Luận văn
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆ H N I NGUYỄN TÙNG NGHIÊN CỨU M T SỐ ĐẶC TÍNH SINH HỌC CỦA VI RÚT CÚM A/H5N1 CLADE HÂN LẬ Ở VIỆT NAM LUẬN ÁN TIẾN SỸ CHUYÊN NG NH: KÝ SINH TRÙNG V VI SINH VẬT HỌC THÚ Y H N I, NĂM 2013 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆ H N I NGUYỄN TÙNG NGHIÊN CỨU M T SỐ ĐẶC TÍNH SINH HỌC CỦA VI RÚT CÚM A/H5N1 CLADE HÂN LẬ Ở VIỆT NAM CHUYÊN NG NH: KÝ SINH TRÙNG V VI SINH VẬT HỌC THÚ Y MÃ SỐ: 62.64.01.04 NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC TS NGUYỄN BÁ HIÊN TS NGUYỄN VĂN CẢM H N I, NĂM 2013 LỜI CAM ĐOAN Tơi xin cam đoan: cơng trình khoa học tôi, số liệu kết nghiên cứu luận án trung thực chưa công bố công trình khác Tơi xin cam đoan: giúp đỡ cho việc thực đề tài nghiên cứu hồn thành luận án cảm ơn Các thơng tin trích dẫn luận án xác nêu rõ nguồn gốc Hà nội, tháng 10 năm 2013 Tác giả Nguyễn Tùng i LỜI CẢM ƠN Trong suốt q trình thực đề tài hồn thành luận án, nhận giúp đỡ nhiều tổ chức cá nhân Nhân dịp xin cảm ơn Ban Giám hiệu, Ban Quản lý Đào tạo, Khoa Thú y, Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội tạo điều kiện cho theo học chương trình đào tạo nghiên cứu sinh trường Tôi xin chân thành cảm ơn Lãnh đạo cán Trung tâm Chẩn đoán Thú y tạo điều kiện thuận lợi giúp đỡ cho hồn thành đề tài nghiên cứu Tơi xin cảm ơn tập thể cán thuộc môn Vi sinh vật – Truyền nhiễm, khoa Thú y, Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội, giúp đỡ q trình học tập nghiên cứu Tơi xin bày tỏ long biết ơn sâu sắc đến Thầy giáo, TS Nguyễn Bá Hiên, Khoa Thú y, Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội TS Nguyễn Văn Cảm – Hội Thú y , người thầy hướng dẫn khoa học, trực tiếp giúp đỡ tơi q trình thực đề tài hồn thành luận án Tơi xin gửi lời cảm ơn đến đồng nghiệp công tác tổ chức quan quốc tế FAO, CDC, USDA hỗ trợ cung cấp tài liệu nguyên liệu cần thiết để thực nghiên cứu Tơi ln biết ơn gia đình, bạn bè đồng nghiệp bên cạnh, động viên giúp đỡ tơi hồn thành nghiên cứu luận án Hà Nội, tháng 10 năm 2013 Tác giả Nguyễn Tùng ii M CL C Lời cảm ơn Lời cam đoan cl c Danh m c ký hiệu, chữ viết tắt Danh m c bảng Danh m c hình MỞ ĐẦU CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Lịch sử bệnh cúm gia cầm 1.1.1 Lịch sử bệnh giới 1.1.2 Bệnh cúm gia cầm Việt Nam 1.2 Nguyên nhân bệnh cúm gia cầm 1.2.1 Đặc điểm sinh học phân tử virus cúm gia cầm 1.2.2 Kháng nguyên virus cúm gia cầm 1.2.3 Đặc điểm tiến hóa hình thành genotype virus cúm gia cầm giai đoạn 1996-2008 1.2.4 Tính thích ứng đa vật chủ virus cúm A/H5N1 1.2.5 Cơ chế xâm nhiễm gây bệnh virus cúm A tế bào vật chủ 1.2.6 Độc lực khả gây bệnh virus cúm