Luận văn nghiên cứu một số đặc tính sinh học phân tử của các chủng virus gây hội chứng rối loạn hô hấp và sinh sản(PRRS) phân lập tại vùng phụ cận hà nội

luận văn

BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI -
- NGUYỄN THỊ HOA NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ðẶC TÍNH SINH HỌC PHÂN TỬ CỦA CÁC CHỦNG VIRUS GÂY HỘI CHỨNG RỐI LOẠN HÔ HẤP VÀ SINH SẢN (PRRS) PHÂN LẬP TẠI VÙNG PHỤ CẬN HÀ NỘI ¬ LUẬN VĂN THẠC SĨ NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI – 2011 BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI -
- NGUYỄN THỊ HOA NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ðẶC TÍNH SINH HỌC PHÂN TỬ CỦA CÁC CHỦNG VIRUS GÂY HỘI CHỨNG RỐI LOẠN HÔ HẤP VÀ SINH SẢN (PRRS) PHÂN LẬP TẠI VÙNG PHỤ CẬN HÀ NỘI LUẬN VĂN THẠC SĨ NÔNG NGHIỆP Chuyên ngành : Thú y Mã số : 60.62.50 Người hướng dẫn khoa học : TS NGUYỄN THỊ LAN HÀ NỘI – 2011 LỜI CAM ðOAN Tơi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu riêng tơi Các số liệu, kết nêu luận văn trung thực chưa cơng bố cơng trình khác Tơi xin cam đoan thơng tin trích dẫn luận văn rõ nguồn gốc Mọi giúp ñỡ ñã ñược cảm ơn Hà Nội, ngày 24 tháng 11 năm 2011 Tác giả luận văn Nguyễn Thị Hoa Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………… i LỜI CẢM ƠN Cho đến tơi ñã hoàn thành luận văn tốt nghiệp Nhân dịp tơi xin bày tỏ lịng biết ơn chân thành, sâu sắc tới thầy, cô giáo Trước tiên, xin gửi lời cảm ơn chân thành tới TS Nguyễn Thị Lan, Phó mơn Bệnh lý - Khoa Thú y - Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội, người tận tình hướng dẫn tơi suốt thời gian thực tập tốt nghiệp Tôi xin chân thành cảm ơn thầy cô môn bệnh lý, Khoa Thú y, Viện ðào tạo sau ñại học Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội, tạo điều kiện thuận lợi giúp đỡ tơi hồn thành luận văn Cuối xin bày tỏ lòng cảm ơn sâu sắc tới gia đình, bạn bè, anh, chị em phịng thí nghiệm Trung tâm Khoa Thú y người ln động viên, giúp đỡ tơi để tơi hồn thành tốt luận văn Xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 24 tháng 11 năm 2011 Học viên Nguyễn Thị Hoa Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………… ii MỤC LỤC MỞ ðẦU i 1.1 ðặt vấn ñề 1.2 Mục đích ñề tài 2.1 Lịch sử tình hình dịch PRRS lợn 2.1.1 Lịch sử tình hình dịch PRRS lợn giới 2.1.2 Lịch sử tình hình dịch PRRS lợn Việt Nam 2.2 Căn bệnh 13 2.2.1 Cấu trúc virus PRRS 13 2.2.2 Phân loại virus PRRS 15 2.2.3 Sức ñề kháng virus PRRS 16 2.3 Truyền nhiễm học 16 2.3.1 Loài vật mắc bệnh 16 2.3.2 Chất chứa mầm bệnh trình truyền lây 16 2.3.3 Cơ chế sinh bệnh 18 2.4 Triệu chứng bệnh tích 20 2.4.1 Triệu chứng lợn mắc PRRS 20 2.4.2 Bệnh tích lợn mắc PRRS 21 2.5 Chẩn đốn phịng trị bệnh 22 2.5.1 Chẩn đốn 22 2.5.2 Các biện pháp phòng trị bệnh 22 2.6 Kỹ thuật PCR (polymerase chain reaction) 23 2.6.1 Nguyên lý phản ứng PCR 23 2.6.2 Các bước tiến hành phản ứng PCR 25 2.7 Kỹ thuật giải trình tự gen 25 2.7.1 Giải trình tự DNA theo phương pháp Maxam Gilbert 26 2.7.2 Giải trình tự DNA theo phương pháp dideoxy 27 2.7.3 Giải trình tự DNA máy tự ñộng 28 Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………… iii ðỐI TƯỢNG - ðỊA ðIỂM - NỘI DUNG - NGUYÊN LIỆU PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 30 3.1 ðối tượng 30 ðịa ñiểm 30 3.3 Nội dung - nguyên liệu - phương pháp nghiên cứu 30 3.3.1 Nội dung nghiên cứu 30 3.3.2 Nguyên liệu 31 3.3.3 Phương pháp nghiên cứu 31 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 41 4.1 Kết lựa chọn mẫu PRRS cho nghiên cứu 41 4.2 Kết giải trình tự gen ORF5 chủng virus PRRS 54 4.2.1 Kết tách chiết RNA tổng số chủng virus PRRS 54 4.2.2 Kết phản ứng RT- PCR 55 4.2.3 Kết giải trình tự gen ORF5 chủng virus PRRS 56 4.3 Kết so sánh trình tự nucleotide đoạn gen ORF5 chủng virus PRRS nghiên cứu số chủng virus vacxin 58 4.4 Kết so sánh trình tự axit amin ñoạn gen ORF5 chủng PRRS nghiên cứu số chủng virus vacxin 63 4.5 Sự tương ñồng nucleotide axit amin chủng virus PRRS nghiên cứu 68 4.6 Kết xây dựng sinh học phân tử 70 KẾT LUẬN VÀ ðỀ NGHỊ 72 5.1 Kết luận 72 5.2 ðề nghị 73 TÀI LIỆU THAM KHẢO 