4. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
4.2. Kết quả giải trình tự gen ORF5 của các chủng virus PRRS
4.2.1. Kết quả tách chiết RNA tổng số của các chủng virus PRRS
Các chủng virus PRRS gây ra các vụ dịch năm 2010 tại vùng phụ cận Hà Nội ựược thu thập bằng việc chẩn ựoán các lợn mắc bệnh bằng quan sát các triệu chứng lâm sàng, biến ựổi bệnh lý ựại thể, vi thể và kỹ thuật RT-PCR, các mẫu dương tắnh ựã ựược ựưa vào phân lập virus PRRS trên môi trường tế bào Marc145. Các virus PRRS sau khi phân lập ựược sẽ ựược bảo quản trong ựiều kiện thắch hợp (âm 800C). Ở nghiên cứu này chúng tôi tiến hành nghiên cứu 5 chủng virus PRRS ựược phân lập trên các lợn mắc bệnh thuộc các nhóm tuổi khác nhau ở các khu vực phụ cận Hà Nội ựể có kết quả về ựặc tắnh sinh học phân tử của các chủng virus gây ra hội chứng rối loạn hô hấp và sinh sản.
Các chủng virus PRRS ựược lựa chọn ựã ựược nhân lên trên môi trường tế bào Marc145 và sẽ ựược tiến hành tách chiết RNA tổng số của từng chủng virus theo quy trình tách chiết của bộ Kit Qiagen (ựã trình bày trong phần phương pháp nghiên cứu). Kết quả tách chiết RNA tổng số của virus sẽ ựược kiểm tra bằng ựiện di trên thạch agarose 1.2% và là nguyên liệu cho phản ứng RT-PCR ựể tạo ra phân tử DNA hoàn chỉnh từ sợi ựơn dương RNẠ Kết quả kiểm tra tách chiết RNA tổng số ựược minh họa ở hình 4.24
Hình 4.24. Hình ảnh ựiện di kiểm tra sản phẩm tách chiết RNA tổng số (Theo thứ tự từ trái sang phải là kết quả tách chiết RNA tổng số của các mẫu
Trường đại học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦẦ 55 Hình ảnh ựiện di cho thấy có một lượng lớn RNA thu ựược sau khi tiến hành tách chiết, biểu hiện bằng các vệt sáng thu ựược khi chụp ảnh bằng máy chụp ảnh gel do RNA ựã giữ Ethidiumbromide lại trên bản thạch và dưới tác dụng của tia UV các thuốc nhuộm này này phát màu sáng. đồng thời các RNA tách chiết có ựộ nguyên vẹn cao biểu thị bằng một vạch sáng, do RNA tắch ựiện âm nên trong ựiện trường chúng sẽ chạy về cực dương. Nếu phổ ựiện di của RNA tách chiết khi hiện hình cho nhiều dải băng (nhiều vạch sáng) thì chứng tỏ khi chiết tách chúng ựã bị gãy ựoạn nhiềụ Phổ ựiện di gọn chứng tỏ RNA chiết tách ắt bị ựứt gãỵ Như vậy quá trình tách chiết RNA tổng số của các chủng virus PRRS là thành công, cung cấp nguyên liệu cho phản ứng RT-PCR.
4.2.2. Kết quả phản ứng RT- PCR
Sản phẩm RNA tổng số của các chủng virus PRRS nghiên cứu thu ựược sau khi tách chiết sẽ ựược khuếch ựại bằng kỹ thuật RT-PCR với sự tham gia của enzym sao chép ngược (Reverse Transcrip) và sử dụng cặp mồi ORF5 (ựã trình bày ở phần phương pháp nghiên cứu) có khả năng phát hiện virus PRRS thuộc cả chủng Bắc Mỹ và chủng châu Âu (cặp mồi này cho phép xác ựịnh ựoạn gen của virus PRRS có kắch thước 603bp) ựể tạo ra các ựoạn DNA hoàn chỉnh (cDNA). Sản phẩm cDNA sau khi khuếch ựại trong máy PCR ựược ựiện di và chụp ảnh. Kết quả của phản ứng RT- PCR xác ựịnh PRRSV ựược trình bày ở hình 4.25.
