Nguyên lý
Xác ựịnh trình tự gen theo phương pháp dideoxy do Frederick Sanger, Smith và Coulson phát hiện năm 1977 (còn gọi là phương pháp giải trình tự gen bằng enzyme hay phương pháp Sanger) dựa trên cơ chế tổng hợp DNA trong cơ thể sinh vật F. sanger ựã giải trình tự hoàn chỉnh bộ gen của thực khuẩn thể X174 kắ sinh vi khuẩn Ẹcoli (1977), là bộ gen ựầu tiên ựược xác ựịnh trình tự. Trong phương pháp này tác giả sử dụng các nhân tố kết thúc ựặc hiệu quá trình kéo dài DNA khi tổng hợp. Nhân tố này là 2,3 dideoxynucleosid triphosphat (đNTP). Các phân tử này (đNTP) có thể kết hợp vào chuỗi DNA ựang tổng hợp một cách bình thường qua nhóm 5 triphotphas nhưng lại không tiếp tục kết hợp ựược với phân tử deoxynucleosid triphosphat (dNTP) tiếp theọ Như vậy khi trộn lẫn lượng nhỏ đNTP với 4 loại dNTP rồi tiến hành tổng hợp DNA nhờ enzyme polymerazẹ Kết quả sẽ cho một loạt các ựoạn DNA ựược kết thúc một cách ựặc hiệu bởi gốc dideoxy nucleotid và sẽ thu ựược các ựoạn DNA có kắch thước hơn kém nhau 1 nucleotidẹ Chạy ựiện di các ựoạn ta có thể xác ựịnh ựược trình tự ựoạn DNA nghiên cứụ
Trường đại học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦẦ 28
Các bước thực hiện
Bước 1: Biến tắnh DNA khuôn, ựiện di trên gel polyacrylamid (có bổ sung ure) thu các mạch ựơn DNẠ
Bước 2: Chuẩn bị phản ứng tổng hợp DNA
lấy 4 ống eppendorf cho các thành phần cần thiết vào mỗi ống ( DNA khuôn, mồi có ựánh dấu phóng xạ, enzyme DNA polymeraze và các dNTP (dATP, dTTP, dGTP, dCTP) và dung dịch ựệm thắch hợp). Bổ sung vào mỗi ống tương ứng một lượng nhỏ (1%) một loại đNTP nhất ựịnh (đATP, đTTP, đGTP, đCTP).
Bước 3: Thực hiện phản ứng tổng hợp DNA với các thiết bị tuần hoàn nhiệt. Bước 4: điện di kết quả, so sánh các kết quả các chuỗi mạch ựơn DNA ựược tổng hợp ựể xác ựịnh trình tự của mạch khuôn.
Phương pháp giải trình tự gen do F. Sanger và cộng sự phát minh có ựộ chắnh xác tương ựối cao, là cơ sở của các máy giải trình tự gen tự ựộng.