3.3.1. Nội dung nghiên cứu
- Nghiên cứu lựa chọn mẫu virus PRRS cho nghiên cứu
- Thực hiện giải trình tự ựoạn gen ORF5 của các chủng virus PRRS nghiên cứu
- Tiến hành so sánh trình tự nucleotide của ựoạn gen ORF5 của các chủng virus PRRS nghiên cứu và một số chủng virus vacxin
- Tiến hành so sánh trình tự axit amin của ựoạn gen ORF5 của các chủng virus PRRS nghiên cứu và một số chủng virus vacxin
- Xây dựng cây sinh học phân tử thể hiện mối quan hệ di truyền của các nhóm virus PRRS ựang lưu hành tại vùng phụ cận Hà Nộị
Trường đại học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦẦ 31
3.3.2. Nguyên liệu
Nguyên liệu ựược sử dụng trong nghiên cứu là các lợn mắc PRRS, các chủng virus PRRS ựã ựược phân lập trên môi trường tế bào Marc145, tế bào Marc145 ựể phân lập virus PRRS.
Máy móc sử dụng trong nghiên cứu: Máy PCR, Máy giải trình tự gen, máy ly tâm, máy lắc, máy ựiện di, máy chụp ảnh gel, tủ ấm CO2, buồng cấy vô trùng, tủ lạnh âm sâuẦ
Hoá chất sử dụng trong kỹ thuật tách chiết RNA tổng số bao gồm: LS trizol, Chloroform, Isopropanol, cồn tuyệt ựối tinh khiết, nước cất khử ion, bộ Kắt cho phản ứng RT- PCR, bộ Kắt tinh sạch sản phẩm PCR, bộ Kắt giải trình tựẦ
Các dụng cụ và hóa chất tiêu hao ựi kèm như: pipet, ựầu tip, agarose, ethidiumbromide, ống eppendoft, ựệm TBE,Ầ
Các phần mềm xử lý dữ liệu như: phần mền Genetyx, phần mền Seq, phần mềm ClustalW.
3.3.3. Phương pháp nghiên cứu
để tiến hành nghiên cứu và thực hiện ựược các nội dung ựã ựề ra của ựề tài, chúng tôi ựã sử dụng kết hợp những phương pháp nghiên cứu thường quy và hiện ựại trong lĩnh vực thú ỵ
a) Phương pháp quan sát, thống kê sinh học
để xác ựịnh ựược các triệu chứng lâm sàng chủ yếu của lợn mắc PRRS, chúng tôi tiến hành quan sát, ghi chép, thống kê các biểu hiện của lợn từ khi xuất hiện những dấu hiệu bệnh lý ựầu tiên. đồng thời dựa vào các ựặc ựiểm dịch tễ học, những can thiệp trong quá trình bệnh xảy ra cũng như thu thập các thông tin liên quan. Tiến hành phân tắch, thống kê ựể ựưa ra những kết quả chắnh xác. Xác ựịnh chắnh xác những triệu chứng lâm sàng chủ yếu có ý nghĩa vô cùng quan trọng cho các bước thắ nghiệm tiếp theọ
Trường đại học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦẦ 32
b) Phương pháp mổ khám
Mổ khám ca bệnh nhằm xác ựịnh ựược các biến ựổi ựại thể của các cơ quan, tổ chức của lợn mắc PRRS, cần tiến hành mổ khám những lợn có biểu hiện triệu chứng lâm sàng của bệnh [22]. Lợn bệnh ựược cố ựịnh cẩn thận, tiến hành lấy máu từ vịnh tĩnh mạch cổ, thu dịch swab (các dịch tự nhiên của cơ thể như nhử mắt, nước mũi, dịch ngoáy hầu họng) từ cơ thể nếu có [26]. Lột da và bộc lộ xoang ngực, xoang bụng, tách các cơ quan nội tạng khỏi cơ thể quan sát và chụp ảnh. Tiến hành thu mẫu các cơ quan như: phổi, hạch, tim, gan, lách, thận theo các mục ựắch nghiên cứu khác nhaụ
c) Phương pháp làm tiêu bản bệnh lý
Từ những mẫu bệnh phẩm có các biến ựổi ựại thể ựược lấy mẫu ngâm trong formol 10% ựể làm tiêu bản vi thể. Cần tiến hành làm tiêu bản ựể xác ựịnh bệnh tắch vi thể chủ yếu của bệnh. Phương pháp làm tiêu bản vi thể theo quy trình tẩm ựúc bằng parafin, nhuộm Haematoxilin Ờ Eosin (HE). Các bước của quá trình làm tiêu bản vi thể như sau:
Cố ựịnh bệnh phẩm
Ngâm miếng tổ chức vào dung dịch formol 10%.