Trường đại học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦẦ 56
Hình 4.25. Kết quả phản ứng RT- PCR với mồi ORF5
[Virus PRRS ựược phát hiện bằng phản ứng RT- PCR với ựộ dài của
gen là 603bp, thang chuẩn M 100bp; giếng từ 1-5 là mẫu của 5 chủng virus PRRS nghiên cứu; giếng 6 là ựối chứng âm (nước sinh lý); giếng 7 là ựối chứng dương (virus PRRS)]
(1: 171KTY, 2: 374KTY, 3: 352KTY, 4: CL2, 5: HTP1)
Sản phẩm ựiện di cho vạch DNA tương ứng 603bp ựúng theo thiết kế mồị Kết quả tạo DNA của các chủng virus PRRS là thành công. Như vậy chúng tôi ựã thu ựược DNA của ựoạn gen ORF5 của cả 5 chủng virus PRRS nghiên cứụ
4.2.3. Kết quả giải trình tự gen ORF5 của các chủng virus PRRS
Sau khi tiến hành kỹ thuật RT-PCR và thu ựược sản phẩm chúng tôi tiến hành tinh sạch sản phẩm của phản ứng RT-PCR bằng Kit ựể loại bỏ hết các thành phần dư thừa sau phản ứng. Sản phẩm sau khi tinh sạch là DNA của virus sẽ ựược cloning với từng loại mồi ựơn (mồi xuôi và mồi ngược) ựể nhân nhanh số lượng bản sao theo một chiều của ựoạn gen (thực hiện phản ứng PCR giải trình tự). Tinh sạch sản phẩm của phản ứng PCR giải trình tự bằng Kit ựược cung cấp của nhà sản xuất, sau ựó tiến hành giải trình tự gen. Quá trình giải trình tự ựược thực hiện bằng máy giải trình tự Beckman Coulter CEQ 8000 của Mỹ tại Phòng thắ nghiệm trung tâm Khoa Thú y, Kết quả ựược biểu thị bằng chương trình Genetyx thể hiện ở hình 4.26.
Trường đại học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦẦ 57
Hình 4. 26. Giản ựồ giải trình tự tự ựộng thành phần nucleotide của ựoạn gen nghiên cứu
Trường đại học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦẦ 58 Hình 4.26 cho thấy chất lượng giải trình tự tốt, mỗi ựỉnh màu của giản ựồ ựều xác nhận một loại nucleotide, các nucleotide khác nhau tiếp nhận thuốc nhuộm huỳnh quang khác nhau khi ựọc bằng tia laser cho hiển thị màu tương ứng trong ựó Adenin cho màu ựỏ, Thymine cho màu xanh, Guanine cho màu xanh lá cây, Cytosine cho màu ựen. Chuỗi nucleotide thu ựược sau khi giải trình tự ựược xử lý bằng các phần mềm phân tắch trên máy tắnh. Sau khi phân tắch chúng tôi thu ựược toàn bộ ựoạn gen ORF5 của 5 chủng virus PRRS nghiên cứu có ựộ dài 603bp. Như vậy việc tách chiết RNA tổng số, quá trình thực hiện RT-PCR và giải trình tự ựã ựược thực hiện thành công. Trình tự nucleotide của gen ORF5 của các chủng virus PRRS nghiên cứu ựã ựược xác ựịnh.
4.3. Kết quả so sánh trình tự nucleotide của ựoạn gen ORF5 của các chủng virus PRRS nghiên cứu và một số chủng virus vacxin chủng virus PRRS nghiên cứu và một số chủng virus vacxin
Nghiên cứu các ựặc tắnh sinh học phân tử của các chủng virus PRRS phân lập ở vùng phụ cận Hà Nội chúng tôi ựồng thời tiến hành giải trình tự ựoạn gen ORF5 của 5 chủng virus nghiên cứu và chủng virus PRRS ựược sử dụng làm vacxin của Trung Quốc và chủng virus VR-2332 của Bắc Mỹ ựể xác ựịnh sự tương ựồng về nucleotide giữa các chủng virus PRRS của Việt Nam và các chủng này, qua ựó thấy ựược cụ thể hơn mức ựộ biến ựổi thành phần nucleotide cũng như mối quan hệ giữa các chủng virus gây bệnh tại vùng phụ cận Hà Nội và các chủng virus ựược sử dụng làm vacxin tại Việt Nam.
