Tách dòng biểu hiện gene Xyna từ Bacillus Subtilis CN2 trên E Coli BL21 và nghiên cứu đặc tính của Xylase tái tổ hợp

Tách dòng biểu hiện gene Xyna từ Bacillus Subtilis CN2 trên E Coli BL21 và nghiên cứu đặc tính của Xylase tái tổ hợp Tách dòng biểu hiện gene Xyna từ Bacillus Subtilis CN2 trên E Coli BL21 và nghiên cứu đặc tính của Xylase tái tổ hợp luận văn tốt nghiệp thạc sĩ

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI - DƯƠNG THỊ LƯƠNG LIÊN TÁCH DÒNG, BIỂU HIỆN GENE XYNA TỪ BACILLUS SUBTILIS CN2 TRÊN E COLI BL21 VÀ NGHIÊN CỨU ĐẶC TÍNH CỦA XYLANASE TÁI TỔ HỢP LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC CHUYÊN NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC NGUỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS TRẦN LIÊN HÀ Hà Nội – 2011 Viện CNSH&CNTP - ĐHBKHN Luận văn thạc sỹ khoa học LỜI CAM ĐOAN Tôi Dương Thị Lương Liên xin cam đoan nội dung luận văn với đề tài “Tách dòng, biểu gene xynA từ B subtilis CN2 E coli BL21 nghiên cứu đặc tính enzyme xylanaseA tái tổ hợp” cơng trình nghiên cứu sáng tạo tơi thực hướng dẫn PGS.TS Trần Liên Hà Bộ môn Vi sinh - Hố sinh Sinh học phân tử - Viện Cơng nghệ Sinh học Thực phẩm - Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội giúp đỡ TS Ogasawara Wataru Khoa Kỹ thuật Sinh học - Trường Đại học Công nghệ Nagaoka, Nhật Bản Dương Thị Lương Liên CH09-11 i Viện CNSH&CNTP - ĐHBKHN Luận văn thạc sỹ khoa học LỜI CẢM ƠN Trước hết cho xin bày tỏ lòng cảm ơn chân thành tới PGS.TS Trần Liên Hà Bộ mơn Vi sinh - Hố sinh Sinh học phân tử, Viện Công nghệ Sinh học Thực phẩm, Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội Người hướng dẫn, định hướng nghiên cứu tận tình giúp đỡ tơi suốt q trình học tập nghiên cứu, người mang lại cho khám phá sống, nghị lực vươn lên khơi gợi say mê tính sáng tạo Tôi xin chân thành cảm ơn PGS.TS Ogasawara Wataru TS Takanori Furukawa người hướng dẫn tận tình bảo cho tơi thời gian tơi học tập nghiên cứu phịng thí nghiệm PGS TS Ogasawara, Khoa Kỹ thuật Sinh học Trường Đại học Công nghệ Nagaoka, Nhật Bản Nơi mà thu nhiều kiến thức kinh nghiệm thực tế, giúp trưởng thành nghiên cứu làm chủ kiến thức Tơi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới toàn thể bạn sinh viên toàn thể cán phịng thí nghiệm cơng nghệ sinh học C4 – 401 tồn thể thầy bạn bè viện, phịng thí nghiệm vi sinh C10, thành viên phịng thí nghiệm TS Ogasawara giúp đỡ tạo điều kiện nhiều cho q trình nghiên cứu Cuối lịng biết ơn tới bố, mẹ, anh, chị, em gia đình tơi, người bạn tôi, người động viên ủng hộ suốt thời gian học Hà Nội, ngày 29 tháng 11 năm 2011 Học viên Dương Thị Lương Liên Dương Thị Lương Liên CH09-11 ii Viện CNSH&CNTP - ĐHBKHN Luận văn thạc sỹ khoa học MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN - i LỜI CẢM ƠN - ii T 53T T 53T MỤC LỤC - iii T 53T DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT vi T T DANH MỤC CÁC BẢNG viii DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ VÀ ĐỒ THỊ ix MỞ ĐẦU - T 53T T T T 53T CHƯƠNG I - TỔNG QUAN 1.1 Xylan T T 53T 53T 1.2 Xylanase 1.2.1 Tên gọi đặc tính xylanase T 53T T T 1.2.2 Phân loại xylanase 1.2.3 Cấu trúc không gian chiều xylanase T 53T T T 1.2.4 Chức chế thủy phân xylanase 1.2.5 Ứng dụng xylanase 13 1.2.6 Dạng sản phẩm xylanase thị trường 16 1.3 Những thành tựu tách dịng biểu gene xynA mã hố xylanase 17 1.3.1 Ở nước ta 17 T T T 53T T T T T T 53T 1.3.2 Trên giới 18 CHƯƠNG - VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP - 21 2.1 Vật liệu nghiên cứu 21 2.1.1 Chủng giống vector cho tách dòng biểu 21 2.1.2 Môi trường nuôi cấy giữ giống vi sinh vật 21 2.1.3 Hóa chất, enzyme, kit, thiết bị sử dụng 21 2.2 Nội dung nghiên cứu 23 2.2.1 Tách dòng 23 2.2.1.1 Tách DNA tổng số 23 2.2.1.2 Thiết kế mồi 24 2.2.1.3 Khuếch đại gene 25 2.2.1.4 Tinh sản phẩm PCR 25 2.2.1.5 Kiểm tra sản phẩm điện di gel agarose 26 2.2.1.6 Phản ứng nối gốc phosphate đầu 5’ gene xynA khuếch đại 26 2.2.1.7 Cắt sản phẩm PCR, pET22b(+) enzyme giới hạn 27 T 53T T T T 53T T T T T T T T T 53T 53T T T T T 53T 53T 53T T T T T T Dương Thị Lương Liên CH09-11 T T iii Viện CNSH&CNTP - ĐHBKHN Luận văn thạc sỹ khoa học 2.2.1.8 Loại bỏ nhóm phosphat đầu 5’ vector tách dòng 28 2.2.1.9 Phản ứng nối 29 T T T 53T 2.2.1.10 Tạo tế bào khả biến E coli DH5α E coli BL21(DE3) 30 2.2.1.11 Biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào khả biến E coli 31 T T T T 2.2.1.12 Chọn lọc khuẩn lạc chứa gene 32 2.2.1.13 Tách chiết plasmid DNA 33 2.2.2 Giải trình tự 34 T T T T T 53T 2.2.2.1 Giải trình tự DNA theo phương pháp dideoxy 34 2.2.2.2 Phương pháp tách chiết DNA plasmid tinh PEG 4000 34 T T T T 2.2.2.3 Giải trình tự máy giải trình tự CEQ 2000 Dye Terminator Cycle T sequencing 35 2.2.3 Biểu gene 36 2.2.3.1 Hệ thống biểu pET 36 2.2.3.2 Phương pháp bổ sung chất cảm ứng IPTG 38 2.2.3.3 Phương pháp bổ sung chất cảm ứng α-lactose 39 2.2.4 Phương pháp điện di protein SDS-PAGE 39 2.2.5 Tinh protein xylanase tái tổ hợp 40 2.2.5.1 Phương pháp tách protein 40 2.2.5.2 Phương pháp tinh protein dựa trình tự His-tag 41 2.2.6 Phương pháp xác định hoạt độ xylanase 43 53T T 53T T T T T T T T T T T T T T T T T 2.2.6.1 Phương pháp Nelson-Somogyi 43 2.2.6.2 Phương pháp đục lỗ thạch xác định vòng phân giải 44 2.2.7 Phương pháp xác định nồng độ protein (Bradford) 44 2.2.8 Khảo sát đặc tính xylanase A 45 2.2.8.1 Xác định độ bền pH 45 2.2.8.2 Xác định pH tối ưu 45 2.2.8.3 Xác định nhiệt độ tối ưu 45 2.2.8.4 Xác định độ bền nhiệt độ 45 CHƯƠNG - KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN - 46 3.1 Tách dòng 46 3.1.1 Tách DNA tổng số 46 3.1.2 Thiết kế mồi 47 3.1.3 Khuếch đại gene 49 3.1.4 Nối sản phẩm PCR với vector tách dòng 49 T T T T T T T T T 53T T 53T T T T T T T T 53T T T T 53T 53T 53T T Dương Thị Lương Liên CH09-11 T iv Viện CNSH&CNTP - ĐHBKHN Luận văn thạc sỹ khoa học 3.1.5 Biến nạp vào tế bào khả biến E coli DH5α 50 3.1.6 Chọn lọc plasmid chứa gene đích 52 T T T T 3.2 Giải trình tự 54 3.2.1 Tinh plasmid PEG 4000 54 T 53T T T 3.2.2 Kết giải trình tự 55 3.3 Biểu gene xynA từ Bacillus subtilis CN2 59 3.3.1 Biến nạp vào tế bào khả biến E coli BL21(DE3) 59 T 53T T T T T 3.3.2 Sử dụng chất cảm ứng IPTG 60 3.3.3 Sử dụng chất cảm ứng α-lactose 63 T T T T 3.3.3.1 Tối ưu hố điều kiện ni cấy với chất cảm ứng α-lactose 63 T T 3.3.3.2 Hoạt tính xylanase tái tổ hợp môi trường đặc 1% xylan 66 3.4 Tinh protein xylanase A tái tổ hợp 66 3.4.1 Sử dụng nhựa Ni-NTA 67 3.4.2 Sử dụng nhựa TALON 69 3.4.3 Đánh giá chất lượng trình tinh 70 3.5 Khảo sát đặc tính xylanase tái tổ hợp 70 3.5.1 Độ bền pH xylanase tái tổ hợp 71 3.5.2 pH tối ưu xylanase tái tổ hợp 72 3.5.3 Nhiệt độ tối ưu xylanase tái tổ hợp 73 3.5.4 Độ bền nhiệt độ xylanase tái tổ hợp 74 T T T T T 53T T 53T 53T 53T T T T T T T T T T T T T KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ - 77 TÀI LIỆU THAM KHẢO 78 PHỤ LỤC - 84 T 53T T T 53T 53T Dương Thị Lương Liên CH09-11 v Viện CNSH&CNTP - ĐHBKHN Luận văn thạc sỹ khoa học DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT STT Ký hiệu Tên đầy đủ Amax Optical density maximum (mật độ quang cực đại) Amp Ampicillin APS Ammonium persulfate B subtilis Bacillus subtilis BB Bug Buster bp Base pair BSA Bovine Serum Albumin C Carbon CI Chloroform/isoamylalcohol 10 CTAB Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide 11 ddH O Nước đề ion lần 12 ddNTP Dideoxyribonucleotide triphosphate 13 DMSO Dimethyl sulfoxide 14 DNA Deoxyribonucleic acid 15 dNTP Deoxyribonucleotide triphosphate 16 DTT Dithiothreitol 17 E coli Escherichia coli 18 EDTA Ethylen diamin tetra acetate 19 EtBr Ethydium bromide 20 EtOH Ethanol 21 IPTG Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside 22 kDa Kilo Dalton 23 kV Kilo volt 24 LB Luria-Bertani 25 mRNA Messenger RNA (RNA thông tin) 26 MW Molecular weight (khối lượng phân tử) 27 NTA Nitriloacetic acid R R Dương Thị Lương Liên CH09-11 vi Viện CNSH&CNTP - ĐHBKHN Luận văn thạc sỹ khoa học 28 nu Nucleotide 29 OD Optical density (mật độ quang) 30 PCR Polymerase Chain Reaction 31 PDA Potato Dextrose Agar 32 rpm Revolutions per minute (vòng/phút) 33 SDS Sodium dodecyl sulphate 34 SDS-PAGE Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel ectrophoresis 53T T 35 SLS Sample loading solution (dung dịch tra mẫu) 36 TAE Tris-Acetate-EDTA 37 TB Terrific broth 38 Tb Teriffic Broth 39 TE Tris-EDTA 40 TEMED Tetramethylethylenediamine 41 TE-RNase Tris-EDTA- Ribonuclease 42 Tm Temperature melting (nhiệt độ nóng chảy) 43 X-gal 5-bromo-4-chloro-indolyl-galactopyranoside Dương Thị Lương Liên CH09-11 vii Viện CNSH&CNTP - ĐHBKHN Luận văn thạc sỹ khoa học DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 2.1: Thành phần chu kì nhiệt phản ứng PCR 25 Bảng 2.2: Thành phần phản ứng cắt enzyme giới hạn của pET22b(+) 28 Bảng 2.3: Thành phần phản ứng cắt enzyme giới hạn của sản phẩm PCR 28 Bảng 2.4: Thành phần phản ứng loại bỏ nhóm phosphat vector 29 Bảng 2.5: Nồng độ khuôn DNA cho phản ứng giải trình tự 35 Bảng 3.1: Bảng mô tả độ tương đồng gene xynA từ B subtilis CN2 với trình tự khác từ ngân hàng Genbank 56 Bảng 3.2: Các đặc điểm xylanase từ chủng thuộc chi Bacillus khác 67 Bảng 3.3: Kết tinh xylanase tái tổ hợp từ E coli BL21 (DE3) 70 Bảng 4.1: Giá trị OD đo tương ứng với nồng độ xylose 89 Bảng 4.2: Giá trị OD đo tương ứng với nồng độ BSA 89 Bảng 4.3: Thành phần Gel 15% cho gel 89 Bảng 4.4 Đệm sodium phosphate 90 Bảng 4.5: Đệm sử dụng để xác định độ bền pH 90 Dương Thị Lương Liên CH09-11 viii Viện CNSH&CNTP - ĐHBKHN Luận văn thạc sỹ khoa học DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ VÀ ĐỒ THỊ Hình 1.1: Dạng đơn giản xylan Hình 1.2: Dạng phức tạp xylan Hình 1.3: Đơn vị cấu trúc xylan từ cỏ [8] Hinh 1.4: Cấu hình khơng gian G11 xylanase từ Bacillus subtilis (XYNA) Hình 1.5: Họ 11 xylanase từ Bacillus circulans (1XNB) Trichoderma harzianum (1XND) Hình 1.6: Cơ chế hoạt động xylanse dạng đơn giản 10 Hình 1.7: Vị trí công endo-1,4-β-xylanase mạch xylan 11 Hình 1.8: Cơ chế thủy phân xylan 1XNB 12 Hình 1.9: Cấu trúc xylan vị trí cắt enzyme trình sản xuất giấy 15 Hình 1.10: Các dạng sản phẩm xylanase thị trường 17 Hình 2.1: Phản ứng nối vector pUC118 gene xynA 29 Hình 2.2: Phản ứng chèn xynA gene vào pET22b(+) 30 Hình 2.3: Vector biểu pET22b(+) 37 Hình 2.4: Nguyên tắc phương pháp sắc ký lực sử dụng Ni2+ 42 Hình 3.1: Điện di DNA tổng số tách từ B subtilis CN2 gel agarose 1% 46 Hình 3.2: Trình tự mồi xuôi mồi ngược 47 Hinh 3.3: Vị trí cắt enzyme giới hạn xynA mang kí hiệu AF027868.1 48 Hình 3.4: Kết chạy PCR với cặp mồi thiết kế 49 Hinh 3.5: Điện di đồ kết thao tác thực trước nối 50 P P Hình 3.6: Chọn lọc khuẩn lạc chứa vector tái tổ hợp pUC118-xynA môi trường chứa X-gal-IPTG 51 Hình 3.7: Khuẩn lạc sau biến nạp plasmid tái tổ hợp pET-xynA vào E coli DH5α 51 Hình 3.8: Điện di đồ kết tách plasmid pET22b (+) tái tổ hợp cắt enzyme giới hạn 52 Hình 3.9: Điện di đồ kết tách plasmid pUC118 tái tổ hợp cắt enzyme giới hạn 53 Hình 3.10: Điện di đồ tinh plasmid pET-xynA PEG 54 Hình 3.11: Tinh vector pUC-xynA PEG cắt enzyme giới hạn 55 Hình 3.12: Trình tự nu gene xynA từ B subtilis CN2 56 Dương Thị Lương Liên CH09-11 ix Viện CNSH&CNTP - ĐHBKHN Luận văn thạc sỹ khoa học Hình 3.32: Độ bền nhiệt enzyme sử dụng nước đề ion ủ trước phản ứng Điều thấy ảnh hưởng nồng độ ion kim loại nhiệt độ khác lên hoạt tính enzyme tương đối rõ ràng Vì trước tiến hành ứng dụng enzyme ta cần phải xem xét thật kỹ tất yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính enzyme Dương Thị Lương Liên CH09-11 76 Viện CNSH&CNTP - ĐHBKHN Luận văn thạc sỹ khoa học KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận Đã thiết kế cặp mồi khuếch đại gene xynA chủng B subtilis CN2 BXMscI 5’-ACTGGCCAATGTTTAAGTTTAAAAAGAATTTCTTAGTT-3’ BXXhoI 5’-ATCTCGAGCCACACTGTTACGTTAGAACTTC-3’ Khuếch đại tách dịng thành cơng đoạn gene xynA E coli DH5α sử dụng pET22b(+) Giải trình tự đoạn gene mã hóa xylanase từ chủng B subtilis CN2 có kích thước 639 bp (trừ ba kết thúc), có độ tương đồng 96% so với đoạn gene xynA mã hóa enzyme xylanase chủng Bacillus sp BP-7 mang số hiệu AJ536759.1 công bố Genbank Biểu thành công gene xynA từ chủng B subtilis CN2 E coli BL21(DE3) sử dụng vector biểu pET22b(+) với chất cảm ứng α-lactose Điều kiện tối ưu biểu xynA với chất cảm ứng α-lactose môi trường TB tốc độ lắc 250 rpm 36 h nuôi cấy 25oC Hoạt độ enzyme tái tổ P P hợp cao sau tối ưu 26 U/ml Tinh enzyme tái tổ hợp phương pháp sắc ký lực kim loại, ion kim loại sử dụng Ni2+ Co2+ Hoạt độ riêng dịch xylanase sau tinh P P P P dùng Ni2+ 226,2 U/mg với số lần tinh 38,3 lần Đạt hiệu cao P P sử dụng Co2+ với hoạt độ riêng 439 U/mg số lần tinh 74,4 lần P P Đặc tính enzyme tái tổ hợp: Nhiệt độ tối ưu 55oC, pH tối ưu 6,0 tính bền P P nhiệt từ 20 đến 40 oC, pH bền dải pH kiềm từ 8,5 đến 10,0 P P Kiến nghị Nghiên cứu sâu đặc tính enzyme tái tổ hợp ảnh hưởng ion kim loại, chất tẩy rửa, dung mơi hữu cơ,… để có ứng dụng phù hợp mơ hình thí nghiệm sản xuất mơ hình thực tế ngành cơng nghiệp sản xuất nhiên liệu sinh học, sản xuất giấy, chất tẩy rửa, Tạo chế phẩm enzyme tinh khiết Đưa chế phẩm ứng dụng thực tế thương mại hoá Dương Thị Lương Liên CH09-11 77 Viện CNSH&CNTP - ĐHBKHN Luận văn thạc sỹ khoa học TÀI LIỆU THAM KHẢO Asano Krisana, Sriprang Ruchadaporn, Gobsuk Jarupan, Eurwilaichitr Lily (2005) Endo-1,4-β-xylanase B from Aspergillus cf niger BCC14405 isolated in Thailand: Purification, Characterization and Gene Isolation, Journal of Biochemistry and Molecular Biology, 38(1), pp 17-23 Ausubel FM, Bren R, Kingtons RE, Moore DD, Seidman JG, Smith JA, Struhl K (1994), Current protocols in molecular biology, John Wiley & Sons, N.Y Bajpai P (1999), Application of enzyme in the pulp and paper industry, Biotechnology Progress, 15, pp 147-157 Biely P, Vrsanská M, Tenkanen M, Kluepfel D (1997), Endo-1,4-xylanase families: differences in catalytic properties, Journal of Biotechnology, 57, pp 151-166 Bissoon S, Christov L and Singh S (2002), Bleach boosting effects of purified xylanase from Thermomyces lanuginosus SSBP on bagasse pulp, Process Biochemistry, 37, pp 567-572 Bradford MM (1976), A rapid and sensitive for the quantitation of microgram quantitites of protein utilizing the principle of protein-dye binding, Analystical Biochemistry, 72, pp 248-254 Charles C.Lee, Rena E Kibblewhite-Accinelli, Michael R Smith, Kurt Wagschal, William J Orts and Dominic WS.Wong (2008), Cloning of Bacillus licheniformis Xylanase Gene and Characterization of Recombinant Enzyme, Current Microbiology, 57(4), pp 301-305 Dawn Elizabeth Stephens (2007), Protein engineering or a fungal xylanase, Department of Biotechnology, Faculty of Applied Sciences, Durban University of Technology, Durban, South Africa Đỗ Thị Tuyên, Đàm Thị Hồng, Quyền Đình Thi (2009), Đánh giá số tính chất hóa lý xylanse chủng nấm Aspergillus niger DSM1957 dịch tinh sơ bộ, Tạp chí Nông nghiệp phát triển nông thôn (6), pp 16-2 10 Edivaldo Ximenes (2007), The role of hydrolase on degradation of plant material, university of brasil, institute of biology science, department of cellular biology laboratory of enzymology Dương Thị Lương Liên CH09-11 78 Viện CNSH&CNTP - ĐHBKHN Luận văn thạc sỹ khoa học 11 Engler MJ and Richardson CC, Boyer Eds PD (1982), The Enzymes, San Diego, Academic Press, 5, pp 12 Gilkes NR, Henrissat B, Kilburn DG, Miller RC Jr, Warren RA J (1991), Domain in microbial β-1,4- glycanases: sequence conservation, function, and enzyme families, Microbiological Reviews, 55, pp 303-315 13 Gosalbes MJ, Pérez-González JA, González R and Navarro A (1991), Two beta-glycanase genes are clustered in Bacillus polymyxa: molecular cloning, expression, and sequence analysis of genes encoding a xylanase and an endobeta-(1,3)-(1,4)-glucanase, Journal of Bacteriology, 173(23), pp 7705-7710 14 Gupta N, Reddy VS, Maiti S, Ghosh A (2000), Cloning, expression and sequence analysis of gene encoding the alkali - stable, thermostable endoxylanse from alkalophilic, mesophilic Bacillus sp Strain NG-27, Applied and Environmental Microbiology, 66, pp 2631-2635 15 Hanahan D (1983), Studies on transformation of E coli with plasmid, Journal of Molecular Biology, 166, pp 557- 580 16 Henrissat B, Bairoch A (1996), Updating the sequence- based classification of glycosyl hydrolases, Journal of Biochemistry, 316, pp 695-696 17 Hiriaki Inoue, Hiroshi Nojima, Hiroto Okayama (1990), High efficiency transformation of Escherichia coli with plamids, Gene.Elsevier., 96, pp 23- 28 18 Hochuli E (1989), Genetically designed affinity chromatography using a novel metal chelate adsorbent, Biol.Act.Mol., pp 217–239 19 Hypertext book for biomedical sciences (2000), Alkaline phosphatase, Biotechnology.http://www.vivo.colostate.edu/hbooks/genetics/biotech/enzymes/ph osphatase.html 20 Jambes (2006), A new enzyme with xylanase activity adapted for pulp and paper industrial processes and agrofood applications Enterprise Europe network, Namur, Belgium 21 Janknecht R, Martynoff G, Lou J, Hipskind RA, Nordheim A, and Stunnenberg HG (1991), Rapid and efficient purification of native histidine-tagged protein expressed by recombinant vaccinia virus, Proceedings of the National Academiy of science of the United States of America, 88, pp 8972–8976 Dương Thị Lương Liên CH09-11 79 Viện CNSH&CNTP - ĐHBKHN Luận văn thạc sỹ khoa học 22 John Altman (2003), Autoinduction of Expression in the T7 Expression System, Emory Vaccine Center, Emory University 23 Leggio LL, Jenkins J, Harris GW and Pickersgill RW (2000), X-ray crystallographic study of xylopentose binding to Pseudomonas fluorescens xylanase A Proteins, Structure, Function and Genetics, 41, pp.362-374 24 Manual of BKL Reagent Set (Blunting Kination Ligation), Takara Bio INC., Japan http://catalog.takara-bio.co.jp/en/PDFFiles/6127_e.pdf 25 Manual of DNA Ligation Kit , Takara Bio INC., Japan http://catalog.takara-bio.co.jp/en/PDFFiles/6023_e.pdf 26 Manual of Primer STAR HS DNA polymerase, Takara Bio INC., Japan http://catalog.takara-bio.co.jp/en/PDFFiles/R010A_e.pdf 27 Manual of CEQ Quick Star Kit, Beckman Coulter http://www.hawaii.edu/microbiology/MO/docs/beckman/CEQShortProtocol.pdf 28 Manual of rAPid Alkaline Phosphatase from Roche Applied Science https://elabdoc.roche.com/LFR_PublicDocs/ras/04898133001_en_02.pdf 29 Meltem AfiAN, Numan ÖZCAN (2007), Expression of the β-(1,3-1,4)Glucanase Gene in Streptococcus salivarius subsp Thermophilus, Turkish Journal of Veterinary and Animal Sciences, 31(5), pp 319-324 30 Mueller PR et al (1993), Current Protocols in Molecular Biology 15.5, Greene Publishing Associates, Inc and John Wiley and Sons, New York 31 Murray N, Bruce S, and Murray K (1979), Molecular Cloning of DNA Ligase Gene from Bacteriophage T4 Journal of Molecular Biology, 132, pp 493 32 Naveen Gupta1, Vanga Shiva Reddy2, Sankar Maiti1, and Amit Ghosh (2000), Cloning, Expression, and Sequence Analysis of the Gene Encoding the AlkaliStable, Thermostable Endo-xylanase from Alkalophilic, Mesophilic Bacillus sp Strain NG-27, Applied and Environmental Microbiology, 66(6), pp 2631-2635 33 Nelson N (1944), A photometric adaptation of the Somogyi method for the determination of glucose, Journal of Biological Chemistry, 153, pp 375 34 Nelson N (1944), A photometric adaptation of the somogyi method for the determination of glucose, Journal of Biological Chemistry, 153 (2), pp.375– 380 35 New England Biolab, K lactis Protein Expression Kit, Catalog Dương Thị Lương Liên CH09-11 80 Viện CNSH&CNTP - ĐHBKHN Luận văn thạc sỹ khoa học 36 Nguyễn Hải Chiều, Trịnh Đình Khá (12 /2008), Nhân dịng đọc trình tự biểu Pichia pastoris DNA xylanase phân lập từ Aspergillus awamoris Tạp chí công nghệ sinh học Châu Phi 37 Nguyễn Thị Uyên Thảo, Đinh Minh Hiệp, Phạm Thị Ánh Hồng (11/2004), Nghiên cứu tận dụng bã khoai mì nhằm thu nhận hệ enzyme cellulase, xylanase, pectinase bổ sung thức ăn gia súc từ vi nấm Trichoderma, Báo cáo khoa học HNKH lần thứ IV (2004), Trường ĐHKHTN, ĐHQG TP.HCM 38 Nguyễn Thị Thu Thủy, Nguyễn Văn Thuật, Đỗ Thị Tuyên, Quyền Đình Thi (2009), “Biểu đánh giá tính chất hóa lý xylanase tái tổ hợp từ chủng A oryzae VTCC – F187 Pichia pastoris GS115”, Báo cáo Hội nghị Sinh học toàn quốc, Nhà xuất Đại học Thái Nguyên, tr 710 – 714 39 Nguyễn Văn Diệp, Đoàn Duy Lộc, Phạm Thành Hổ, Nguyễn Thị Mỹ Lan (2005), Nghiên cứu bước đầu hoạt tính enzyme xylanase từ chủng Aspergillus niger ứng dụng vào trình tẩy bột giấy Đại học Khoa học Tự Nhiên 40 Óscar Gallardo, Pilar Diaz, F.I Javier Pastor (2004), Cloning and characterization of xylanase A from the strain Bacillus sp BP-7: comparision with Alkaline pI- low molecular Weight xylanases of Family 11, Current microbiology, 48, pp 267-279 41 Patent 6423523 (July 23, 2002), Xylanase derived from a Bacillus sp., expression vectors for such xylanase and other proteins, host organisms therefor and use thereof, U.S.A 42 Pérez-Gonzalez JA, DeGraaff LH,Visser J and Ramón D (1996), Molecular Cloning and Expression in Saccharomyces cerevisiae of Two Aspergillus nidulans xylanase Genes, Applied and Environmental Microbiology, 62(6), pp 2179–2182 43 Perrin DD, Boyd Dempsey (1983), Buffers for pH and Metal Ion Control, Chapman & Hall, New York 44 Protein Biochemistry and Biophysics Group, Xylanase 3D structure , Chemistry Department, san Paulo University, Brazin 45 QIAexpressionist (2003), A handbook for high-level expression and purification of 6x His-tagged proteins, fifth Ed., QIAGEN Worldwide Dương Thị Lương Liên CH09-11 81 Viện CNSH&CNTP - ĐHBKHN Luận văn thạc sỹ khoa học 46 Qureshy AF, Khan LA, and Khanna S (2000), Expression of Bacillus circulans Teri-42 xylanase gene in Bacillus subtilis, Enzyme and Microbial Technology, 27, pp 227-233 47 Robert CA Yang, Roger MacKenzie C, Doris Bilous, Verner L Seligy and Saran A Narang (1988), Molecular Cloning and Expression of a Xylanase Gene from Bacillus polymyxa in Escherichia coli, Applied and Environmental Microbiology, 54(4), pp 1023-1029 48 Rychlik W, Rhoads RE (1989 Nov 11) A computer program for choosing optimal oligonucleotides for filter hybridization, sequencing and in vitro amplification of DNA, Nucleic Acids Research, 17(21), pp 8543–8551 49 Sambrook J, Russel DW (2003), Molecular cloning: a laboratory manual- Vol (1, 2, 3) - 3nd Ed., Cold spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y 50 Sapag A, Wouters J, Lambert C, Ioannes P, Eyzaguirre J and Depiereux E (2002), The endoxylanases from family 11: computer analysis of protein sequences reveals important structural and phylogenetic relationships, Journakl of biotechnology, pp 109-131 51 Somogyi M (1945), A new reagent for the determination of sugar, Journal of Biological Chemistry, 160, pp 61 52 Somogyi M (Nov 1926), Notes on sugar determination, Journal of Biological Chemistry, 70 (3), pp 599–612 53 Studier FW, Moffatt BA (1986), Use of bacteriophage T7 RNA polymerase to direct selective high-level expression of cloned genes, Journal of Molecular Biology, 189(1), pp 113-30 54 Suzanne S Nielson (2003), Food Analysis, 3rd Ed., Springer ISBN 0306474956, Plenum Pub Corp, U.S.A 55 Tartoff KD, and Hobbs CA (1987), Improved media for growing plasmid and cosmid clones, Bethseda research laboratories, focus 9, pp 12-14 56 Thomas W Jeffries (1996), Biochemistry and genetics of microbial xylanases Current Opinion in Biotechnology, 7, pp 337-342 57 Tran LH & Nagano H (2002), Isolation ans characterstics of Bacillus subtilis CN2 and its collagenase production, Journal of food science, 67, pp 11841187 Dương Thị Lương Liên CH09-11 82 Viện CNSH&CNTP - ĐHBKHN Luận văn thạc sỹ khoa học 58 Weir BS, (2001), Bioprospecting Environmental Genomes, The University of Auckland 59 Wong KK, Tan LU and Saddler JN (Sept 1988), Multiplicity of beta-1,4xylanase in microorganisms: functions and applications, Microbiology and Molecular Biology Reviews, 52(3), pp.305-317 60 Yang RC, MacKenzie CR, Bilous D and Narang SA (March 1989), Identification of two distinct Bacillus circulans xylanases by molecular cloning of the genes and expression in Escherichia coli, Applied and Environmental Microbiology, 55(3), pp 568-572 61 Yeshitila Degefu, Lars Paulin and Peter Stephensen Lubeck (2001), Cloning, sequencing and expression of a xylanase gene from the maize pathogen Helminthosporium turcicum, European Journal of Plant Pathology, 107, pp 457-465 62 Zhang GM, Huang J, Huang GR, Ma LX, Zhang XE (2007), Molecular cloning and heterologous expression of a new xylanase gene from Plectosphaerella cucumerina, Applied Microbiology and Biotechnology, 74(2), pp 339-346 63 Zofia Olempska-Beer (2004), xylanase form Bacillus subtilis expressed in B subtilis, chemical and technical Dương Thị Lương Liên CH09-11 assessment (CTA), FAO group 83 Viện CNSH&CNTP - ĐHBKHN Luận văn thạc sỹ khoa học PHỤ LỤC Cách pha chế dung dịch cần thiết: P.1 Dung dịch cho xác định hoạt tính xylanase Dung dịch Nelson [37] Chuẩn bị 6g Dissodium Hydrogenearsenate Heptahydrate (Na HAsO ) R R R R 50 ml nước giữ nóng 900 ml nước 80oC Bổ sung 50g Hexaamonium P P Heptamolybdate Tetrahydrate [(NH ) Mo O 24 ], đợi dung dịch giảm xuống 50oC R R R R R R R R P P thêm 42 ml sulfuric acid khuấy Đợi dung dịch giảm xuống 40oC 45oC, P P P P thêm Dissodium hydrogenearsenate heptahydrate (6g/50ml) khuấy Giữ dung dịch 32oC P P Dung dịch Somogyi [52]: Dung dịch Somogyi I: Gia nhiệt 350 ml nước lên đến 80oC, thêm 180g Sodium Sulfate P P Gia nhiệt 350 ml nước, thêm 15g Sodium Tartrate Tetrahydrate, bổ sung 30g Sodium Carbonate, bổ sung 20 g Sodium Hydrogene Carbonate Trộn dung dịch lại với thêm nước lên đến 1000 ml Giữ 32oC P P Dung dịch Somogyi II: Gia nhiệt 300 ml nước lên đến 80oC, thêm 72g Sodium sulfate, thêm 8g P P Cooper II Sulfate Pentahydrate, chỉnh đến thể tích cuối 400 ml Giữ 32oC P Tất dung dịch sử dụng sau ngày Ngay trước sử dụng trộn lẫn dung dịch vào theo tỷ lệ: Somogyi I : Somogyi II = 4:1 P.2 Phần hoá chất cần chuẩn bị cho tách plasmid: Dung dịch I (Sol I): 50 mM Glucose 25 mM Tris-HCl (pH 8,0) 10 mM Na EDTA (pH 8,0) R R Tiệt trùng 121oC, 20 phút, atm P P Dương Thị Lương Liên CH09-11 P Viện CNSH&CNTP - ĐHBKHN Luận văn thạc sỹ khoa học Dung dịch Lysozyme: 10 mg Lysozyme ml Sol I Dung dịch II (Sol II): 880 μl H O + 100 μl SDS10% + 20 μl NaOH 10N R R Chuẩn bị trước sử dụng Dung dịch III (Sol III): 29,4 g CH COOK 3M R R 28,5 ml H O R R Trộn dung dịch vào sau chỉnh lên 100 ml với Acetic acid Dung dịch TE: 10 mM Tris-HCl (pH 8,0) mM Na EDTA (pH 8,0) R R Tiệt trùng 121oC, 20 phút, atm P P Dung dịch TE-RNase: Thêm μl dung dịch RNase (10 mg/ml) ml TE P.3 Chuẩn bị gel polyacrylamide Thành phần: Dung dịch A: 30% Acrylamide 29,2 g Acrylamide (C H NO; mW: 71.08) R R R R 0,8 g N,N'-Methylenebisacrylamide (C H 10 N O ; mW: 154.17) R R R R R R R R Hoà tan nước điều chỉnh đến thể tích 100 ml, giữ 4oC P P Dung dịch B: 1,5M Tris-HCl, pH 8,0 18,17 g Tris-base 0,4 g SDS Chỉnh pH đến 8,0 HCl Hồ tan nước điều chỉnh đến thể tích 100 ml, giữ 4oC P Dung dịch C: 0,5 M Tris-HCl, pH 6,8 6,06 g Tris-base 0,4 g SDS Chỉnh pH đến 8,0 HCl Dương Thị Lương Liên CH09-11 P Viện CNSH&CNTP - ĐHBKHN Luận văn thạc sỹ khoa học Hồ tan nước điều chỉnh đến thể tích 100 ml, giữ 4oC P P Lắc hỗn hợp bổ sung 1/1000 TEMED vào hỗn hợp Running gel Stacking gel trước đổ vào khuôn gel P.4 Đệm sử dụng tinh xylanase tái tổ hợp: Đệm gắn (Lysis buffers) (1 lít) 50 mM NaH PO ……… 6,90 g NaH PO H O (MW=137,99g/mol) R R R R R R R R R R 300 mM NaCl…………… 17,54 g NaCl (MW=58,44g/mol) 10 mM imidazole …………0,68 g imidazole (MW=68,08g/mol) Chỉnh đến pH 7,0 sử dụng NaOH Đệm rửa (Washing buffer ) (1 lít) 50 mM NaH PO ……… 6,90 g NaH PO H O (MW=137,99g/mol) R R R R R R R R R R 300 mM NaCl…………….17,54 g NaCl (MW=58,44g/mol) 20 mM imidazole …………1,36 g imidazole (MW=68,08g/mol) Chỉnh pH 7,0 sử dụng NaOH Đệm rửa giải (Elution buffer) (1 lít) 50 mM NaH PO ……… 6,90 g NaH PO H O (MW 137,99g/mol) R R R R R R R R R R 300 mM NaCl…………… 17,54 g NaCl (MW 58,44g/mol) 250 mM imidazole …………17,00 g imidazole (MW 68,08g/mol) Chỉnh đến pH 7,0 sử dụng NaOH P.5 Môi trường Terrific Broth (TB)1 lít mơi trường: 12 g Bacto Tryptone, 24 g Bacto Yeast Extract, ml Glycerol (5 g) Hoà tan đến thể tích cuối 900 ml Tiệt trùng làm nguội đến 60oC Bổ sung 100 P P ml 10× TB salts, Glucose (nếu yêu cầu) Amp đến nồng độ cuối 100 μg/ml Với 10× TB salts: Tổng thể tích lít gồm: 23,12 g KH PO ; 125,41 g R R R R K HPO Hoà tan thể tích cuối lít tiệt trùng R R R R Với 50 x 5052: 250g Glycerol (0,5% w/v), H O 730ml, 25g Glucose R R (0,05% w/v), 100g Lactose (0,2% w/v) Lọc qua film lọc 0,22μm để loại bỏ vi sinh vật 1000x 1M – MgSO lọc qua film 0,22 μm để loại bỏ vi sinh vật R R Dương Thị Lương Liên CH09-11 Viện CNSH&CNTP - ĐHBKHN Luận văn thạc sỹ khoa học C.1 1XTAE: 20 ml đệm 50X TAE với 1000 ml nước khử ion tạo lít đệm 1X TAE C.2 Dung dịch CI (24:1): 48 ml chloroform trộn với ml isoamyl alcohol C.3 50 X TAE: 250 g Tris base hòa tan vào nước khử ion, Thêm 57,1 ml glacial acetic acid 100 ml 0,5 M EDTA (pH 8,0) Chỉnh đến thể tích 1000 ml C.4 1X TE BUFFER: 10 mM Tris pH 8,0; mM EDTA pH 8,0 C.5 CTAB/ NaCl (10% CTAB in 0,7 M NaCl ): NaCl (4,1g) hòa tan 80 ml nước CTAB thêm từ từ gia nhiệt khuấy đến thể tích cuối 100 ml C.6 (dùng cho đĩa petri): X-gal (20mg/ml) 40μl 10μl IPTG (0,1M) X-gal (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-b-D-galactopyranoside) hoà tan Dimethylformide, IPTG hoà tan nước cất tiệt trùng C.7 Transformation buffer (Tb): 10 mM Pipes 2) 15 mM CaCl2 250 mM KCl 3) 55 mM MnCl2 1), 2), 3) hoà tan với nước, sau chuẩn pH đến 6,7 KOH hồ tan với 4), sau lọc qua màng lọc 0,2 μm (MILIPORETM Filter) Giữ 4oC P P C.8 Mơi trường LB (1 lít): Bacto Tryptone 10g Bacto yeast extract 5g NaCl 10g MiliQ H O R R 1000ml Đối với môi trường đặc: thành phần môi trường tương tự bổ sung thêm 20g Agar (2%) C.9 Môi trường giữ giống PDA Agar 20g Khoai tây 300g Peptone 2g Glucose 20g Khoai tây cạo vỏ thái nhỏ vừa phải cho vào lít nước đun sôi đến nhừ lấy dịch chiết đem pha môi trường đổ ống thạch nghiêng để giữ giống tủ lạnh 4oC P P Dương Thị Lương Liên CH09-11 Viện CNSH&CNTP - ĐHBKHN Luận văn thạc sỹ khoa học C.10 Môi trường LB Bacto-Tryptone 10 g Bacto-yeast extract NaCl 5g 10 g ddH O to Tổng thể tích Điều chỉnh pH 7,0 tiệt trùng lít lít R R C 11 Mơi trường SOB Bacto-tryptone 20 g Bacto-yeast extract 5g NaCl 0,5 g 1M KCl 2,5 ml ddH O 1000 ml Tổng thể tích 1000 ml Điều chỉnh pH 7.0 với 10N NaOH, tiệt trùng, thêm 10 ml ml M MgCl2 tiệt trùng trước sử dụng C.12 Môi trường SOC Bacto-tryptone 20 g Bacto-yeast extract 5g NaCl 0,5 g R R 1M KCl 2,5 ml ddH O 1000 ml Tổng thể tích 1000 ml Điều chỉnh pH 7,0 với 10N NaOH, tiệt trùng, thêm 20 ml M R R glucose tiệt trùng trước sử dụng Dương Thị Lương Liên CH09-11 Viện CNSH&CNTP - ĐHBKHN Luận văn thạc sỹ khoa học Bảng 4.1: Giá trị OD đo tương ứng với nồng độ xylose xylose (mg/l) OD 520 nm 0 10 0,062666333 20 0,163999667 50 0,440999667 100 0,925999667 160 1,527333 200 1,899999667 Hình 4.1: Đường chuẩn xylose Bảng 4.2: Giá trị OD đo tương ứng với nồng độ BSA BSA (mg/l) OD 595 nm 0 10 0,1565 20 0,3795 30 0,594 40 0,819 Hình 4.2: Đường chuẩn Bradford Bảng 4.3: Thành phần Gel 15% cho gel Running gel Stacking gel Dung dịch A ml Dung dịch B 4,5 ml Dung dịch C H2O R R 0,9 ml 1,5 ml 4,5 ml Tổng thể tích ml Dương Thị Lương Liên CH09-11 3,6 ml ml Viện CNSH&CNTP - ĐHBKHN Luận văn thạc sỹ khoa học Bảng 4.4 Đệm sodium phosphate pH, 25 °C x ml 0,2M-Na HPO y ml 0,2M-NaH PO R R R R 5,8 4,0 46,0 6,0 6,15 43,85 6,2 9,25 40,75 6,4 13,25 36,75 6,6 18,75 31,25 6,8 24,5 25,5 7,0 30,5 19,5 7,2 36,0 14,0 7,4 40,5 9,5 7,6 43,5 6,5 7,8 45,75 4,25 8,0 47,35 2,65 R R x ml 0,2M-Na HPO , y ml 0,2M-NaH PO ;pha đến 100 ml với H O R R R R R R R R R R Na HPO , • H O, M= 178,05; dung dịch 0,2M chứa 35,61 g/l R R R R R R Na HPO , • 12 H O, M=358,22; dung dịch 0,2M chứa 71,64 g/l R R R R R R NaH PO • H O, M M=138,01; dung dịch 0,2M chứa 27,6 g/l R R R R R R NaH PO • H O, M= 156,03; dung dịch 0,2M chứa 31,21 g/l R R R R R R Bảng 4.5: Đệm sử dụng để xác định độ bền pH pH X pH x pH x 2,0 195 5,5 126 9,0 69 2,5 184 6,0 118 9,5 60 3,0 176 6,5 109 10,0 54 3,5 166 7,0 99 10,5 49 4,0 155 7,5 92 11,0 44 4,5 144 8,0 85 11,5 33 5,0 134 8,5 78 12,0 17 Trong hỗn hợp (0,2 M Boric acid, 0,05 M citric acid) x ml; 0,1 M Na PO 12H O (200-x) ml R R R R R R Dương Thị Lương Liên CH09-11 ... nghiên cứu đặc tính xylanase tái tổ hợp? ?? với nội dung sau: Tách dòng gene xynA từ B subtilis CN2 Giải trình tự gene xynA từ B subtilis CN2 Biểu gene xynA từ B subtilis CN2 lên E coli BL21 (DE3)... tách dòng biểu gene Escherichia coli (sử dụng vector pUC19 chuyển gene vào E coli) [60] Tách dòng biểu gene xylanase từ Bacillus polymyxa lên E coli [13,47] Xylanase từ Bacillus, Vector biểu. .. cứu đặc tính enzyme tái tổ hơp vật chủ Escherichia coli [7] Cấu trúc biểu gene mã hóa enzyme phân hủy xylan Bacillus pumilus (gene β-xylosidase (xynB), (xynA) ) lên B subtilis E coli Biểu gene