gia cầm 1.2.7 Triệu chứng lâm sàng gia cầm mắc bệnh cúm 1.2.8 Bệnh tích gia cầm mắc cúm gia cầm 1.3 Chẩn đoán bệnh 1.3.1 Chẩn đoán dựa vào dịch tễ học 1.3.2 Chẩn đoán dựa vào triệu chứng bệnh tích 1.3.3 Chẩn đốn phịng thí nghiệm 1.4 Vacxin phịng bệnh cúm gia cầm 1.4.1 Tình hình sử d ng vắc-xin cúm gia cầm giới 1.4.2 Tình hình sử s ng vắc-xin cúm gia cầm Việt Nam 1.5 Tình hình nghiên cứu cúm gia cầm Việt Nam CHƯƠNG NỘI DUNG – NGUYÊN LIỆU – PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Nội dung 2.1.1 Phân lập giám định virus cúm gia cầm A H N1 từ mẫu dịch ngốy ổ nhớp 2.1.2 Xác định đặc tính di truyền học virus cúm A/H5N1 clade 2.1.3 Xác định số đặc tính sinh học virus A/H5N1 clade 2.1.4 Xác định đặc tính kháng nguyên (tính tương đồng kháng nguyên) 2.1.5 Xác định hiệu lực vacxin H5N1 Re-1 2.2 Địa điểm nghiên cứu 2.3 Vật liệu phương pháp nghiên cứu 2.3.1 Vật liệu nghiên cứu 2.3.2 Phương pháp nghiên cứu Trang i ii iii v vi viii 4 10 14 20 29 30 32 34 36 36 36 36 37 37 39 41 42 44 46 46 46 46 46 46 46 47 47 47 iii CHƯƠNG KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 3.1 Phân lập giám định virus cúm gia cầm H5N1 clade 3.2 Xác định đặc tính di truyền virus cúm A H N1 thuộc clade phân lập Việt Nam 3.2.1 Giải trình tự gen HA (H ) phân tích phả hệ sử d ng chuỗi gen H5 3.2.2 Giải trình tự gen NA(N1) phân tích phả hệ dựa chuỗi nucleotide gen N1 3.2.3 Giải trình tự gen phân tích phả hệ dựa chuỗi nucleotide gen M 3.3 Xác định số đặc tính sinh học chủng virus A/H5N1 clade A/chicken/Vietnam/NCVD-016/2008 3.3.1 Tính thích ứng phơi gà (xác định số EID50) 3.3.2 Tính thích ứng tế bào xơ phôi gà (xác định số TCID50) 3.3.3 Kết xác định độc lực virus cúm A/H5N1clade 3.3.4 Kết đánh giá độ thải virus động vật thí nghiệm 3.3.5 Đánh giá khả nhiễm đa phủ tạng virus cúm A/H5N1clade 3.3.6 Xác định đặc tính kháng nguyên chủng virus cúm A H N1 clade phân lập Việt Nam 3.3.7 Đánh giá khả bảo hộ vacxin Re-1 virus cúm A H N1HA clade gà KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ Tài liệu tham khảo Cơng trình công bố liên quan đến luận án Ph l c 59 59 62 62 71 78 84 84 89 92 103 106 113 116 121 124 135 136 iv DANH M C CÁC KÝ HIỆU, CÁC CH VIẾT T T Viết tắt Tên đầy đủ AI CDC CEF CK cs Ct DEF Dk EID50 ELD50 FAO HA HI HPAI IHC LPAI M MDCK MDEF MDT MEGA NA NCBI NCVD NP NS OIE PA PB1 PB2 RNA RRT-PCR TCID50 WHO Avian Influenza Center of Disease Control and Prevention Chicken Embryo Fibroblast Chicken cộng Cycle Threshold Duck Embryo Fibroblast Duck Embryo Infection Dose 50% Embryo Lethal Dose 50% Food and Agriculture Organisation Hemaglutinin Hemagglutination Inhibition Highly Pathogenic Avian