Chuỗi gen mà chúng tôi tiến hành giải trình tự thành công có kắch thước 603bp ựược dùng làm chuỗi truy cập trong chương trình BLAST của ngân hàng gen quốc tế nhằm tìm kiếm các chuỗi ựắch ựã ựược ựăng ký trong ngân hàng gen dựa vào mức ựộ tương ứng về nucleotidẹ Kết quả so sánh với các trình tự của virus VR-2332 thuộc dòng Bắc Mỹ và chủng virus vacxin
Trường đại học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦẦ 59 Trung Quốc ựược thể hiện ở hình 4.27
Trường đại học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦẦ 60
Hình 4.27. So sánh trình tự nucleotide của ựoạn gen ORF5 của các chủng virus PRRS nghiên cứu
Ghi chú: Sai khác về nucleotide của các chủng PRRSV ựược biểu thị bằng kắ hiệu dấu (.), biểu thị (*) là giống nhau về nucleotide
Trường đại học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦẦ 61 Kết quả bảng so sánh về thành phần nucleotide cho thấy các chủng virus PRRS giải trình tự ựược ựều có sự sai khác tương ựối về thành phần nucleotide với nhau và với các chủng VR-2332, chủng virus vacxin Trung Quốc.
Trong ựó, ựoạn gen ORF5 của 5 chủng virus PRRS nghiên cứu ựều có cùng số lượng nucleotide là 603 bp và cùng số lượng nucleotide với chủng VR-2332 và chủng virus vacxin Trung Quốc.
Các chủng virus PRRS phân lập ở Hà Nội và vùng phụ cận có 14 sai khác về nucleotide với nhau ở các vị trắ nucleotide sau: 29 (A<->G), 86 (T<- >C), 101 (A<->G), 132 (C<->T), 135 (A<->G), 240 (G<->A), 279 (G<->A), 351 (A<->G), 405 (T<->C), 447 (G<->A), 471 (A<->G), 483 (G<->A), 516 (C<->T), 519 (C<->G).
(Giải thắch: 29 (A<->G) có nghĩa là có sự sai khác về nucleotide ở vị trắ nucleotide thứ 29 trong 603 nucleotide theo thứ tự của trình tự thu nhận ựược trong ựó nucleotide A bị thay thế bằng nucleotide G)
So sánh cụ thể từng chủng virus PRRS với nhau chúng tôi thấy rằng:
+ Chủng virus 171KTY có 8 sai khác về nucleotide với chủng 347KTY ở các vị trắ nucleotide sau: 86 (T<->C), 240 (G<->A), 279 (G<->A), 351 (A<->G), 405 (T<->C), 447 (G<->A), 471 (G<->A), 519 (C<->G).
+ Chủng virus 171KTY cũng có 8 sai khác về nucleotide với chủng 352KTY ở các vị trắ nucleotide sau: 86 (T<->C), 240 (G<->A), 279 (G<->A), 351 (A<->G), 405 (T<->C), 447 (G<->A), 471 (G<->A), 519 (C<->G).
+ Chủng virus 171KTY có 10 sai khác về nucleotide với chủng CL2 ở các vị trắ nucleotide sau: 29 (G<->A), 86 (T<->C), 240 (G<->A), 279 (G<- >A), 351 (A<->G), 405 (T<->C), 447 (G<->A), 471 (G<->A), 516 (C<->T), 519 (C<->G).
Trường đại học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦẦ 62 các vị trắ nucleotide sau: 86 (T<->C), 132 (C<->T), 135 (A<->G), 240 (G<- >A), 279 (G<->A), 351 (A<->G), 405 (T<->C), 447 (G<->A), 471 (G<->A), 483 (G<->A), 519 (C<->G).
So sánh tương tự với các chủng còn lại với nhau chúng tôi nhận thấy giữa các chủng virus PRRS phân lập còn lại (374KTY, 352KTY, CL2, HTP1) chỉ sai khác nhau ở 5 vị trắ nucleotide sau: 29 (G<->A), 132 (C<->T), 135 (A<->G), 483 (G<->A), 516 (C<->T).
Như vậy giữa các chủng virus PRRS mà chúng tôi nghiên cứu chỉ sai khác về thành phần nucleotide từ 5 nucleotide ựến 11 nucleotidẹ Có thể thấy rằng các chủng này có thành phần nucleotide tương ựối giống nhau (sự sai khác về nucleotide không quá 2% tổng số nucleotide của ựoạn gen).
Tương tự như vậy, chúng tôi tiếp tục tiến hành so sánh trình tự nucleotide của các chủng virus PRRS nghiên cứu với chủng virus vacxin Trung Quốc dựa trên bảng so sánh thành phần nucleotide 4.2. Kết quả thu ựược, 5 chủng virus nghiên cứu có 18 sai khác về nucleotide với chủng virus vacxin Trung Quốc ở các vị trắ nucleotide sau: 29 (A<->G), 86 (C<->T), 97 (A<->G), 101 (G<->A), 132 (C<->T), 135 (A<->G), 177 (A<->T), 240 (G<- >A), 279 (A<->G), 351 (A<->G), 405 (T<->C), 447 (A<->G), 471 (G<->A), 483 (G<->A), 490 (G<->A), 516 (T<->C), 519 (C<->G), 587 (A<->T).
+ Trong ựó chủng virus 171KTY có 603 trình tự nucleotit so sánh với chủng virus vacxin Trung Quốc thì có 7 vị trắ sai khác về nucleotide chỉ chiếm 1,15% sai khác nucleotide ở các vị trắ nucleotide sau: 97 (A<->G) , 177(A<->T), 351(A<->G), 405(T<->C), 519(C<->G), 587 (A<->T), 447(A<- >G).
+ Tương tự như vậy chúng tôi có kết quả so sánh nucleotide của các chủng virus PRRS nghiên cứu với chủng virus vacxin Trung Quốc như sau:
Trường đại học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦẦ 63 - 352KTY: có 10 vị trắ sai khác về nucleotide
- CL2: 12 vị trắ sai khác về nucleotide - HTP1: 13 vị trắ sai khác về nucleotide
Như vậy các chủng virus PRRS phân lập tại Hà Nội và vùng phụ cận có mức ựộ sai khác về nucleotide không ựáng kể so với chủng virus vacxin của Trung Quốc, nhưng mức ựộ sai khác này vẫn cao hơn so với các chủng phân lập tại Hà Nội và vùng phụ cận với nhaụ Tuy nhiên chủng virus 171KTY có mức ựộ sai khác với chủng virus vacxin của Trung Quốc ắt nhất (7 nucleotide) ắt hơn cả các chủng virus phân lập nghiên cứụ điều này cho thấy mối liên quan chặt chẽ về nguồn gốc của chủng virus phân lập với chủng virus vacxin Trung Quốc.
Tiếp tục so sánh sự tương ựồng nucleotide của các chủng virus phân lập với chủng VR-2332 chúng tôi nhận thấỵ Trong khi sự sai khác về nucleotide của các chủng PRRS phân lập tại Việt Nam so với chủng virus vacxin Trung Quốc là không ựáng kể thì sai khác về nucleotide với chủng virus VR-2332 là khá lớn từ 64-67 nucleotide sự sai khác gấp 5-6 lần so với chủng virus vacxin của Trung Quốc.
Như vậy qua kết quả phân tắch thành phần nucleotide của các chủng virus PRRS nghiên cứu và các chủng so sánh chúng tôi nhận thấy trình tự nucleotide ựoạn gen ORF5 của các chủng PRRSV phân lập ở Việt Nam sai khác nhau về nucleotide là không ựáng kể (sai khác 1,5 % về nucleotide) và có sai khác ắt với chủng virus vacxin Trung Quốc (sai khác 2 % về nucleotide), sai khác nhiều với chủng virus VR-2332 (sai khác 11 % về nucleotide).