74 I TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT 74 II TÀI LIỆU TIẾNG ANH 75 Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………… iv DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT BLAST : Basic Local Alignment Search Tool Bp : Base pair CPE : Cytopathogenic Effect Da : Dalton DNA : Deoxyribonucleic acid DMEM : Dulbecco's Modified Eagle's Medium EAV : Equine arteritis virus EDTA : Ethylenediamine Tetra Acetat Acid ELISA : Enzyme linked immunosorbent Assay GP : Glycoprotein IFA : Immuno Fluoerescent Assay IPMA : Immunoperoxidase Monolayer Assay LDHV : Lactate dehydrogenase-elevating virus LV : Lelystad Virus OIE : Organisation of International Epidemiology ORF : Open Reading Frame PCR : Polymerase Chain Reaction PRRS : Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome PRRSV : Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus RNA : Ribonucleic acid RT-PCR : Reverse Transcription Polymesase Chain Reaction SHFV : Simian hemorrhagic fever virus SLS : Sample loading solution TBE : Tris Borate EDTA Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………… v DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1 Tổng hợp tình hình dịch PRRS tỉnh phía Bắc Bảng 2.2 Tổng hợp tình hình dịch PRRS tỉnh miền Trung Bảng 2.3.a Tình hình dịch PRRS cuối năm 2010 11 Bảng 2.3.b Tình hình dịch PRRS cuối năm 2010 12 Bảng 4.1 Mẫu lợn nghi mắc PRRS thu thập 41 Bảng 4.2 Kết chẩn đốn RT-PCR lợn nghi mắc PRRS 48 Bảng 4.3 Kết phân lập PRRSV môi trường tế bào Marc 145 51 Bảng 4.4 Hồ sơ chủng virus PRRS ñược lựa chọn nghiên cứu 53 Bảng 4.5 Sự tương ñồng nucleotide axit amin chủng virus PRRS nghiên cứu (%) Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………… 69 vi DANH MỤC HÌNH Hình 2.1 Bản đồ lịch sử xuất PRRS giới Hình 2.2 Dịch PRRS Việt Nam - 2007 Hình 2.3 Hình thái virus PRRS 14 Hình 2.4 Hình ảnh cấu trúc hệ gen virus PRRS 14 Hình 2.5 ðại thực bào bệnh lý 20 Hình 2.6 ðại thực bào bình thường 20 Hình 2.7 Mơ hình ngun lý phản ứng RT-PCR 24 Hình 4.1 Triệu chứng tím tai 44 Hình 4.2 Lợn bị phát ban 44 Hình 4.3 Lợn bị sưng mí mắt 44 Hình 4.4 Lợn mệt mỏi, chán ăn 44 Hình 4.5 Lợn ủ rũ, tím tai, phát ban 44 Hình 4.6 Lợn nái bị sảy thai 44 Hình 4.7 Phổi viêm, hoại tử 47 Hình 4.8 Hạch lâm ba sưng, tụ máu 47 Hình 4.9 Thận xuất huyết điểm 47 Hình 4.10 Phổi xuất huyết 47 Hình 4.11 Lách nhồi huyết 47 Hình 4.12 Tử cung viêm 47 Hình 4.13 Phế nang ñứt nát, thâm nhiễm tế bào viêm (HE x10) 50 Hình 4.14 Dịch phù lịng phế nang (HE x40) 50 Hình 4.15 Hạch lâm ba hoại tử (HE x10) 50 Hình 4.16 Hạch lâm ba xuất huyết (HE x40) 50 Hình 4.17 Lách xuất huyết (HE x10) 50 Hình 4.18 Lách xuất huyết, thâm nhiễm tế bào viêm (HE x40) 50 Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………… vii Hình 4.19 CPE-36 sau gây nhiễm 52 Hình 4.20 CPE-48 sau gây nhiễm 52 Hình 4.21 CPE-60 sau gây nhiễm 52 Hình 4.22 CPE-72 sau gây nhiễm 52 Hình 4.23 Tế bào Marc145 chưa gây nhiễm virus 52 Hình 4.24 Hình ảnh ñiện di kiểm tra sản phẩm tách chiết RNA tổng số 54 Hình 4.25 Kết phản ứng RT- PCR với mồi ORF5 56 Hình 26 Giản đồ giải trình tự tự động thành phần nucleotide ñoạn gen nghiên cứu 57 Hình 4.27 So sánh trình tự nucleotide đoạn gen ORF5 chủng virus PRRS nghiên cứu 60 Hình 4.28 So sánh trình tự axit amin ñoạn gen ORF5 chủng virus PRRS nghiên cứu 65 Hình 4.29 Cây sinh học phân tử chủng virus PRRS nghiên cứu 70 Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………… viii ... DỤC VÀ ðÀO TẠO TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI -
- NGUYỄN THỊ HOA NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ðẶC TÍNH SINH HỌC PHÂN TỬ CỦA CÁC CHỦNG VIRUS GÂY HỘI CHỨNG RỐI LOẠN HÔ HẤP VÀ SINH SẢN (PRRS) PHÂN... phần vào cơng khống chế dịch bệnh đàn lợn Vì chúng tơi tiến hành đề tài: ? ?Nghiên cứu số đặc tính sinh học phân tử chủng virus gây hội chứng rối loạn hô hấp sinh sản (PRRS) phân lập vùng phụ cận Hà. .. đoạn gen ORF5 chủng virus PRRS nghiên cứu 65 Hình 4.29 Cây sinh học phân tử chủng virus PRRS nghiên cứu 70 Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp