch s EID50) Virus bắt đầu giết chết phơi vịng ngày từ sau gây nhiễm Điều cũ p ù ợp với nghiên trước đâ rằ vir s cúm độc lực cao t ường giết chết phơi trứng vịng 48 sau gây nhiễm xoang niệu mô Kết ác đị k ả ă â iễm tr p ôi v c ỉ s I 50 c ủ virus A/Chicken/Vietnam/NCVD-016/2008 trình bày bảng 3.10 - Ở nồ độ pha lỗng 10-3, tồn phơi trứng chết vòng 40h sau gây nhiễm Bảng 3.10 Kết theo dõi tỷ lệ s ng/chết phôi trứng gây nhiễm virus A/Chicken/Vietnam/NCVD-016/2008 Lầ t iệm Lầ Lầ Lầ Hiệ iá p a lo p ôi â iễm 10-3 10-4 10-5 10-6 10-7 10-8 ĐC -) EID50/0,1ml 10-3 10-4 10-5 10-6 10-7 10-8 ĐC -) EID50/0,1 ml 10-3 10-4 10-5 10-6 10-7 10-8 ĐC -) EID50/0,1 ml p ôi bị iễm p ôi k ô iễm Nhiễm virus (A) t c lũ Tỷ lệ iễm Khơng virus (%) Tổng cộng nhiễm A/(A+B)×100 (A+B) (B) 20 100 15 100 10 100 83.3 16.7 10 10 20 15 10 5 0 107 t eo cô t ức Reed-Muench) 19 14 4 0 106.9 t eo cô t ức Reed-Muench) 19 14 4 0 106.9 t eo cô t ức Reed-Muench) 0 10 19 14 10 100 100 100 80.0 16.7 0 0 10 19 14 10 100 100 100 80.0 16.7 0 - Nồ độ 10-4:toàn s phôi trứng chết ngày thứ hai, khoảng 40-48 sau nhiễm - Nồ độ 10-5: giết chết tồn phơi trứ tro t ời ia lâ so với nồ độ 10-3 10-4, cũ k ô q 72 kể từ gây nhiễm 15 - Nồ độ 10-6: p ôi t ườ c ết tro vò 72-96 Ở độ p a lo t ườ vẫ có 1-2 phơi cịn s ng (tùy theo lần thí nghiệm khác nhau) - Nồ độ pha lỗng cao gây chết phơi trứng 10-7, nhiên có 1/5 phơi chết thời điểm 96h , phơi cịn s ng - Đ i c ứ âm: p ôi trứ s k ỏe mạ , b t ườ T tr b c ẩ độ vir s tr p l 107,9EID50/ml 3.3.2 Tính thích ứng tế bào phôi gà ( ác định ch s TCID50) Kết ác đị k ả ă â iễm tr tế b o p ôi v c ỉ s TCI 50 c ủ vir s A/Chicken/Vietnam/NCVD-016/2008 trình bày bảng 3.12 - Từ nồ độ 10-2 đến nồ độ 10-5 toàn giếng tế b o có CPE thảm tế b o đ bị virus phá hủy vòng 24-72 Đặc biệt nồ độ 10-2 v 10-3 thảm tế bào bị phá hủy hoàn toàn sau 24 nhiễm - Nồ độ 10-6 t ườ c ỉ có 3-4 giếng có hiệ tượng bệnh tích tế bào CPE bị virus phá hủy Bảng 3.12 Kết theo dõi bệnh tích tế bào CEF gây nhiễm virus A/Chicken/Vietnam/NCVD-016/2008 Lầ t Hiệ iá iệm p a lo Lầ Lầ Lầ iế â iễm 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6 10-7 -8 10 ĐC -) TCID50/0,1ml 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6 10-7 10-8 ĐC -) TCID50/0,1ml 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6 10-7 10-8 ĐC -) TCID50/0,1ml iế t c lũ Tỷ lệ iễm Không virus (%) Tổng cộng nhiễm A/(A+B)×100 (A+B) (B) 24 100 19 100 14 100 100 57.1 25 11 11 giếng có CP k có CPE Nhiễm virus (A) 5 5 2 0 0 0 3 5 24 19 14 0 0 5 24 19 14 0 0 0 11 24 19 14 11 100 100 100 100 80 0 0 0 5 23 18 13 0 0 0 12 23 18 13 12 100 100 100 100 60 0 106,2 5 5 0 106,4 5 5 0 106,2 - Nồ độ 10-7 có giếng nhiễm virus lần thí nghiệm thứ nhất, lần thứ khơng có giếng nhiễm virus 16 - Nồng độ 10-8 khơng có CPE, tức khơng có hiệ tượng nhiễm virus T tr b c ẩ độ vir s tr tế b o p ôi l 107,3TCID50/ml 3.3.3.Kết ác định đ c lực viru c m A/H5N1clade 3.3.3.1 Thông s đ c lực dựa đặc tính phân tử Độc lực mức độ lây nhiễm virus cúm gia cầm phụ thuộc v o tác động enzyme protease vật chủ đến phá vỡ liên kết hóa học tính thụ cảm kết t , phá vỡ liên kết men protease phụ thuộc vào s lượng axit ami vù “Cleava e site” gen HA vir s, l a it ami arginine (R) lysine (K) Khi giải trình tự e HA, c ú tơi ác định mức độ có mặt s lượng a it ami arginine Lysine vù “cleava e site” c ủ vir s cúm A/H5N1 clade Kết trình tự vù “cleava e site” c ủ vir s đại diệ c o clade Việt Nam l A/C icke /Viet am/NCV -016/2008 v s vir s cúm A/H5N1 thuộc s clade k ác so sánh bảng 3.13 Bảng 3.13 Các a it amin vùng ‘cl avag it ” m t s virus cúm H N1 đ c lực cao m t chủng tham chiếu Nơi phân lập Virus strain Clade HA0 cleavage site A/Chicken/Vietnam/NCVD-016/2008 A/goose/Guangdong/1/96 Tr c PQRERRRKKR*GLF A/Hong_Kong/213/03 Hong Kong PQRERRRKKR*GLF A/chicken/Vietnam/15/2007 Việt Nam PQREGRRKKR*GLF A/chicken/Egypt/9403/2007 2.2 Ai Cập PQGERRRKKR*GLF A/chicken/Primorje/1/2008 2.3.2 Nga PQRERRRKR*GLF A/duck/Vietnam/568/2005 2.3.2 Việt Nam PQRERRRKR*GLF A/Anhui/1/2005 2.3.4 Tr A/duck/Vietnam/37/2007 2.3.4 Việt Nam PQREGGRRRKR*GLF Q Q A/chicken/Yunnan/493/2005 2.4 Tr A/crow/Osaka/102/2004 2.5 Q c PLRERRRKR*GLF PLRERRRKR*GLF N ật ả c PQRERRRKR*GLF PQRE-RRKKR*GLF A/Pheasant/Hong_Kong/FY155/01 Hong Kong PQRERRRKKR*GLF A/goose/Guiyang/337/2006 Tr Q c PQRERRRKKR*GLF A/duck/Guangxi/668/2004 Tr Q c PQREIRRKKR*GLF A/chicken/Yichang/lung-1/04 Tr Q c PQRERRRKKR*GLF A/chicken/Shanxi/2/2006 Tr Q c PQREGGRRKR*GLF A/Chicken/Hong_Kong/YU22/2002 Hong Kong PQRERRRKKR*GLF A/goose/Shantou/1621/05 Tr PQRERRRKKR*GLF Q c Chủng A/Chicken/Vietnam/NCVD-016/2008 có motif chứa nhiều axit ami bả ar i i e v L si e vù “cleava e site”, cho thấ vir s cúm A/H5N1 ếp loại v o óm vir s cúm có độc lực cao đ i với gia cầm 17 3.3.3.2 Đánh giá đ c lực đ ng vật thí nghiệm Để đá iá độc lực virus sử dụng chủng virus A/Chicken/Vietnam/NCVD-016/2008 qua phân tích phát sinh lồi (phylogeny) giựa tr e HA, vir s ằm c óm c ủ vir s A/H5N1 clade Việt Nam v ầ ất với vir s cúm A/H5N1clade Tr Q c M i động vật thí nghiệm cườ độc với liều 106TCI 50/100µl vir s cúm A/H5N1clade q a đường nhỏ mũi T iệm lặp lại lầ Kết tổng hợp theo dõi thí nghiệm đá iá độc lực virus A/Chicken/Vietnam/NCVD016/2008 trình bày bảng 3.14 Bảng 3.14: Kết đánh giá đ c lực viru c m A/H5N1 Clade gia cầm Động vật S Điểm Thời gian Lầ t Chết Tỷ thí lượng lâm chết trung iệm (con) lệ(%) nghiệm (con) sàng bình (ngày) Gà 11 11 100 1.9 5,4 Lầ Vịt 10 0 0 Ngan 10 0 0 Gà 10 10 100 1.7 6,2 Lầ Vịt 10 0 0 Ngan 10 0 0 Vir s cúm A/Chicken/Vietnam/NCVD-016/2008) gây chết 100% s gà thí nghiệm Theo tiêu chí độc lực virus cúm gia cầm Tổ chức Thú y giớiOIE, vir s cúm A/H5N1clade l vir s cúm có độc lực cao đáp ứng tiêu chí phân loại OIE kết tươ đồng với thị độc lực mức độ phân tử vùng “Cleava e site” Thời gian gây chết động vật thí nghiệm trung bình - MDT (Mean death time) vir s cúm A/H5N1Clade đ i với l 5,4 ởt iệm lầ v 6,2 ởt iệm lầ C ú cũ tiế â iễm a v vịt Tất s vịt v a cịn s ng sau kết thúc thí nghiệm T m v o đó, tồn s vịt v a tr khỏe mạ , ă b t ường bất k triệu chứng lạ su t tuần theo dõi Quan sát gà chết có hiệ tượng phù nhẹ vù đầ , l m c o đầ sư l K i mổ khám bệ t c t ường gặp l đùi uất huyết, m o, t c t âm t m, da c â vù không lông xuất huyết, p ù keo da vù đầu, não sung huyết, phổi viêm, sư , p ù v ất huyết (Hình 3.8) Một s bệnh tích khác rải rác s co l tim xuất huyết, sung huyết t mạch vành tim Thận sung huyết Ruột non xuất huyết Túi k d đục, viêm 18 Đầu phù nhẹ đù x ất huyết Thận sung huyết Sung huyết não ù x ấ ế Phổi viêm xuất huyết Hình 3.9 M t s hình ảnh bệnh tích đại thể gà gây bệnh viru c m A/H5N1Clade (A/Chicken/Vietnam/NCVD 016) 3.3.4 Kết đánh giá đ thải viru đ ng vật thí nghiệm au gây nhiễm C ú đá iá độ thải virus sau gây nhiễm phản ứng realtime RTPCR, kết trình bày bảng 3.16 - Toàn s mẫ s ab t iệm đề dươ t vir s cúm A/H5N1 xét nghiệm phản ứng RRT-PCR - Toàn mẫu vịt kiểm tra âm tính, chứng tỏ vir s cúm A/H5N1clade khơng có khả ă â iễm vịt Điề cũ p ù ợp với thực tế, Trung qu c cũ c ỉ phát thấ vir s A/H5N1 t ộc clade gà mà không phát thấy vịt 19 Bảng 3.1 : Đánh giá đ thải viru gây nhiễm viru A/chicken/Vietnam/NCVD-016/2008 ĐVTN Gà Vịt Ngan Ct C ể đổi Stt ưỡ mức độ b i ĐVTN vòng) t ải) Ct C ể đổi Ct