4. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
4.2.2. Kết quả phản ứng RT-PCR
Sản phẩm RNA tổng số của các chủng virus PRRS nghiên cứu thu ựược sau khi tách chiết sẽ ựược khuếch ựại bằng kỹ thuật RT-PCR với sự tham gia của enzym sao chép ngược (Reverse Transcrip) và sử dụng cặp mồi ORF5 (ựã trình bày ở phần phương pháp nghiên cứu) có khả năng phát hiện virus PRRS thuộc cả chủng Bắc Mỹ và chủng châu Âu (cặp mồi này cho phép xác ựịnh ựoạn gen của virus PRRS có kắch thước 603bp) ựể tạo ra các ựoạn DNA hoàn chỉnh (cDNA). Sản phẩm cDNA sau khi khuếch ựại trong máy PCR ựược ựiện di và chụp ảnh. Kết quả của phản ứng RT- PCR xác ựịnh PRRSV ựược trình bày ở hình 4.25.
Trường đại học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦẦ 56
Hình 4.25. Kết quả phản ứng RT- PCR với mồi ORF5
[Virus PRRS ựược phát hiện bằng phản ứng RT- PCR với ựộ dài của
gen là 603bp, thang chuẩn M 100bp; giếng từ 1-5 là mẫu của 5 chủng virus PRRS nghiên cứu; giếng 6 là ựối chứng âm (nước sinh lý); giếng 7 là ựối chứng dương (virus PRRS)]
(1: 171KTY, 2: 374KTY, 3: 352KTY, 4: CL2, 5: HTP1)
Sản phẩm ựiện di cho vạch DNA tương ứng 603bp ựúng theo thiết kế mồị Kết quả tạo DNA của các chủng virus PRRS là thành công. Như vậy chúng tôi ựã thu ựược DNA của ựoạn gen ORF5 của cả 5 chủng virus PRRS nghiên cứụ
4.2.3. Kết quả giải trình tự gen ORF5 của các chủng virus PRRS
Sau khi tiến hành kỹ thuật RT-PCR và thu ựược sản phẩm chúng tôi tiến hành tinh sạch sản phẩm của phản ứng RT-PCR bằng Kit ựể loại bỏ hết các thành phần dư thừa sau phản ứng. Sản phẩm sau khi tinh sạch là DNA của virus sẽ ựược cloning với từng loại mồi ựơn (mồi xuôi và mồi ngược) ựể nhân nhanh số lượng bản sao theo một chiều của ựoạn gen (thực hiện phản ứng PCR giải trình tự). Tinh sạch sản phẩm của phản ứng PCR giải trình tự bằng Kit ựược cung cấp của nhà sản xuất, sau ựó tiến hành giải trình tự gen. Quá trình giải trình tự ựược thực hiện bằng máy giải trình tự Beckman Coulter CEQ 8000 của Mỹ tại Phòng thắ nghiệm trung tâm Khoa Thú y, Kết quả ựược biểu thị bằng chương trình Genetyx thể hiện ở hình 4.26.
Trường đại học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦẦ 57
Hình 4. 26. Giản ựồ giải trình tự tự ựộng thành phần nucleotide của ựoạn gen nghiên cứu
Trường đại học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦẦ 58 Hình 4.26 cho thấy chất lượng giải trình tự tốt, mỗi ựỉnh màu của giản ựồ ựều xác nhận một loại nucleotide, các nucleotide khác nhau tiếp nhận thuốc nhuộm huỳnh quang khác nhau khi ựọc bằng tia laser cho hiển thị màu tương ứng trong ựó Adenin cho màu ựỏ, Thymine cho màu xanh, Guanine cho màu xanh lá cây, Cytosine cho màu ựen. Chuỗi nucleotide thu ựược sau khi giải trình tự ựược xử lý bằng các phần mềm phân tắch trên máy tắnh. Sau khi phân tắch chúng tôi thu ựược toàn bộ ựoạn gen ORF5 của 5 chủng virus PRRS nghiên cứu có ựộ dài 603bp. Như vậy việc tách chiết RNA tổng số, quá trình thực hiện RT-PCR và giải trình tự ựã ựược thực hiện thành công. Trình tự nucleotide của gen ORF5 của các chủng virus PRRS nghiên cứu ựã ựược xác ựịnh.