Influenza Immuno Histochemistry Low Pathogenic Avian Influenza Matrix protein Mardine Darby Canine Kidney Muscovy Duck Embryo Fibroblast Mean Death Time Molecular Evolution Genetic Analysis Neuraminidase National Center for Biotechonology Information National Centre for Veterinary Diagnostics Nucleoprotein Non-strutural protein Office International des Epizooties Polymerase acidic Polymerase basic protein Polymerase basic protein Ribonucleic acid Realtime Reverse Transcriptase – Polymerase Chain Reaction Tissue Culture Infection Dose 50% World Health Organisation v DANH M C CÁC BẢNG TT 1.1 1.2 1.3 1.4 2.1 2.2 2.3 2.4 2.5 3.1 3.2 3.3 3.4 3.5 3.6 3.7 3.8 3.9 3.10 3.11 3.12 3.13 3.14 3.15 3.16 3.17 Tên bảng Trang Tổng số trường hợp nhiễm cúm gia cầm A H N1 người báo cáo cho WHO đến 2012 ột số đặc điểm triệu chứng gia cầm mắc cúm A/H5N1 34 Một số loại vacxin phòng cúm gia cầm H N1 sử d ng 40 giới Kết tiêm phòng vacxin cúm gia cầm chương trình quốc gia 41 Bảng tổng hợp số liệu tính tốn theo phương pháp eed-Muench 49 Primer probe để phát virus cúm gia cầm A/H5N1 52 Chuẩn bị mix (hỗn hợp phản ứng cho ealtime T-PCR 52 Chuẩn bị mix (hỗn hợp phản ứng) T-PC giải trình tự gen 55 Trình tự primer để giải trình tự gen(theo quy trình CDC) 56 Kết xét nghiệm virus từ chương trình giám sát biên giới 60 Kết giải trình tự gen phân tích phát sinh loài mẫu 62 virus cúm A H N1 phát Lạng Sơn Danh sách chủng virus cúm A H N1 dùng để so sánh lập 66 phát sinh loài dựa gen H5 So sánh mức độ khác biệt di truyền gen HA chủng 69 virus A H N1 clade với số chủng tham chiếu Danh sách chủng virus A H N1 sử d ng để so sánh lập 74 phát sinh loài dựa N1 So sánh mức độ khác biệt di truyền gen N1 chủng 77 virus cúm A/H5N1 clade với số chủng tham chiếu Danh sách chủng virus cúm A H N1 sử d ng để so sánh lập 80 phát sinh loài dựa gen So sánh mức độ khác biệt di truyền gen chủng virus 83 cúm A/H5N1 clade với số chủng tham chiếu Theo dõi thời gian gây chết phôi 85 Kết theo dõi tỷ lệ sống/chết phôi trứng gây nhiễm virus 86 A/Chicken/Vietnam/NCVD-016/2008 Theo dõi thời gian virus gây nhiễm lên tế bào CEF 89 Kết theo dõi bệnh tích tế bào CEF gây nhiễm virus 90 A/Chicken/Vietnam/NCVD-016/2008 93 Các axit amin vùng “cleavage site” virus cúm H N1 độc lực cao clade số chủng virus tham chiếu Kết đánh giá độc lực virus cúm A/H5N1clade gia 95 cầm Kết theo dõi lâm sàng gà thí nghiệm 96 Đánh giá độ thải virus gây nhiễm b ng virus A/chicken/ 103 Vietnam/NCVD-016/2008 Kết xét nghiệm T-PC số loại phủ tạng gà gây 107 bệnh b ng virus A H N1 clade chuyển đổi sang nồng độ virus vi 3.18 3.19 3.20 Phân bố bệnh tích vi thể nhuộm IHC phát kháng nguyên