4.4. Kết quả so sánh trình tự axit amin của ựoạn gen ORF5 của các chủng PRRS nghiên cứu và một số chủng virus vacxin chủng PRRS nghiên cứu và một số chủng virus vacxin
Trường đại học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦẦ 64 trình tự axit amin của ựoạn gen ORF5 dựa trên bộ mã của vi khuẩn bậc thấp (bacterial code) có trong ngân hàng gen và so sánh trình tự axit amin của các chủng PRRSV nghiên cứu và chủng virus vacxin kết quả so sánh ựược trình bày ở hình 4.28
Trường đại học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦẦ 65
Hình 4.28. So sánh trình tự axit amin của ựoạn gen ORF5 của các chủng virus PRRS nghiên cứu
Trường đại học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦẦ 66 Những sai khác về trình tự nucleotide của bộ ba mã hóa có thể dẫn ựến những sai khác về thành phần axit amin (cứ 3 nucleotide mã hóa cho một axit amin- 3 nucleotide này ựược gọi là bộ 3 mã hóa) tuy nhiên cũng có những sự thay ựổi về nucleotide mà không dẫn ựến sự thay ựổi về axit amin do một số axit amin có thể do nhiều bộ ba nucleotide cùng mã hóạ Chắnh vì vậy ựôi khi sự sai khác về nucleotide lại không dẫn ựến sự sai khác về axit amin nên không làm thay ựổi cấu trúc của protein ựược mã hóa bởi gen. Tuy nhiên có những sai khác về nucleotide sẽ dẫn ựến những sai khác trong bộ 3 mã hóa và hệ quả là sự sai khác axit amin và có thể thay ựổi cả tắnh chất của protein ựược tạo ra bởi axit amin này và ựây là nguyên nhân phát sinh các biến dị di truyền thay ựổi tắnh gây bệnh của virus. để nghiên cứu toàn diện về ựặc tắnh sinh học phân tử của các chủng virus PRRS nghiên cứu thì sau khi xác ựịnh ựược trình tự nucleotide cần xác ựịnh tiếp thành phần axit amin của ựoạn gen ựó ựể có kết quả chắnh xác về sự biến ựổi ở mức ựộ phân tử của các chủng virus PRRS phân lập.
Qua kết quả so sánh trình tự axit amin của chuỗi gen giải trình tự cho thấy:
Trình tự 603 nucleotide của các chủng virus PRRS nghiên cứu và các chủng so sánh ựều mã hóa cho 201 axit amin của ựoạn gen ORF5 và trình tự axit amin giữa các chủng virus này ựều có sự sai khác tương ựối, trong ựó:
Giữa các chủng PRRS nghiên cứu nếu có 14 vị trắ sai khác về nucleotide thì lại chỉ có 4 vị trắ sai khác về axit amin ựó là các vị trắ: axit amin 4, axit amin 10, axit amin 30 và axit amin 35.
(Giải thắch: axit amin 4 có nghĩa là có sự sai khác về axit amin ở vị trắ axit amin thứ tư trong trình tự 201 axit amin theo thứ tự của trình tự axit amin thu nhận ựược)
Trường đại học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦẦ 67 Trong ựó chủng virus 171KTY có 3 vị trắ sai khác về axit amin với chủng virus 374KTY là các vị trắ axit amin 4, axit amin 30, axit amin 35 và 2 vị trắ sai khác về axit amin với các chủng còn lại là vị trắ axit amin 30 và axit amin 35.
So sánh thành phần axit amin của các chủng virus PRRS nghiên cứu với chủng virus vacxin Trung Quốc thấy có 6 vị trắ sai khác là các vị trắ axit amin 4, axit amin 10, axit amin 30, axit amin 35, axit amin 165, axit amin 196.
Riêng với chủng virus 171KTY có 7 vị trắ sai khác nucleotide với vacxin Trung Quốc và có 2 vị trắ sai khác về axit amin (axit amin 165, axit