Vùi bệnh phẩm
Tiến hành lần lượt các bước sau:
- Rửa focmol: Rửa dưới vòi nước chảy nhẹ trong 24h. - đưa mẫu vào hệ thống máy chuyển ựúc mẫu tự ựộng. Hệ thống máy chuyển ựúc mẫu tự ựộng gồm 12 bình
Bình Hóa chất Thời gian (giờ)
1 Cồn 600C 1:00
2 Cồn 600C 1:00
3 Cồn 700C 1:30
Trường đại học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦẦ 33 5 Cồn 960C 1:30 6 Cồn 1000C 1:30 7 Cồn 1000C 1:30 8 Cồn 1000C 1:30 9 Xylen 1:30 10 Xylen 1:30 11 Parafin 2:00 12 Parafin 2:00 đúc block
đúc mẫu bệnh phẩm trong parafin.
Cắt dán mảnh và cố ựịnh tiêu bản
Cắt mảnh: bằng máy microtom.
Tãi mảnh: Dàn lát cắt bằng phẳng trên phiến kắnh trong nước ấm 480C. Sau ựó ựể tủ ấm 370C ựến khi bệnh phẩm khô là có thể ựem nhuộm ựược.
Nhuộm tiêu bản
Các bước tiến hành
+ Khử parafin: Cho tiêu bản qua hệ thống xylen gồm 3 lọ: Xylen I: 6h
Xylen II: 6h Xylen III: 12h
+ Khử xylen: Cho tiêu bản qua hệ thống cồn gồm 4 lọ: Cồn 1000: 2 lần (mỗi lần 1 phút)
Cồn 950: 1 lần Cồn 700: 1 lần Cồn 500: 1 lần
+ Khử cồn: Cho dưới vòi nước chảy 15 phút. + Nhuộm Haematoxylin (nhuộm nhân)
Trường đại học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦẦ 34 Nhỏ haematoxylin ngập tiêu bản trong 5 phút, rửa nước.
Sau ựó cho tiêu bản qua hệ thống cồn: Cồn 500: 1 lần
Cồn 700: 1 lần Cồn 950: 1 lần Cồn 1000: 2 lần Rửa tiêu bản
+ Nhuộm Eosin (nhuộm bào tương)
Nhỏ Eosin ngập tiêu bản khoảng 5-10 phút, rửa nước. Cho tiêu bản qua hai lọ cồn 1000 mỗi lọ 1 phút.
+ Tẩy cồn, làm trong tiêu bản: Cho tiêu bản ựi qua xylen .
Gắn Baume canada
Nhỏ một giọt Baume canada lên lamen rồi gắn nhanh lên tiêu bản khi vẫn còn xylen trên tiêu bản. Kiểm tra tiêu bản trên kắnh hiển vi quang học.
d) Phương pháp phân lập virus PRRS trên tế bào tổ chức
Là phương pháp khoa học tiên tiến ựược sử dụng rộng rãi trong Y học ựể nghiên cứu các virus như: phân lập, nuôi cấy, giám ựịnh, chuẩn ựộ, quan sát hình thái siêu cấu trúc của virus và ựặc biệt dùng các môi trường tế bào tổ chức ựể nuôi cấy các vacxin virus [36]. Với nhiều loại virus sự nhân lên của chúng tiến triển song song với sự thoái hoá của các tế bào nuôi, một số virus gây bệnh cho tế bào rất ựặc trưng. Những biến ựổi có tắnh chất ựặc trưng ựó gọi là sự huỷ hoại của tế bào chủ (Cytophathogenic Effect - CPE) hoặc các ổ tế bào bị hoại tử. Mỗi ổ tế bào bị hoại tử ựó ựược gọi là một ựơn vị plague, có thể ựánh giá ựược khối lượng virus gây nhiễm bằng số ựơn vị plague xuất hiện. Có những tế bào bị nhiễm virus chưa ựến mức bị chết nhưng chức năng của tế bào này ựã bị thay ựổị
Trường đại học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦẦ 35 Căn cứ vào CPE khi phân lập virus quan sát ựược bằng mắt thường có thể ựánh giá ựược hiệu quả phân lập, nuôi cấy virus.
để nghiên cứu PRRSV thường dùng môi trường tế bào Marc145. Mẫu bệnh phẩm (2g) ựược nghiền nát bằng chày và cối vô trùng sau ựó ựược ựồng nhất trong dung dịch DMEM (thể tắch 600ộl có bổ sung 10% kháng sinh, bảo quản ở -80oC cho ựến khi sử dụng). Mẫu ựã ựồng nhất ựược làm tan băng và ly tâm 10.000 vòng/phút/10 phút/4oC. Dịch ly tâm ựược lọc và gây nhiễm vào khay 96 giếng ựã ựược phủ một lớp tế bào Marc145. đặt trong tủ ấm và hàng ngày kiểm tra bệnh tắch tế bào CPẸ Những giếng tế bào có bệnh tắch ựược thu và bảo quản ở -80oC ựể sử dụng các nghiên cứu tiếp theọ
e) Phương pháp tách chiết RNA tổng số bằng Kit
RNA của virus ựược tách chiết bằng kit QIAamp ựể tiến hành phản ứng RT- PCR, các bước tiến hành theo hướng dẫn của nhà sản xuất cụ thể. - Quy trình tách chiết RNA từ dịch thu tế bào Marc145 gây nhiễm virus PRRS
Bước 1: Cho 560ộl Buffer AVL vào ống eppendoft
Bước 2: Cho 140ộl mẫu virus vào ống trên. Votex trong 15 giây, ựể nhiệt ựộ phòng trong 10 phút, ly tâm thời gian ngắn.
Bước 3: Cho 560ộl Ethanol (96% - 100%) vào ống và votex trong 15 giâỵ
Bước 4: Hút 630ộl mẫu trong ống vào cột QIA ựậy nắp và ly tâm 8.000 vòng/phút/2 phút, loại bỏ dung dịch phắa dưới ống, lặp lại bước 4 một lần nữa với phần mẫu còn lạị
Bước 5: Cho 500ộl AW1 vào cột QIA, ly tâm 8.000 vòng/phút/2 phút, loại bỏ dịch phắa dưới cột.
Bước 6: Cho 500ộl AW2 vào cột QIA, ly tâm 13.500 vòng/phút/3 phút, loại bỏ dịch phắa dưới cột, ly tâm lại lần nữa với tốc ựộ tối ựa trong 1 phút.
Trường đại học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦẦ 36 Bước 7: đặt cột QIA vào ống eppendoft 1.5 ml mới, thêm 60ộl AVE ựể ở nhiệt ựộ phòng trong 1 phút, ly tâm tốc ựộ 8.000 vòng trong 1 phút. Thu dịch qua cột và bảo quản ở -200C hoặc -800C.
f)Phương pháp tách chiết RNA tổng số bằng hóa chất
Hóa chất cần chuẩn bị: Trizol, Chloroform, Isopropyl alcohol (2-propanol), Ethanol 75%, Rnase Ờ free water
Các bước tiến hành:
Bước 1: Lấy 100 ộl virus PRRS vào ống eppendorf 1.5 ml
Bước 2: Bổ sung 1ml of Trizol vào ống trên và lắc ựều, giữ 5 phút ở nhiệt ựộ phòng
Bước 3: Bổ sung thêm 0.2ml chloroform vào ống và lắc ựều giữ 3 phút ở nhiệt ựộ phòng
Bước 4: Ly tâm dung dịch ở 12.000 vòng trong 15 phút ở 40C
Bước 5: Chuyển 350ộl dịch nổi phắa trên sang ống mới và bổ sung 500ộl isopropyl alcohol, giữ ở nhiệt ựộ phòng trong 10 phút.
Bước 6: Ly tâm dung dịch ở 12.000 vòng trong 10 phút ở 40C
Bước 7: Loại bỏ dịch nổi và giữ lại cặn, bổ sung 1ml ethanol 75% lặc ựều, ly tâm dung dịch ở 7.500 vòng trong 5 phút ở 40C
Bước 8: Loại bỏ dịch nổi và giữ lại cặn ựể khô tự nhiên ở nhiệt ựộ phòng Bước 9: Bổ sung 50ộl Rnase Ờ free water, lắc ựều và bảo quản RNA
g) Phương pháp RT-PCR
Các bước tiến hành phản ứng RT- PCR
Mẫu RNA sau khi tách chiết sẽ ựược hỗn hợp với các thành phần phản ứng ựược trình bày ở bảng sau:
Thành phần phản ứng Thể tắch cần lấy (ộl)
2X Reaction Mix 12,5
Trường đại học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦẦ 37
Primer Forward 0,5
Primer Reverse 0,5
RT/Platium Taq Mix 0,5
Nước cất 6,0
Tổng thể tắch 25
Các mồi xử dụng trong phản ứng RT-PCR
Mồi ORF5
Mồi xuôi ATG TTG GGG AAG TGC TTG ACC
Mồi ngược CTA GAG ACG ACC CCA TTG TTC CGC
Tiến hành phản ứng khuếch ựại sản phẩm trong máy PCR theo chu kỳ nhiệt sau:
Giai ựoạn Bước tổng hợp Nhiệt ựộ (oC) Thời gian Số chu kỳ
Tổng hợp cDNA 50 30 phút 1 Duỗi mạch 95 5 phút 1 Duỗi mạch 95 15 giây Gắn mồi 50 30 giây 2 Tổng hợp sợi mới 72 1 phút 35 3 Hoàn chỉnh 72 5 phút 1 4 Giữ sản phẩm 4 ∞
Sản phẩm của phản ứng RT- PCR sẽ ựược kiểm tra bằng phương pháp ựiện dị
h) Phương pháp ựiện di
Bước 1: Chuẩn bị dung dịch ựệm và bản gel
Dung dịch ựệm thường ựược sử dụng trong ựiện di agarose và polyacrylamid là TBE hoặc TAE, trong nghiên cứu này chúng tôi sử dụng TBE và agarose ựể tạo bản gel.
Trường đại học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦẦ 38 Bản gel ựược chuẩn bị bằng dung dịch ựệm TBE 1X hòa tan với 1,2 gram agarose ựặt trong lò vi sóng ở 1000C trong 5 phút, ựổ vào khuôn có các lược ựược cài sẵn ựể tạo bản gel với các giếng tra mẫu cần ựiện dị Khi bản gel ựã ựông cứng ựặt bản gel vào bể ựiện di và ựổ dung dịch ựệm TBE ngập bản gel khoảng 3-5 mm
Bước 2: Tra mẫu ựiện di
Thêm 2 ộl loading dye vào 8 ộl sản phẩm RT-PCR, trộn ựều hỗn dịch bằng pipet và chuyển vào các giếng trong bản thạch. điện di ựồng thời cả thang chuẩn DNA (marker), thường sử dụng 4-6 ộl DNA Marker.
Bước 3: Chạy ựiện di
Nguồn ựiện trong ựiện di thường sử dụng ở hiệu ựiện thế 100V cường ựộ 100mA, thời gian chạy ựiện di trong 30 phút.
Bước 4: Nhuộm bản gel và ựọc kết quả
Kết thúc ựiện di, bản gel ựược lấy ra nhuộm Ethidium bromide hoặc SYBR green trong khoảng 5 ựến 7 phút. Sau khi nhuộm bản gel ựược chuyển vào máy phát tia UV ựể quan sát kết quả ựiện dị Vị trắ các ựoạn DNA ựược phát hiện bằng những vệt sáng tương ứng của thuốc nhuộm, chụp ảnh và lưu kết quả.
i) Phương pháp giải trình tự
Kỹ thuật giải trình tự: Giải trình tự DNA (DNA sequencing) là quá trình xác lập và thu nhận thành phần nucleotide của một phân ựoạn DNA cần nghiên cứụ Trong nghiên cứu này chúng tôi sử dụng máy giải trình tự gen tự ựộng Beckman Coulter CEQ 8000 (Mỹ) thắ nghiệm ựược tiến hành tại Phòng thắ nghiệm trung tâm Khoa Thú ỵ Nguyên tắc chung của máy giải trình tự gen tự ựộng là dựa theo cơ sở của phương pháp Sanger.
Quá trình thực hiện giải trình tự bao gồm các bước sau: Tinh sạch sản phẩm của phản ứng RT-PCR:
Trường đại học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦẦ 39 theo tỷ lệ 1:5 sau ựó trộn ựềụ
Bước 2: Cho hỗn hợp ựã trộn vào cột QIA ựem ly tâm 13.000 vòng/phút trong vòng 1 phút. Bỏ dung dịch ở ựáy ống.
Bước 3: Cho 750ộl PE vào cột QIA ựem ly tâm 13.000 vòng/phút trong vòng 1 phút. Bỏ dung dịch ở ựáy ống. Tiếp tục ly tâm 13.000 vòng/phút trong vòng 1 phút
Bước 4: Chuyển cột sang ống Eppendorff mớị Cho thêm 50 ộl EB vào
giữa màng ựể 1 phút ở nhiệt ựộ phòng. Sau ựó ựem ly tâm 13.000 vòng/phút trong vòng 1 phút (có thể lặp lại 1 lần nữa ựể ựảm bảo lấy hết ADN)
Bước 5: Bỏ cột, lấy dung dịch ở ống eppendorff (DNA tinh khiết)
Thực hiện phản ứng PCR sequencing: Chuẩn bị phản ứng trong ống PCR 0,2ml theo bảng sau:
Thành phần Thể tắch cho 1 phản ứng (ộl)
DTCS Quick Start Master Mix 8,0
DNA 0,5
Primer 2,0
dH2O 9,5
Tổng thể tắch 20
Với chương trình chạy PCR giải trình tự sau
Bước tổng hợp Nhiệt ựộ (0C) Thời gian Số chu kỳ
Biến tắnh chuỗi DNA 960C 20 giây
Gắn mồi 500C 20 giây
Kéo dài chuỗi DNA 600C 4 phút
30 chu kỳ
Giữ sản phẩm ở 40C Tinh sạch sản phẩm PCR giải trình tự
Sản phẩm của phản ứng PCR sequence sẽ ựược tinh sạch bằng Ethanol kèm theo hóa chất và hướng dẫn sử dụng của nhà sản xuất (Beckman Coulter- Mỹ) Các bước tinh sạch sản phẩm như sau:
Trường đại học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦẦ 40 Bước 1: Sản phẩm của phản ứng PCR sequence sẽ ựược hỗn hợp với 2ộl Sodium acetate, 2ộl EDTA Na2 và 1 ộl glycogen.
Bước 2: Bổ sung 60 ộl cồn 1000 trong ựiều kiện lạnh và tiến hành ly tâm 14000 vòng/phút trong 15 phút ở 40C, loại bỏ dịch nổi trên ống và giữ lại cặn DNẠ
Bước 3: Bổ sung 200ộl cồn 750 lạnh, tiến hành ly tâm ở 14000vòng/phút trong 2 phút ở 40C, loại bỏ dịch nổi và giữ lại cặn
Bước 4: Lặp lại bước 3 một lần nữa và ựể DNA khô tự nhiên hoặc ựặt trong máy quay khô chân không.
Bước 5: Bổ sung 40ộl SLS vào mỗi mẫu và trộn ựềụ
Sản phẩm sau khi tinh sạch ựược chuyển vào ựĩa chạy mẫu ựể tiến hành giải trình tự.
k) Phương pháp xử lý số liệu
Phân tắch xác nhận chuỗi gen thu ựược thông qua chương trình Blast trên Ngân hàng gen (GenBank) (http://www.ncbịnlm.nih.gov/). Truy cập ngân hàng gen thu nhận và xác ựịnh sự tương ựồng về nucleotide của các chuỗi gen tương ứng của virus với các phân ựoạn gen thu ựược trong nghiên cứụ Thành phần axit amin của kháng nguyên virus ựược thu nhận bằng cách sử dụng bộ mã của vi sinh vật bậc thấp (Bộ mã vi khuẩn Ờ bacterial code) có trong ngân hàng gen và so sánh thông qua chương trình Genetyx. Xác ựịnh nguồn gốc phả hệ phát sinh chủng loại trên cơ sở trình tự gen của chủng virus