C ể đổi 25.3 ++ Âm tính 27.8 ++ 21.7 +++ 33.7 + Âm tính 23.9 +++ 24.9 +++ Âm tính 20.7 +++ 34.1 + Âm tính 28.5 ++ 26.4 ++ Âm tính 23.2 +++ 32.6 + Âm tính 22.5 +++ Neg Âm tính 19.9 ++++ 36.1 + Âm tính 20.6 +++ 31.7 + Âm tính 10 25.2 ++ 31.3 + Âm tính 11 22.2 +++ +++ (3) - (0) +(1) Trung bình 23.1 Âm tính 31.0 Tỷ lệ nhiễm 100% 0% 80% - Tuy nhiên, mẫu dịch ngốy họng ngan có kết khác với kết mẫu vịt Có 8/10 mẫ a dươ t vir s cúm k i t iệm RRT-PCR, toàn s a khỏe mạnh mặt lâm sàng Điề có al a nhiễm vir s cúm A/H5N1clade k ông mắc bệnh Về chi tiết mức độ virus thải, hầu hết mẫ s ab lấ từ 8/11 mẫ có mức độ - (+) giá trị Ct nằm khoảng 19,9 - 23,9, có s mẫ 3/11 mẫ ) mức độ (+) Tính trung bình, mức độ thải virus cúm gà nhiễm vir s cúm A/H5N1clade mức độ 3(+) Kết cho thấy gà bị nhiễm vir s cúm A/H5N1clade thải lượng lớ vir s trước chết 3.3 ết uả đánh giá khả nhiễm đa phủ tạng chủng viru c m A H N1 thu c clad Theo nhiều tác giả,virus cúm gia cầm H5N1 độc lực cao bên cạnh khả ă t c ứng lây nhiễm cao với biể mô đường hơ hấp, cịn có khả ă tác động gây tổn t ươ iề q a k ác tro t ể động vật cảm nhiễm gọi khả ă nhiễm đa p ủ tạng Chí đặc tính phân biệt khả ă â bệ v độc lực vir s cúm có độc lực cao v vir s cúm có độc lực thấp 3.3 .1.Định lượng virus phủ tạng phản ứng Realtime RT-PCR Để đá iá k ả ă iễm đa p ủ tạng c ủ vir s cúm A/Chicken/Vietnam/NCVD-016/2008, thu thập mẫu phủ tạ o, p ổi, a , lác , t ậ , r ột v tụ ) xét nghiệm bằ p ươ p áp RRT-PCR đặc hiệu cho gen H5/HA virus cúm A/H5N1 20 P ả ứ RRT-PCR có t ể t tố tươ đ i c ác lượ vir s có tro mẫ t iệm, v vậ c ú đ c ể đổi kết q ả t iệm RRT-PCR sa c ẩ độ vir s tr tế b o lo 10 TCI 50 dựa tr độ vir s đ biết k i c ẩ độ tr tế b o C F để đá iá c i tiết mức độ iễm vir s từ loại p ủ tạ Kết q ả c i tiết t iệm RRT-PCR tr b bả 3.17 Bảng 3.1 ết uả t nghiệm RRT-PCR đ i với m t loại phủ tạng gà gây bệnh viru A/H5N1 clade (NCVD) chuyển đ i ang nồng đ viru Gà N o Tụy Thận Ph i Ru t Gan Lách Ct Log10 Ct Log10 Ct Log10 Ct Log10 Ct Log10 Ct Log10 Ct Log10 13.3 7.6 21.6 5.1 19.4 5.7 18.1 6.2 19.7 5.7 22.5 4.8 24.6 4.2 14.5 7.2 21.4 5.1 22.7 4.7 20.2 5.5 22.6 4.8 27.9 3.2 32.4 1.8 15.2 7.0 17.7 6.3 19.7 5.6 25.2 4.0 23.2 4.6 26.7 3.5 26.5 3.6 TB 14.3 7.3 20.2 5.5 20.6 5.4 21.1 5.2 21.8 5.0 25.7 3.9 27.8 3.2 Std 1.0 0.3 2.2 0.7 1.8 0.6 3.6 1.1 1.9 0.6 2.8 0.9 4.1 1.2 – đ Kết đá nh iá mức độ iễm vir s p ủ tạ biể t ị 3.11 Log10TCID50 8.0 6.0 