virus cúm H N1A chicken Vietnam NCVD-016/2008 Kết xác định đặc tính kháng nguyên virus cúm A/H5N1 clade phân lập b ng phản ứng HI Kết theo dõi thí nghiệm cơng cường độc gà tiêm vacxin cúm gia cầm H5N1 Re-1 109 115 118 vii DANH M C CÁC H NH TT 1.1 1.2 1.3 1.4 1.5 1.6 1.7 1.8 1.9 1.10 1.11 1.12 1.13 1.14 1.15 1.16 2.1 3.1 3.2 3.3 3.4 3.5 3.6 3.7 3.8 3.9 3.10 Tên hình Trang Bản đồ phân bố ca cúm A/H5N1trên giới (tính đến 2009) Biểu đồ biểu diễn dịch cúm gia cầm virus cúm A/H5N1 theo thời gian (A) hình thái virus cúm, (B) Hình thái kính hiển vi 10 điện tử hình hệ gen virus cúm A 14 ô cấu trúc kháng nguyên Haemalutinin Neurminidase 15 Sơ đồ minh họa đột biến điểm phân đoạn genvirus cúm A 20 Sơ đồ minh họa tượng trộn kháng nguyên virus cúm 20 A/H5N1và H3N2 Cây phả hệ dựa gen HA virus cúm A H N1 độc lực cao 22 Sự tiến hóa clade virus A/H5N1 theo thời gian 23 Sự phân bố clades virus cúm gia cầm giới từ 200324 2009 Thời gian xuất clade H5N1 Việt Nam từ 2001-2007 25 Hình 1.12 Sự phân bố clade virus A/H5N1 khác theo 27 không gian Các genotype virus cúm gia cầm A H N1 độc lực cao 28 ối quan hệ lây nhiễm thích ứng lồi vật chủ virus cúm A 30 hình chế xâm nhiễm nhân lên virus cúm A tế bào chủ 31 Minh hoạ vùng “Cleavage site” virus cúm độc lực thấp(LPAI) 33 Sơ đồ bố trí primer giải trình tự gen H , N1 virus cúm A H N1 52 Hình 3.1 Bản đồ nơi phát virus A/H5N1 clade 61 Cây phả hệ dựa gen H5 virus A H N1 clade 62 Hiện tượng chèn xóa axit amin vị trí cleavage site 71 chủng virus A H N1 clade phân lập Việt Nam Cây phả hệ dựa gen N1 virus A H N1 clade 73 Cây phả hệ dựa gen virus A H N1 clade 79 Kiểm tra đặc tính gây ngưng kết hồng cầu(phản ứng HA) 87 Kết kiểm tra bệnh tích phơi bsau gây nhiễm b ng chủng virus 88 cúm A H N1 clade phân lập Việt Nam Hình ảnh tế bào CEF DEF phân lập chuẩn độ virus 92 Một số hình ảnh bệnh tích đại thể gà gây bệnh b ng virus A/H5N1 98 Clade (A/Chicken/Vietnam/NCVD 016) ơt số hình ảnh thể bệnh tích đại thể gà gây bệnh b ng 99 virus A H N1 clade 2.3.4 2.3.2 viii ... TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆ H N I NGUYỄN TÙNG NGHIÊN CỨU M T SỐ ĐẶC TÍNH SINH HỌC CỦA VI RÚT CÚM A/H5N1 CLADE HÂN LẬ Ở VIỆT NAM CHUYÊN NG NH: KÝ SINH TRÙNG V VI SINH VẬT HỌC THÚ Y MÃ SỐ: 62.64.01.04... chống bệnh cúm gia cầm Ý nghĩ kho học củ đề tài Đây nghiên cứu đặc tính sinh học virus cúm A H N1 clade Việt Nam có hệ thống - Làm s tham khảo cho việc nghiên cứu biến đổi virus cúm gia cầm... nhiễm đa phủ tạng virus cúm A/H5N 1clade 3.3.6 Xác định đặc tính kháng nguyên chủng virus cúm A H N1 clade phân lập Việt Nam 3.3 .7 Đánh giá khả bảo hộ vacxin Re-1 virus cúm A H N1HA clade gà KẾT LUẬN