4.0 2.0 0.0 Series1 Não Tụy Thậ Phổi Ruộ Gan Lách 7.3 5.5 5.4 5.2 5.0 3.9 3.2 3.11 Bi u diễn mứ đ nhiễm virus lo i phủ t ng qua xét nghi m RRT-PCR(chuy đổi sang log10) 3.3 .2.Phát viru bệnh tích vi thể gây viru c m A/H5N1Clade phụ tạng phương pháp nhu m hóa mơ miễn dịch Điểm đặc trư bệnh tích vi thể cũ t ể rõ hiệ tươ vi m mạch nặng tất q a ội tạng với dịch phù bao quanh thành mạch; tế bào nội mạc bị hoạt tử, bong tróc; tế b o l mp o v đại thực bào bao quanh thành mạch Điều giải thích lý tất q a p ủ tạ bị iễm vir s cúm bị xuất huyết ặ P ươ p áp ộm óa tổ c ức miễ dịc IHC có độ tươ đồ với kết q ả p ươ p áp vi t ể ộm H T i có t ể ói rằ p ươ p áp óa mơ miễ dịc có độ cao so với p ươ p áp vi t ể 21 B nh tích vi th thận (nhu m IHC) B nh tích vi th tim (nhu m IHC) B nh tích vi th não (nhu m IHC) B nh tích vi th tụy (nhu m IHC) Hình 3.13 M t hình ảnh nhu m hóa mô miễn dịch phủ tạng gà gây bệnh Các tổ t ươ đại t ể, vi t ể cũ đá iá bằ p ươ p áp óa mơ miễ dịc tro i k đị rằ c ủ vir s H5N1 t ộc clade cũ có ướ iễm đa p ủ tạ i vir s A/H5N1 độc lực cao k ác iề tác iả k ác đ i 3.3.6 Xác định đặc tính kháng nguyên chủng viru c m A H N1 clad phân lập Việt Nam Kết phản ứng HI chéo virus kháng huyết clade virus A/H5N1 khác cho thấy có tươ đồng cao virus kháng huyết t a đồng chủng (hiệu giá HI 160 k ô có p ản ứng chéo phản ứng chéo có hiệu giá thấp c ủ vir s từ clade khác (Bảng 3.19) Kháng huyết t a A/H5N1 t ộc clade chế từ ba chủng virus khác thuộc nhóm B, chủng thuộc óm A sử dụ để t ực phản ứng HI chéo với c ủ vir s cúm A/H5N1của clade khác Trong kháng huyết kháng virus A/Chicken/Vietnam/NCVD-016/2008 khơng có phản ứng với virus clade clade 2.3.4, có phản ứng chéo với c ủ vir s nhóm B mức độ hạn chế HI 20 v k ô p ản ứng chéo với c ủ vir s cúm óm A Hiệ tượng kháng huyết kháng virus cúm A/Chicken/Vietnam/NCVD016/2008 có phản ứng chéo hạn chế (hiệu giá HI thấp) khơng có phản ứng chéo với c ủ vir s cúm A/H5N1khác thuộc clade cho thấy tươ đồng mặt kháng nguyên vir s cúm A/H5N1trong clade thấp 22 Bảng 3.19 Kết ác định đặc tính kháng nguyên viru c m A/H5N1 clade phân lập phản ứng HI háng huyết chuẩn 2.3.4 2.3.4 7B 7A Clade háng nguyên chuẩn GS/GD VN/1203 AN/1/05 A/goose/Guangdong/1/96 A/Vietnam/1203/2004 A/Anhui/1/05 2.3.4 A/chicken/Vietnam/NCVD-035/2008 2.3.4 A/Chicken/Vietnam/NCVD-016/2008 A/chicken/Vietnam/NCVD-03/2008 A/chicken/Vietnam/NCVD-93/2008 7B 7A CK/VN/35 1280 80 20